Stereoselektive Synthese von α,β-ungesättigten δ-Laktonen an der festen Phase und Protein-Modifikation durch Palladium-Katalyse Zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften vom Fachbereich Chemie der Universität Dortmund angenommene DISSERTATION von Diplom-Chemiker Torben Leßmann aus Hamburg 1. Gutachter: Prof. Dr. H. Waldmann 2. Gutachter: Prof. Dr. N. Krause Tag der mündlichen Prüfung: 26. Januar 2007 II Die vorliegende Arbeit wurde unter Betreuung von Prof. Dr. Herbert Waldmann am Max-Planck-Institut für Molekulare Physiologie und an der Universität Dortmund in der Zeit von Dezember 2002 bis Dezember 2006 angefertigt. III IV Inhaltsverzeichnis 1 Allgemeiner Teil ........................................................................................... 1 1.1 Einleitung................................................................................................ 1 1.2 Naturstoff-abgeleitete Bibliotheken......................................................... 2 1.2.1.1 Diversifizierungsstrategien für naturstoffabgeleitete Bibliotheken................................................................................................ 5 1.3 α,β-Ungesättigte δ-Laktone – Wirkungen und Synthesen....................... 6 1.3.1 Fostriecin......................................................................................... 7 1.3.2 Leptomycin B................................................................................... 9 1.3.3 Pironetin ........................................................................................ 10 1.3.4 Goniothalamin ............................................................................... 12 1.4 Asymmetrische Synthese an der festen Phase .................................... 13 1.4.1.1 Aldol-Reaktionen .................................................................... 15 1.4.1.2 Allylierungen........................................................................... 15 1.4.1.3 Cycloadditionen...................................................................... 16 1.5 Chemische Modifizierung von Peptiden und Proteinen ........................ 18 1.5.1 Ligationsmethoden ........................................................................ 19 1.5.2 Übergangsmetall-vermittelte Reaktionen an Peptiden und Proteinen 20 1.5.2.1 Modifizierung natürlicher Aminosäuren .................................. 20 1.5.2.2 1,3-Cycloadditionen................................................................ 21 1.5.2.3 Kreuzkupplungsreaktionen an Peptiden................................. 21 2 Ziel der Arbeit............................................................................................. 25 3 Spezieller Teil............................................................................................. 27 3.1 Synthese von α,β-ungesättigten δ-Laktonen an der festen Phase ....... 27 3.1.1 Übersicht ....................................................................................... 27 3.1.2 Route I: Enantioselektive Allylierung an der festen Phase mit anschließender Ringschlussmetathese ....................................................... 28 3.1.2.1 Retrosynthese und Syntheseplan........................................... 28 3.1.2.2 Vorarbeiten: Enantioselektive Allylierung an fester Phase ..... 29 Inhaltsverzeichnis 3.1.2.3 Wahl des Linkers für die Synthese an der feste Phase...........32 3.1.2.4 Synthese immobilisierter Aldehyde .........................................33 3.1.2.5 Enantioselektive Allylierung ....................................................34 3.1.2.6 Variation der Abspaltungsbedingungen ..................................36 3.1.2.7 Entwicklung der Ringschlussmetathese..................................36 3.1.2.8 Bestimmung des Enantiomerenüberschusses in Lakton 93....40 3.1.2.9 Mehrfache Allylierung, Schutzgruppen ...................................41 3.1.2.10 Acetat als Schutzgruppe .........................................................44 3.1.2.11 Höhere Homologe...................................................................45 3.1.2.12 Asymmetrische Allylierung und RCM in der Synthese von Naturstoffen ..............................................................................................47 3.1.2.13 Euscapholid ............................................................................48 3.1.2.14 Synthese einer Cryptocarya Diacetat-Bibliohtek .....................49 3.1.2.15 Synthese des Ravensara-Laktons ..........................................53 3.1.2.15.1 Synthese der Edukte (S)-137 und (R)-137.........................53 3.1.2.15.2 Durchführung der Synthese ...............................................57 3.1.2.16 Biologische Evaluierung..........................................................61 3.1.2.16.1 Phosphatase-Assays .........................................................61 3.1.2.16.2 Tubulin-Polymerisation ......................................................62 3.1.2.17 Diskussion...............................................................................62 3.1.3 Route II: Hetero-Diels-Alder Reaktionen an der festen Phase .......65 3.1.3.1 Einleitung ................................................................................65 3.1.3.2 Untersuchung der hetero-Diels-Alder-Reaktion ......................68 3.1.3.2.1 Synthese der immobilisierten Diene ....................................68 3.1.3.3 Versuche mit Titan-BINOL-Katalysatoren ...............................69 3.1.3.3.1 Variation des Lösungsmittels ...............................................71 3.1.3.4 Variation des Katalysators ......................................................72 3.1.3.4.1 Hydrierung des Liganden.....................................................72 3.1.3.4.2 Kupfer-basierte Katalysatoren .............................................73 3.1.3.5 Variation des Aldehyds ...........................................................76 3.1.3.6 Weitere Schritte ......................................................................77 3.1.3.7 Versuche von Aldol-Reaktionen am immobilisierten Aldehyd 166..............................................................................................79 3.1.3.8 Diskussion...............................................................................81 VI Inhaltsverzeichnis 3.2 Sonogashira-Kupplungen an Peptiden und Proteinen.......................... 