Synthesis of aspartic proteases probes and their application for interaction identification and binding hotspots mapping

Abstract

Aspartic proteases play a crucial role in human physiology and pathologyincluding as biomarkers for breast cancer and Alzheimer's disease, and as potential drug targets for infectious diseases. However, chemical probes for photoaffinity labeling (PAL) of these proteases are underdeveloped. We develop a full on-resin synthesis of clickable PAL probes based on the natural product inhibitor pepstatin, incorporating a minimal diazirine photo-reactive group. The positioning of this group in the inhibitor determines the labeling efficiency. Effective probes sensitively detect cathepsin D, a biomarker for breast cancer, in cell lysates. Through chemical proteomics experiments and deep learning algorithms, we also identify sequestosome-1 as a direct interaction partner and substrate of cathepsin D. PAL combined with tandem mass spectrometry (MSn) can reveal interactions between small molecule drugs and protein in biological environments. However, the direct detection of the ‘hotspots’ of the photo-crosslinking sites by MSn is challenging because of the unexpected fragmentation of small molecule drugs, especially when these are small peptides. We synthesize and introduce sulfoxide diazirine (SODA) building blocks to peptide-like probes for PAL. Those MS-cleavable probes enable a MS2 cleavage event that generates a probe-derived reporter ion and a minimal fragment on the modified peptide. Following a subsequent MS3 fragmentation event, we show that this strategy allows for unbiased identification of modification sites and mapping of binding hotspots of peptide-like bio-active molecules. Overall, our study presents the synthesis of aspartic proteases probes and their application for interaction identification and binding hotspots mapping. However, further improvement is required for this study to achieve broader application. We propose a number of possible follow-up experiments and discuss future prospects in chapter 6.

Aspartatproteasen spielen eine entscheidende Rolle in der menschlichen Physiologie und Pathologie, unter anderem als Biomarker für Brustkrebs und Alzheimer, sowie als potenzielle Wirkstoffziele für Infektionskrankheiten. Allerdings ist die Toolbox chemischer Sonden für die Photoaffinitätsmarkierung (PAL) dieser Proteasen nur unzureichend entwickelt. Wir entwickeln eine vollständige On-Resin-Synthese für klickbare PAL-Sonden auf der Basis des Naturstoff-Inhibitors Pepstatin, die eine minimale Diazirin-Reaktivgruppe tragen. Es wurde gezeigt, dass die Platzierung der Gruppe im Inhibitor die Markierungseffizienz bestimmt und, dass diese Sonden den sensitiven Nachweis von Cathepsin D, einem Biomarker für Brustkrebs, in Zelllysaten erlauben. Dafür wurde eine Serie von Experimenten in Verbindung mit Deep-Learning-Algorithmen-gestützter Datenauswertung durchhgeführt, wobei Sequestrosom-1 als direkter Interaktionspartner und Substrat von Cathepsin D identifiziert wurde. Somit wurde gezeigt, dass PAL in Kombination mit Tandem-Massenspektrometrie (MSn) eingesetzt werden kann, um Interaktionen zwischen kleinen Moleküldrogen und Proteinen in biologischen Umgebungen aufzudecken. Die direkte Detektion der "Hotspots" der Photo-Crosslink-Stellen durch MSn ist jedoch aufgrund der komplexen und nicht vorhersehbaren Fragmentierung von kleinen Moleküldrogen, insbesondere bei kleinen Peptiden, weiterhin eine Herausforderung. Wir synthetisieren und führen Sulfoxid-Diazirin (SODA) Bausteine in Peptid-ähnliche Sonden für PAL ein. Dabei entsteht eine MS-labile Gruppe, die im MS2 zu einem ein Reporterion und ein modifiziertes Peptidion führt. Durch eine anschließende MS3 Fragmentierung zeigen wir, dass diese Strategie eine Identifizierung von Modifikationsstellen und die Kartierung von Bindungshotspots von Peptid-ähnlichen bioaktiven Molekülen ermöglicht. Zusammenfassend, zeigt die Arbeit, die erfolgreiche Synthese von Aspartatprotease-Sonden und deren Anwendung zur Identifikation von Interaktionspartnern einschließlich der exakten Interaktionsstelle. Allerdings sind weitere Optimierungen erforderlich, um eine breitere Anwendung zu ermöglichen. Wir schlagen eine Reihe möglicher Folgeexperimente vor und diskutieren zukünftige Perspektiven in Kapitel 6.