83 3.2.1 Einleitung....................................................................................... 83 3.2.2 Sonogashira-Reaktionen an Peptiden ........................................... 86 3.2.2.1 Synthese und Anwendung von Modellpeptiden...................... 86 3.2.2.2 Synthese von Desthiobiotin-markierten Acetylenen ............... 88 3.2.2.3 Sonogashira-Reaktionen an Peptiden in wässriger Lösung ... 90 3.2.2.3.1 Testreaktionen am Peptid 192 ............................................ 90 3.2.2.3.2 Kupplung am Peptid 188..................................................... 92 3.2.3 Sonogashira-Reaktionen an Proteinen.......................................... 93 3.2.3.1 Versuche an einem modifizierten Rab-Protein ....................... 93 3.2.3.2 Versuche am 181N-Ras-Protein............................................... 98 3.2.3.2.1 Ligation eines Desthiobiotin-markierten MIC-Peptids an N- Ras 98 3.2.3.2.2 Sonogashira-Reaktionen am 1-181N-Ras-Protein ................101 3.2.3.2.3 Untersuchungen mittels LA-ICP-MS ..................................105 3.2.4 Diskussion ....................................................................................108 4 Zusammenfassung ...................................................................................111 5 Experimenteller Teil..................................................................................119 5.1 Allgemeines, Messgeräte, Hilfsmittel ...................................................119 5.2 Methoden zur Beladungsbestimmung an der Festphase.....................123 5.3 Versuche zu Kapitel 3.1.2....................................................................125 5.4 Versuche zu Kapitel 3.1.3....................................................................166 5.5 Versuche zu Kapitel 3.2.......................................................................179 6 Literaturverzeichnis..................................................................................193 7 Anhang ......................................................................................................201 VII Inhaltsverzeichnis VIII Abkürzungsverzeichnis abs. absolut (wasser- und sauerstofffrei) Äq. Äquivalent ber. berechnet BINOL 2,2'-Binaphthyldiiol CSA Kampfersulfonsäure DBU 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en DCM Dichlormethan DDQ 2,3-Dichlor-5,6-dicyanohydrochinon DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DIBAL-H Diibutylaluminiumhydrid DIC Diisopropylcarbodiimid DIPEA Diisopropylethylamin DMAP N, N-Dimethylaminopyridin DMF Dimethylformamid DMSO Dimethylsulfoxid DNPH 2,4-Dinitrophenylhydrazin EDC 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl-)carbodiimid EDT Ethandithiol EE Ethylacetat ee enantiomeric excess, Enantiomerenüberschuss ESI electron spray ionization FAB fast atom bombardment Fmoc 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl FT-IR Fourier-Transformation Infrarotspektroskopie GC Gaschromatographie GC-MS Gaschromatographie mit gekoppelter Massendetektion gCOSY gradient enhanced Correlation Spectroscopy gef. gefunden ges. gesättigt gHMBC gradient enhanced Heteronuclear Multiple Bond Correlation gHSQC gradient enhanced Heteronuclear Single Quantum Correlation h Stunde HBTU 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3- tetramethyluroniumhexafluorophosphat HMPA Hexamethylphosphorsäuretriamid HOBt 1-Hydroxybenzotriazol HOSu N-Hydroxysuccinimid HPLC high performance liquid chromatography HR-MS high resolution mass spectrometry IBX O-Iodoxybenzoic acid ICP-MS laser ablation inductively coupled mass spectrometry Ipc2BAll Diisopinocampheylallylboran KG Kieselgel LC liquid phase chromatography MALDI-TOF matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight Me Methyl MeOH Methanol MIC Maleinimidocaproyl min Minute n-BuLi n-Butyllithium NHC N-heterocyclic carbene PE Petrolether PPTS Pyridyl-para-toluylsulfonat Rf Retentionsfaktor Schmp. Schmelzpunkt SDS-PAGE Natriumdodecylsulfat Polyacrylamidgelelektrophorese TBAF Tetrabutylammoniumfluorid TBS tert.-Butyldimethylsilyl TES Triethylsilan TFA Trifluoressigsäure THF Tetrahydrofuran TPAP Tetrapropylammoniumperruthenat TPPTS Triphenylphosphintrisulfonsäure tR Retentionszeit X 1 Allgemeiner Teil 1.1 Einleitung Wurde die Organische Chemie durch die Synthese des „biologischen“ Moleküls Harnstoff begründet, und hat sie durch Strukturaufklärung und Synthese physiologisch aktiver Moleküle wie Vitaminen oder Hormonen erheblich zum grundlegenden Verständnis biologischer Prozesse beigetragen, so wurde ihr Gewicht in der Erforschung dieser Prozesse in den letzten Dekaden deutlich geringer. Die Untersuchung biologischer Phänomene – Replikation, Selbstorganisation, Metabolismus, Transport, Signaltransduktion – wurde vor allem mit molekularbiologischen und genetischen Methoden vorangetrieben. Mit dem methodologischen Auseinanderdriften von Chemie und Biologie schwand der Einfluss der Synthesechemie in den Biowissenschaften. An dieser Grenze zwischen Chemie und Biologie hat sich in der letzten Dekade die Chemische Biologie etabliert, deren breites Themenspektrum sich in einige Hauptgebiete unterteilen lässt: • Modifikationen an Proteinen (und anderen natürlichen Makromolekülen), die nicht oder nur schwer durch molekularbiologische Techniken zugänglich sind. • Auffinden, Synthese und Untersuchen von Liganden für Proteine, um Aufschlüsse über die Funktion des Proteins im physiologischen Kontext zu erhalten. So lässt sich z.B. die vollständige Inhibition eines Enzyms durch einen Liganden vergleichen mit dem genetischen „knockout“ des Gens, welches das Enzym kodiert. Dieses Gebiet wurde zum Konzept der „Chemischen Genetik“ weiterentwickelt. Die Erforschung von Protein- Ligand-Interaktionen ist aber weitaus umfangreicher. • Synthese und Untersuchung von Peptiden mit intrinsischer biologischer Aktivität oder als Protein-Fragmente. Synthetische Peptide können einerseits Proteinabschnitte nachahmen und folglich die Komplexität des untersuchten Systems reduzieren. Ein zweiter Vorteil ist die Möglichkeit, unnatürliche Funktionalitäten (z.B. β-Aminosäuresequenzen, Fluorophore, Allgemeiner Teil Spin-Label) einzuführen, um zusätzliche Parameter zur Analyse zu erhalten. • Synthese artifizieller Makrosysteme, z.B. funktionalisierter Polymere, zur Untersuchung multivalenter Interaktionen. All diesen Gebieten liegt die chemische Synthese zugrunde, welche die gewünschten Sonden zur Untersuchung physiologischer Prozesse zugänglich macht. Damit nimmt die Chemie – speziell die Organische Chemie – in der Chemischen Biologie eine zentrale Rolle ein, und die Anpassung der klassischen Synthese an die Bedürfnisse der Chemischen Biologie ist eine Herausforderung für den Chemiker. In dieser Arbeit werden zwei Aspekte dieser Herausforderung vorgestellt: Die Entwicklung von Methoden zur Synthese Naturstoff-abgeleiteter Verbindungen und die Einführung nicht-natürlicher Funktionalitäten in Proteinen. 1.2 Naturstoff-abgeleitete Bibliotheken Natürliche Quellen haben eine lange Tradition in der Gewinnung pharmakologisch aktiver Substanzen. Diese Tradition lässt sich bis heute in den Strukturen der bekannten Arzneimittel ablesen: knapp die Hälfte der auf dem Markt erhältlichen Medikamente sind Naturstoffe oder von ihnen abgeleitete Substanzen.[1] Drei Beispiele für Naturstoffe, die in ihrer isolierten Form potente Arzneimittel darstellen, sind in Abb. 1 dargestellt: • Lovastatin 1 ist ein natürlicher Inhibitor des Enzyms 3-Hydroxy-3- methylglutaryl-CoA Reduktase, einem entscheidenden Enzym im Mevalonat-Weg, der zur Biosynthese von Cholesterin notwendig ist. • Taxol 2 verhindert die Depolymerisation von Mikrotubuli und wird in der Krebsmedizin eingesetzt. • Artemisin 3 ist ein Naturstoff, der gegen falciparum malaria, einen Malaria-Erreger, eingesetzt wird. 2 Allgemeiner Teil O O OH O O O O O O O H H HO O O O OH NHO O O OH HO O O H O 1 2 3 Lovastatin Taxol Artemisin Abb. 1: Naturstoffe als Arzneimittel. Mit dem Aufkommen neuer Techniken zum Hochdurchsatz-Screening großer Verbindungssammlungen gerieten Naturstoffe als Quelle pharmazeutischer Substanzen in den Hintergrund. Neue Methoden in der kombinatorischen Chemie, die einen größeren Ausstoß an Verbindungen versprachen als die Isolierung von Naturstoffen oder die klassische organische Synthese, gewannen an Relevanz. Damit änderten sich auch strukturelle Charakteristika der Substanzbibliotheken: einfacher synthetischer Zugang und modularer Aufbau ersetzten die Naturstoff-geleitete Synthese. Jedoch wurden die Hoffnungen, die in die Synthese großer Substanz- bibliotheken gesetzt wurden, nicht erfüllt. Trotz zunehmender technologischer Investitionen wurden nicht mehr aktive Verbindungen entdeckt als vorher.[2] Dies führte in den vergangenen Jahren zu einem kritischen Vergleich von Naturstoffen und auf kombinatorischem Weg erhaltenen Substanzen. In mehreren bioinformatischen Studien wurden Naturstoff-Sammlungen mit kombinatorischen Bibliotheken oder bekannten Arzneimitteln verglichen.[3] Danach unterscheiden sich Naturstoffe und kombinatorische Bibliotheken in einigen signifikanten Parametern. Markant ist z.B. die Art und Anzahl von Hetero- atomen: Während in Naturstoffen der relative Anteil an Sauerstoff höher ist, haben kombinatorische Bibliotheken einen höheren Anteil an Stickstoff-, Schwefel- und Halogenatomen. Darüber hinaus besitzen Naturstoffe im Mittel weniger frei rotierbare Bindungen als Moleküle aus kombinatorischen Biblio- theken (4.4 gegenüber 6.4), dafür aber mehr stereogene Zentren (6.2 gegenüber 0.4). Diese zwei Parameter erlauben den Schluss, dass die stereochemische Komplexität in Naturstoffen größer ist als in den bekannten kombinatorischen Bibliotheken. 3 Allgemeiner Teil Mit diesen aus statistischen Methoden gewonnenen Erkenntnissen kann der Unterschied zwischen Naturstoffen und synthetischen Molekülen über ihre Herkunft hinaus verdeutlicht und auf eine Struktur-abhängige Basis gestellt werden. Naturstoffe besetzen andere Plätze im (fast unendlich großen) chemischen Strukturraum als Substanzen aus kombinatorischen Bibliotheken. Damit stellt sich die Frage, ob Naturstoffe und von ihnen abgeleitete Verbindungen a priori „bessere“ Verbindungsbibliotheken (also solcher mit erhöhter Aktivität in biologischen Screens) ergäben. Diese Frage wurde von Waldmann et al. mit einer anderen Herangehensweise erörtert: Nach eingehender Analyse sowohl von Proteinen (den Zielen von Wirkstoffen) als auch von Naturstoffen stellten Waldmann et al. die folgenden zwei Thesen an den Anfang der Suche nach neuen Verbindungen mit biologischer Aktivität: (1) Die Anzahl der in der Natur vorkommenden Protein-Domänen ist begrenzt.[4] Während es auf der Ebene der Primärstruktur (Aminosäure-Sequenz) große Variationen zwischen den verschiedenen Proteinen gibt, sind die durch Faltung ausgebildeten Tertiärstrukturen evolutionär konserviert. Bisher sind etwa 600 Faltungstypen charakterisiert.[5] Waldmann et al. postulieren nun, dass die Liganden-erkennenden Kernbereiche in den Domänen ebenfalls konserviert sind. Das bedeutet, dass ein Ligand bzw. eine Ligandenklasse, die an einen solchen konservierten Kernbereich in einer Domäne eines Proteins bindet, auch an die entsprechende Stelle einer Domäne gleicher Faltung eines anderen Proteins bindet. Somit lassen sich durch das Auffinden verwandter Tertiärstrukturen in Proteinen (Protein Structure Similarity Clustering, PSSC) Rückschlüsse darauf ziehen, welche Art von Liganden als mögliche Inhibitoren in Frage kommen. Da Naturstoffe für die Interaktion mit mindestens einer Domäne evolutionär selektiert wurden, können sie als prä- validierte Ausgangspunkte in der Suche nach biologisch aktiven Substanzen angesehen werden. (2) Die Anzahl der in Naturstoffen vorkommenden (zyklischen) Grundgerüste ist begrenzt. Eine statistische Analyse der bekannten Naturstoffe (structural clustering of natural products, SCONP) zeigte, dass sich viele der in der Natur vorkommenden Strukturen auf eine begrenzte Zahl von zyklischen Grundgerüsten zurückführen lassen.[6;7] Besonders häufig auftretende 4 Allgemeiner Teil Strukturen werden als viel versprechende Ausgangspunkte für die Synthese von Substanzbibliotheken angesehen. OH O 4OH O H O OH 5 Dysidiolid Abb. 2: Die vom Naturstoff Dysidiolid 4 ableitete Verbindung 5 ist ein Inhibitor des Enzyms 11βHSD1. Ein Beispiel für die erfolgreiche Anwendung dieser Theorie auf der Suche nach neuen Verbindungen mit biologischer Aktivität wurde aus der Arbeitsgruppe Waldmann berichtet. Ausgehend vom Naturstoff Dysidiolid 4 (Abb. 2), einem bekannten Phosphatase-Inhibitor, wurde eine Bibliothek auf der Basis eines Dehydro-Decalin-Gerüstes synthetisiert. Die Verbindung 5 aus dieser Bibliothek erwies sich als Inhibitor des Enzyms 11βHSD1 mit einem IC50-Wert von 0.31 μM.[6] 1.2.1.1 Diversifizierungsstrategien für naturstoffabgeleitete Bibliotheken In der Kombinatorischen Chemie wird durch Variation von Edukten eine möglichst große Anzahl an Produkten angestrebt. In vielen Fällen geschieht dies durch Austausch von Substituenten an einem unveränderten Grundgerüst.[8] Eine zweite, viel seltener zu findende Herangehensweise beruht auf der systematischen Variation aller in einer Verbindung enthaltenen Stereozentren. Ein frühes Beispiel für die Synthese einer solchen stereochemisch diversen Bibliothek berichteten Sharpless et al.[9] (Abb. 3): Dabei wurden asymmetrische Epoxidierungen eingesetzt, um alle diastereomeren L-Hexosen zu synthetisieren. 5 Allgemeiner Teil PO OH PO OH O 4 Stufen ∗ O O CHOPOSharpless-Epoxidierung 2 Stufen ∗ O O PO CH2OH ∗ O O ∗ PO ∗ CH2OHO Sharpless- Epoxidierung (+) und (-)-DET epimerisierbar 4 Stufen PO ∗ ∗ ∗ CHO O O O O A17.cdx Abb. 3: Syntheseschema nach Sharpless et al. zur stereoselektiven Synthese aller Hexosen. Tietze et al. nutzen verschiedene Enantiomere der von Noyori entwickelten Transferhydrierungskatalysatoren, um alle Diastereomere des Naturstoffes Emetin 6 zu synthetisieren (Abb. 4).[10] ∗ N ∗ ∗ ∗ HN OMe MeO MeO MeO 6 ∗ ∗ ∗ ∗ O O 7 Emetin Abb. 4: Grundstrukturen der Naturstoffe, die Ausgangspunkt für die Synthese von Stereoisomer-Bibliotheken waren. Schließlich gelang es Curran et al., alle Diastereomere des Wespenpheromons 7 (Abb. 4) zu synthetisieren.[11] Dabei wurden diastereomere Edukte vor der Parallelsynthese mit unterschiedlich fluorierten Schutzgruppen versehen, die später durch chromatographische Aufreinigung getrennt werden konnten. Dieselbe Technik wurde auch in der Synthese aller Diastereomere des Naturstoffes Passifloricin eingesetzt.[12] 1.3 α,β-Ungesättigte δ-Laktone – Wirkungen und Synthesen In der vorliegenden Arbeit wurden Moleküle untersucht, die ein in Naturstoffen häufig zu findendes Strukturelement tragen, dabei handelt es sich um eine α,β- ungesättigte δ-Lakton-Einheit. Die Naturstoffe, die eine α,β-ungesättigte δ-Lakton-Einheit tragen, bilden eine kleine Gruppe mit teilweise bekannten und interessanten biologischen 6 Allgemeiner Teil Wirkungsprofilen. Das „Dictionary of Natural Products“ enthält 213 Einträge, die das α-Pyron-Gerüst als Strukturelement enthalten.[13] Von diesen Verbindungen besitzen 65 eine dokumentierte biologische Aktivität. Die charakteristische Laktoneinheit kann als Michael-Akzeptor fungieren, der von nukleophilen Seitenketten von Aminosäuren (z.B. von Cystein) angegriffen werden kann. Aus diesem Grund wird für viele Verbindungen dieses Typs die biologische Aktivität auf eine kovalente Wechselwirkung mit dem Zielmolekül zurückgeführt. Die Selektivität der Verbindungen für bestimmte Proteine – in einer Zelle gibt es viele freie Nukleophile, die eine konjugierte Addition eingehen können – könnte durch die Struktur der Seitenkette bestimmt sein. Hier werden in der Tat große Variationen gefunden. Einige Beispiele für biologisch aktive Moleküle dieser Klasse sind in Abb. 5 gezeigt. Anhand dieser Beispiele soll exemplarisch die Vielfalt und die Relevanz der biologischen Aktivitäten dieser Verbindungen diskutiert werden. O O O O OH NaHPO4 OH OH O HO O O OH O O O COOH 8 10 11 9 Fostriecin Pironetin Goniothalamin Leptomycin B Abb. 5: Naturstoffe mit α,β-ungesättigter δ-Lakton-Einheit. 1.3.1 Fostriecin Eine der am besten untersuchten Verbindungen dieser Klasse ist Fostriecin 8, das aus Streptomyces pulveraceus isoliert wurde.[14] Die relative und absolute Konfiguration wurde durch Boger et al. bestimmt und durch eine Totalsynthese bestätigt.[15] Fostriecin inhibiert Topoisomerase II und ist darüber hinaus ein hochselektiver Inhibitor der Serin/Threonin-Phosphatase PP2A.[16] Diese Eigenschaften ließen 7 Allgemeiner Teil den Naturstoff in den Fokus der medizinischen Forschung rücken. In einer klinischen Studie stellte sich aber heraus, dass Fostriecin nur eine sehr kurze Halbwertszeit im Plasma hat (< 2 h) und vermutlich schnell dephosphoryliert wird.[17] Angesichts dieser Rückschläge wurde die Anwendung des Naturstoffes in der Klinik ausschlossen. In weiteren Untersuchungen zum Wirkungs- mechanismus von Fostriecin wurde die PP2A-Inhibition eingehend untersucht, indem verschiedene Derivate des Naturstoffes synthetisiert wurden.[18;19] Die Entfernung des Phosphats aus dem Molekül führte zu einer 1000fach schwächeren Aktivität, was für eine Substrat-Nachahmung durch Fostriecin spricht.[18] Weiterhin konnte gezeigt werden, dass das gesättigte Lakton eine zehnfach geringere Aktivität gegenüber PP2A aufweist. Dies lässt auf eine Beteiligung des Laktons als Michael-Akzeptor schließen. Ein strukturell sehr ähnliches Molekül, Phoslactomycin 12 (Abb. 6), konnte mit einem Biotin Anker versehen werden. Mittels Affinitätschromatographie konnte PP2A als zelluläres Zielmolekül bestimmt werden. Cystein269 von PP2A ging eine kovalente Bindung mit dem Naturstoff ein, was den angenommenen Mechanismus der Inhibition stützt.[20] O O OH NaHPO4 OH OH N H H N O O S NHHN O H H 12 Abb. 6: Struktur eines biotinylierten Phoslactomycin-Derivats für die Affinitätschromatographie. Die biologische Aktivität dieser Verbindung machten Fostriecin zum Ziel mehrerer Totalsyntheseprojekte. Kurz nach der von Boger veröffentlichten Synthese berichteten Jacobsen et al. von einer hochkonvergenten Synthese dieses Naturstoffes (Schema 1).[21] Die Bausteine 13 und 14 wurden jeweils durch enantioselektive Katalyse in über 99 %ee erhalten und in einer Chelat- kontrollierten Vinylmetallat-Addition miteinander gekuppelt. Das terminale Epoxid in 15 wurde mit einem alkinyliertem Dithian geöffnet, welches ins Keton 16 überführt wurde. Durch eine hochselektive Noyori-Transferhydrierung konnte das Zwischenprodukt 17 erhalten werden, in dem alle stereogenen Zentren des Zielmoleküls in der gewünschten Konfiguration vorlagen. Nach Transformation 8 Allgemeiner Teil des Alkins in ein Vinyliodid, Stille-Kupplung mit dem geeigneten Stannan und einigen Schutzgruppenoperationen wurde Fostriecin 8 in 17 Stufen erhalten. O O H 13 > 99 %ee aus hetero- Diels-Alder- Reaktion O O + 14 > 99 %ee aus kinetischer Racematspaltung O O OTES O S S Li TMS O O OTES OH O TMS O O OTES OH OH TMS 16 17 93 % dr 95 : 5 Ru Ts N N H Ph Ph 7 Stufen 8 1) 13, [Cp2Zr(H)Cl], 2) Me2Zn 3) 14 4)TESCl 15 2)Thioketal-Entsch. 45 % dr > 30 : 1 Schema 1: Totalsynthese von Fostriecin nach Jacobsen et al. Mehrere andere Gruppen berichteten ebenfalls eine Totalsynthese von Fostriecin, darunter Falck et al.,[22] Trost et al.[23] und Shibasaki et al.[19] Die jeweiligen Schlüsselschritte zum Aufbau der Stereozentren sind in Abb. 7 gezeigt. O O OH NaHPO4 OH OH Sharpless AD (Boger) Ipc2BAll (Falck, Trost) Yamamoto Allylierung (Shibasaki) Diastereoselektive Add. (Boger, Trost) Sharpless AD (Falck) Asymm. Cyanosilylierung (Shibasaki) D-Glu (Boger) Aldol (Trost, Shibasaki) Sharpless AD (Falck) Sharpless AD (Boger) Noyori-Transferhydr. (Trost, Shibasaki) Ipc2BAll (Falck) Abb. 7: Aufbau der Stereozentren von Fostriecin in verschiedenen Totalsynthesen. 1.3.2 Leptomycin B Für Leptomycin B 9 (auch „Elactocin“), isoliert aus einem Streptomyces-Stamm, konnte ebenfalls ein zelluläres Zielmolekül identifiziert werden.[24] Dabei handelt es sich um das Protein Crm1 (chromosome maintenance region 1), auch 9 Allgemeiner Teil Exportin 1 genannt. Exportin 1 erkennt ein Kern-Export-Signal (nuclear export signal, NLS) an Proteinen und sorgt für deren Transport aus dem Zellkern ins Cytoplasma. Über diesen Transportweg gelangt auch teilprozessierte mRNA des HIV-Virus ins Cytoplasma, so dass eine Inhibition des Exports die Replikation des Virus verhindern könnte. Darüber hinaus akkumulieren mit Leptomycin B versetzte Zellen das Tumorsuppressor Protein p53 im Zellkern, eines der wichtigsten Abwehrproteine gegen Krebs. Leptomycin B geriet von daher ins Blickfeld der medizinischen Forschung. Es stellte sich heraus, dass Crm1 über ein Cystein-Thiol eine kovalente Bindung mit Leptomycin B eingehen kann. Wird das Cystein529 in Crm1 gegen ein Serin ausgetauscht oder das ungesättigte Lakton in 9 hydriert, wird die Wechselwirkung geschwächt. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass die kovalente Bindung zwischen Leptomycin B und Exportin 1 auch in vivo stattfindet. Die Inhibition von zellulären Transport- prozessen wäre ein neuer Ansatz für pharmazeutische Wirkstoffe. Der Naturstoff selbst erwies sich allerdings als ungeeignet: In Versuchen der Klinischen Phase I stellte sich heraus, dass die Toxizität des Moleküls zu groß für eine medizinische Anwendung ist.[25] 1.3.3 Pironetin Pironetin 10 wurde aus einem Streptomyces-Stamm isoliert[26] und zeigte immunosuppressive Wirkung. Die Struktur konnte durch die erste Totalsynthese durch Kawada et al.[27] bestätigt werden, der weitere Synthesen folgten.[28;29] Wegen zu starker Cytotoxizität wurde von einer klinischen Entwicklung jedoch abgesehen. Pironetin ist ein potenter Inhibitor des Zellzyklus und führt zum Arrest in der M-Phase.[30] Darüber hinaus besitzt es anti-Tumor-Wirkung durch die Induktion von Apoptose mittels Inhibition der Polymerisation von Tubulin,[31] einem Mechanismus, der auch bei Colchichin gefunden wird. Um den Wirkungsmechanismus von Pironetin genauer zu studieren, setzten Osada et al. ein biotinyliertes Pironetin-Derivat ein, um das zelluläre Zielmolekül des Naturstoffes durch Affinitätschromatographie zu identifizieren.[32] Es wurde herausgefunden, dass Pironetin an die α-Untereinheit von Tubulin bindet und damit die Polymerisation inhibiert. Auch in diesem Fall wird der Naturstoff durch eine Michael-Addition kovalent an sein Zielmolekül gebunden, hier über die 10 Allgemeiner Teil Aminogruppe in der Seitenkette von Lys352, die sich dicht an der Kontaktfläche der beiden Tubulin-Untereinheiten befindet. Damit ist Pironetin der einzige bekannte Effektor des Cytoskeletts, der an der α-Tubulin-Einheit ansetzt. Verbindungen, deren biologische Aktivität auf eine Modifikation des Cytoskeletts zurückzuführen ist, werden z. Zt. in der Krebstherapie untersucht bzw. eingesetzt. Cl O OPMB H Et O + O O OPMB N H OTMS N OMe H OPMBO OR OPMBOMe OROTsOOMe OR OOMe OR O OtBu OMgBr OHOMe OR OtBu OO OOMe OH O R = TBS 18 19 20 2122 24 25 10 10 mol% 18 15 mol% LiClO4, DIPEA, -25 °C 1) Weinreb-Amid 2) TBSCl 3) DIBAL-H 1) 10 mol% ent-18, EtCOCl, LiI, DIPEA 2) DIBAL-H 3) TsCl 4) Me3OBF4 1) AllylMgBr, CuBr 2) Ir(PCy3)3 + 3) DDQ 4) Swern H 1) NaBH4 2)TsOH Al N N N Me SO2CF3ArO2S F3C iPriPr 23 0.5 eq. 23, PrCOBr, DIPEA Schema 2: Totalsynthese von Pironetin nach Nelson et al. Eine hoch diastereoselektive Synthese von Pironetin wurde kürzlich von Nelson et al. berichtet.[29] Dabei wurden die zahlreichen 1,3-Funktionalitäten durch formale Keten-Addition an Aldehyde erhalten. Der Alkaloid-Katalysator 18 (Schema 2) sorgte in der Cycloaddition zu 19 für einen Enantiomerenüberschuss von mehr als 98 %. Nach Regenerierung der Aldehyd-Funktion schloss sich eine zweite Cycloaddition an, die diesmal vom enantiomeren Katalysator ent-18 mit 95 % de dirigiert wurde. Eine dritte Addition dieses Typs fand am Aldehyd 22 statt, hierbei wurde ein chiraler Aluminium-Katalysator eingesetzt. Öffnung des β-Laktons und zwei weitere Stufen führten schließlich zum Endprodukt. 11 Allgemeiner Teil 1.3.4 Goniothalamin Während die bisher vorgestellten Naturstoffe durch eine stark funktionalisierte Seitenkette charakterisiert sind, die die Synthese dieser bioaktiven Verbindungen erschweren, gibt es unter den Naturstoffen mit α,β-ungesättigten δ-Laktonen auch kleinere Moleküle, die eine ausgewiesene biologische Aktivität besitzen. Ein Beispiel hiefür ist das Goniothalamin 11, das aus verschiedenen Bäumen der Gattung Goniothalamus isoliert wurde.[33] Neben der in Abb. 8 gezeigten Form liegt es auch noch in höher oxygenierten Derivaten vor. Die Stammverbindung 11 hat eine cytotoxische Wirkung, insbesondere auf Krebszellen. In jüngster Zeit untersuchten Pilli et al. die Struktur-Wirkungs-Beziehungen für 11 und einiger Derivate (Abb. 8).[34;35] O O 11 O O ent-11 O O O O O O 6.4 0.004 19.0 > 100 0.005 26 27 28 Abb. 8: Strukturen von Goniothalamin-Derivaten und ihre IC50-Werte in einem Proliferations-Assay der Nierenkrebs-Zell-Linie 786-0. Goniothalamin zeigte bei der humanen Krebszell-Linie MCF-7 (Brustkrebs) eine Verminderung der Proliferation mit einem IC50-Wert von 10.5 μM, und in einer Lungenkrebs-Zell-Linie (NCI 460) betrug der IC50-Wert 6.4 μM. Die biologische Aktivität der enantiomeren Verbindung ent-11 zeigte ein ganz anderes Profil: So war sie gegenüber einer Nierenkrebs-Zell-Linie (786-0) 1600 mal stärker wachs- tumsmindernd als 11. Die Untersuchung verschiedener Derivate ergab, dass das ungesättigte Lakton und auch die olefinische Seitenkette essentiell für eine hohe Aktivität gegen diese Zell-Linie sind. Allgemein zeigt dieses Beispiel auf illustra- tive Weise, wie sensibel biologische Systeme gegenüber kleinen Variationen in der Funktionalität des potentiellen Wirkstoffes sind. Die hier vorgestellten Beispiele für α,β-ungesättigte δ-Laktone mit biologischen Aktivitäten zeigen, dass trotz des reaktiven elektrophilen Michael-Systems Substratspezifität erreicht werden kann. Allerdings könnte die oftmals bei diesen Verbindungen festgestellte hohe Cytotoxizität ein Indikator dafür sein, dass neben dem eigentlichen Zielmolekül noch andere Proteine beeinflusst werden. 12 Allgemeiner Teil Während die chemische Komplexität von biologisch aktiven Molekülen wie Leptomycin B den Versuch einer schnellen Derivatisierung vor große synthe- tische Schwierigkeiten stellt, zeigt die cytotoxische Aktivität von Verbindungen mit überschaubaren synthetischen Anforderungen wie Goniothalamin, dass eine Bibliothek von α,β-ungesättigten δ-Laktonen ein interessantes biologisches Profil aufweisen könnte. Um eine Bibliothek von Derivaten dieser Verbindungen zu synthetisieren, sollte zum einen die Laktoneinheit konserviert bleiben: sie ist in allen hier vorgestellten Fällen für die spezifische Aktivität verantwortlich. Die Seitenkette dagegen kann variabler gestaltet werden. Neben unterschiedlichen Substituenten böte sich auch die Variation der Konfiguration an den Stereozentren der Seitenkette an. Dafür wären Reaktionen mit hoher Steroselektivität geeignet, die sich jedoch auch unter den speziellen Bedingungen der organischen Synthese an der festen Phase bewähren müssen. Beispiele solcher Reaktionen werden im folgenden Abschnitt vorgestellt. 1.4 Asymmetrische Synthese an der festen Phase Die Synthese von Verbindungsbibliotheken hat in den letzten Jahren sowohl in der Industrie als auch im akademischen Bereich an Gewicht gewonnen. Der schnelle Fortschritt auf dem Gebiet des Hochdurchsatz-Screenings erlaubt die parallele Untersuchung von mehreren tausend Substanzen in kurzer Zeit, so dass die Nachfrage nach neuen Verbindungen weiter steigt. Um diese Nachfrage zu befriedigen, bietet sich die kombinatorische Synthese an der festen Phase an. Die Vorteile der Synthese an einem polymeren Träger liegen vor allem in der schnellen Aufarbeitung einer Reaktion: Nach durchgeführter Transformation wird überschüssiges Reagenz durch Filtration entfernt, eine chromatographische Aufreinigung von Syntheseintermediaten entfällt. Erst am Ende der Sequenz, nachdem das Endprodukt vom polymeren Träger abgespalten wurde, wird chromatographisch gereinigt. 13 Allgemeiner Teil Ein weiterer Vorteil ist, dass die Reagenzien in Lösung im Überschuss eingesetzt werden können, damit das Reaktionsgleichgewicht zugunsten der Produkte verschoben und vollständiger Umsatz erreicht wird. Diese Charakteristika haben die organische Synthese an der festen Phase vor allem in der kombinatorischen Chemie zu einer gängigen Methode gemacht, da in der parallelen Synthese vieler Verbindungen die Aufreinigung von Zwischenprodukten zu einem erheblichen Mehraufwand führen würde. Auffällig ist aber, dass enantioselektive Methoden, also Transformationen, bei denen achirale Edukte unter Zuhilfenahme eines chiralen Auxiliars oder Katalysators zu nicht-racemischen Produkten umgesetzt werden, im Repertoire der Reaktionen an der festen Phase unterrepräsentiert sind. Wie in Kapitel 1.2 diskutier wurde, haben auf kombinatorischem Weg hergestellte Verbindungen im Allgemeinen wenig stereogene Zentren, so dass die Notwendigkeit einer asymmetrischen Reaktionsführung nicht besteht. Außerdem können Verbindungen als Racemate bzw. Diastereomerengemische eingesetzt werden, aus denen das aktive Isomer erst später bestimmt wird. Enthalten Verbindungen aus kombinatorischen Bibliotheken Stereozentren, so wurden diese in den meisten Fällen durch Einsatz nicht-racemischer Edukte aus natürlichen Quellen wie Zuckern oder Aminosäuren erhalten. Eine Schwierigkeit der asymmetrischen Synthese an immobiliserten Substraten besteht darin, dass es unmöglich ist, Isomerengemische in Zwischen- stufen abzutrennen. Es eignen sich also nur solche enantioselektiven Transfor- mationen für den Einsatz an immobilisierten Substraten, die eine hohe asym- metrische Induktion versprechen. Da Naturstoffe in der Regel eine größere stereochemische Komplexität besitzen als die Verbindungen kombinatorischer Bibliotheken, ist die Synthese Naturstoff-abgeleiteter Substanzbibliotheken an der festen Phase stark auf die Entwicklung effizienter asymmetrischer Reaktionsführungen angewiesen. Im Folgenden werden ausgewählte Beispiele solcher Reaktionen kurz diskutiert.[36] 14 Allgemeiner Teil 1.4.1.1 Aldol-Reaktionen Da die Aldol-Reaktion einen Zugang zu verschiedenen Isomeren von 1,3-Diolen liefert, die ein häufig wiederkehrendes Motiv in Naturstoffen darstellen, wurden in den letzten Jahrzehnten zahlreiche enantioselektive Varianten für die Aldol- Reaktion entwickelt. Ein Beispiel für die enantioselektive Synthese an der festen Phase wurde von Waldmann et al. berichtet (Schema 3):[37] Der Einsatz einer enantioselektiven syn-Aldol-Reaktion an einem immobilisierten Aldehyd 29 war der Ausgangspunkt für die Synthese einer Bibliothek von Spiro[5.5]ketalen, einem in Naturstoffen häufig gefundenen Strukturmotiv. In den günstigen matched-Fällen führte die Diastereoselektion zur Bildung eines einzigen Produktes. Aufbauend auf früheren Studien[38] gelang auch Paterson et al. die Synthese eines ähnlichen Spiroketals.[39] O H O O B(Ipc)2 O TBSO O O TBSO O BCy2 H OPMBO O O TBSO TBSO R1 R1 30 29 31 32 3435 O TBSO O R1 OR2 OPMB 1) 30, CH2Cl2, 2) TBSCl, DMF/CH2Cl2 cHex2BCl , NEt3, Et2O, 1) 33, Et2O 2) TBSCl, DMF/CH2Cl2 (R2 = OTBS) DDQ, CH2Cl2/Puffer 33 Ipc = nur ein Diastereomer isoliert Schema 3: Enantioselektive Aldolreaktionen an der festen Phase. Mit diesen Synthesen konnten lineare, hochfunktionalisierte Moleküle stereo- selektiv aufgebaut werden, wodurch naturstoffähnliche Gerüste auch mittels kombinatorischer Methoden zugänglich wurden. 1.4.1.2 Allylierungen Asymmetrische und enantioselektive Allylierungen und Crotylierungen eignen sich ebenfalls zum Aufbau von Stereozentren an der festen Phase. Panek et al. führten die erfolgreiche asymmetrische Crotylierung der immobilisierten Aldehyds 36 mit dem chiralen Silan 37 durch (Schema 4).[40] Dabei wurde ein 15 Allgemeiner Teil Selektivität von 30 : 1 zugunsten des syn-Produktes 38 erreicht. Zwei weitere Reaktionen dieses Typs konnten angewendet werden, um das Produkt 39 nach insgesamt 9 Stufen am polymeren Träger in 37 % Ausbeute zu erhalten. CHOMeO O CO2Me SiMe2Ph HO MeO OMe OMe OMe CO2Me MeO O OMe CO2Me 36 38 39 TMSOMe, TMSOTf, CH2Cl2, -78 °C 37 + O O N Si OPh Cl 41 1) 41, Toluol, - 20 °C 2)Abspaltung, Schützung 80 %ee TBDPSO OH 40 42 Schema 4: Enantioselektive Allylierungen an der festen Phase nach Panek (oben) und Tan (unten). Kürzlich berichteten Tan et al.[41] die enantioselektive Allylierung des immobilisierten Aldehyds 40 (Schema 4) mit dem chiralen Allyl-2-sila- oxazolidin 41[42] mit einem Enantiomerenüberschuss von 80 %. Dieser Wert stand im Einklang mit Ergebnissen, die in Lösung erzielt wurden. 1.4.1.3 Cycloadditionen Cycloadditionen gehören zu den wichtigsten Reaktionen in der organischen Chemie, da mit ihrer Hilfe mehrere Bindungen unter Kontrolle der Regio-, Diastereo- und Enantioselektivität gebildet werden. Auch in Studien zur Synthese von Substanzbibliotheken an der festen Phase wurden diese Reaktionen eingesetzt. So berichteten Schreiber et al. von einer enantioselektiven hetero- Diels-Alder-Reaktion mit inversem Elektronenbedarf, die mit Hilfe des Kupfer- Katalysators 45 (Schema 5) durchgeführt wurde.[43] 16 Allgemeiner Teil O R2 O O R2 O EtO OEt N O N O tButBu Cu 2 (OTf) 45 O R2 O O R2 O EtO O O OAllyl O OAllyl O R3 EtO R3 R3 OAllyl O O44 20 mol% 45 THF, RT 46 80-98 %ee 43 Schema 5: Enantioselektive Cycloadditionen an der festen Phase. Nach einigen weiteren Diversifizierungsschritten wurde eine Substanzbibliothek mit über 4000 Mitgliedern erhalten. Bemerkenswerterweise wurden in dieser Arbeit beide Enantiomere des chiralen Liganden eingesetzt, so dass auch die jeweiligen Enantiomerenpaare der Verbindungen in der Bibliothek vorhanden waren und separat untersucht werden konnten. 17 Allgemeiner Teil 1.5 Chemische Modifizierung von Peptiden und Proteinen Neben der Entwicklung neuer Synthesestrategien an der festen Phase für Naturstoff-abgeleitete Verbindungsbibliotheken werden im zweiten Teil dieser Arbeit Ansätze zur chemischen Modifikation von Peptiden und Proteinen vorgestellt. Mit der Entwicklung rekombinanter Techniken hat die Molekularbiologie ein effizientes Werkzeug zur Untersuchung biologischer Abläufe gewonnen. Die Ver- änderung der für ein Protein kodierenden DNA führt zur Bildung eines gegenüber dem Wildtyp veränderten Transkriptionsproduktes, welches in der Translation zum veränderten Protein abgelesen wird. Auf diese Weise lassen sich Proteine in einzelnen Aminosäuren oder ganzen Sequenzabschnitten manipulieren. Darüber hinaus ist es möglich, DNA aus einem Organismus in einem fremden Wirt zu exprimieren, um so z.B. die Isolierung von Proteinen zu vereinfachen. Den unbestreitbaren Stärken des Standard-Repertoires rekombinanter Tech- niken stehen aber auch einige Nachteile gegenüber. So bleibt die Variations- möglichkeit innerhalb des Proteins auf die natürlichen Aminosäuren begrenzt. Rekombinante Techniken erlauben z.B. nicht den Einbau kleiner Fluoreszenz- marker in ein Protein. Zudem lassen sich nicht alle Proteine in allen Fremdwirten vollständig exprimieren. So fehlt z.B. dem Bakterium E.coli die Enzym- Maschinerie für posttranslationale Lipidierungen. Ein Teilgebiet der chemischen Biologie beschäftigt sich von daher mit nicht- rekombinanten Lösungen der Probleme. Drei Auswege wurden entwickelt: 1) Die Entwicklung von in vitro und in vivo Translationssystemen, die die Einführung nicht-natürlicher Aminosäuren erlauben.[44] 2) Die Entwicklung von Synthesemethoden, die die Ligation eines chemisch synthetisierten Peptids an ein rekombinant erhaltenes Protein(fragment) ermöglichen. Hier sind exemplarisch die MIC-Ligation[45] und die expressed protein ligation[46] zu nennen. 3) Die direkte chemische Modifikation von natürlichen oder unnatürlichen Aminosäuren am Protein. 18 Allgemeiner Teil 1.5.1 Ligationsmethoden Bei der MIC-Ligation (maleinimidocaproyic acid) wird ein Peptid synthetisiert und am N-Terminus mit Maleinimidocaprylsäure acyliert (Abb. 9 A). Das Maleinimid fungiert als Michael-Akzeptor für Cystein-Thiole des Proteins. Das entstehender Michael-Addukt erwies sich als stabil genug, um nach Mikroinjektion der semi- synthetischen Proteine zelluläre Studien durchzuführen.[45] Ein Nachteil dieser Methode ist die mangelnde Selektivität: Das MIC-markierte Peptid kann an jedem Cystein an der Oberfläche gekuppelt werden. Die expressed protein ligation (EPL) kuppelt einen C-terminalen Thioester und ein N-terminales Cystein zu einer nativen Peptidbindung (Abb. 9 B). Dabei findet zunächst ein (energetisch neutraler) Thioester-Transfer statt, bevor ein S→N-Acylshift die thermodynamisch günstigere Peptidbindung erzeugt. Diese Ligationsmethode ist chemoslelektiv und erfordert keine Schutzgruppen. Mit ihr ist die vollständige chemische Synthese von Proteinen möglich.[45] N O O N H H N COOH O 5 R1 O R2 H N SH O O Protein OH + N O O N H H N COOH O 5 R1 O R2 H N O Protein COOH S A B H N R1 O O Protein S + R H2N N H HS O R2 Peptid oder Protein H N R1 O O Protein H2N N H S O R2 Umesterung H N R1 O O Protein NH H N HS O R2 1,4-Acylshift Abb. 9: Ligationsmöglichkeiten an Proteinen. A MIC-Ligation; B expressed chemical liation. Mit beiden Methoden ist es möglich, vielfältig modifizierte Peptide mit einem Protein zu koppeln. 19 Allgemeiner Teil 1.5.2 Übergangsmetall-vermittelte Reaktionen an Peptiden und Proteinen Der große Erfolg der Übergangsmetall-Katalyse in der organischen Synthese einerseits und die Möglichkeit, nicht-natürliche Aminosäuren in Proteine einzubauen andererseits führten zu Überlegungen, ob es möglich ist, Katalyse an Peptiden und Proteinen durchzuführen. 1.5.2.1 Modifizierung natürlicher Aminosäuren Francis et al. gelang es, mittels Übergangsmetallkatalyse verschiedene aminosäurespezifischen Reaktionen an Proteinen durchzuführen (Abb. 10).[47] Dabei wurden verschiedene Katalysatoren eingesetzt. Rhodium-katalysierte Carben-Insertion fand selektiv an Tryptophan statt.[48] Ein Palladium-Allyl- Komplex wurde in basischem Medium von Tyrosin abgefangen.[49] Schließlich gelang die reduktive Aminierung der ε-Aminogruppen von Lysin mit Hilfe eines Iridium-basierten Katalysators.[50] H N N H H N N H O O O N H OH NH2 H N O N H Ph OR N2 O Rh2(OAc)4, H2NOH*HCl H2O, Ethylenglykol pH 3.5 Ph OR O H N O O RR PdLn+ Phosphat-Puffer pH 9 H N N H O NH R N N Ir H Cp* OMe OMe R H O Abb. 10: Übergangsmetall-vermittelte Modifikationen an natürlichen Aminosäuren Alle diese Experimente konnten in wässrigem Medium durchgeführt werden, wenn auch nicht bei physiologischem pH-Wert. Ein weiterer Nachteil ist, dass sich die reagierenden Aminosäuren nicht nach ihrer Position im Protein differenzieren lassen. 20 Allgemeiner Teil 1.5.2.2 1,3-Cycloadditionen Die chemoselektive Kupfer-katalysierte 1,3-Cycloaddition von Aziden an Alkine wurde von Fokin et al. an der Oberfläche des Cowpea Mosaic Virus durchgeführt (Abb. 11).[51] Der nötige Cu(I)-Katalysator wurde in situ durch Reduktion von Kupfersulfat mit Tris(carboxyethyl)phosphin (TCEP) oder Kupferdraht erhalten. Die Reaktion verlief mit hohem Umsatz: alle Oberflächen-Azide wurden funktionalisiert. H N H N N3 O O 60 H N H N O O 60 N N H N N R O N H R O + CuSO4, TCEP 94 %CPM Virus A11.cdxR = Fluorescin Abb. 11: 1,3-Cycloadditionen an Proteinen. Tirrell et al. konnten diese Reaktion an Proteinen durchführen, die an ihrer Oberfläche ein Azido-Homoalanin präsentieren.[52] Da das eingesetzte Alkin mit Biotin markiert war, ließ sich das Cycloaddukt durch Western-Blot nachweisen. Schließlich konnten Schultz et al. zeigen, dass sich mit einem tRNA/tRNA- Synthetase-Paar sowohl Azido- als auch Alkinylaminosäuren in das Enzym Superoxid-Dismutase I ortsspezifisch einbauen lassen.[53] Diese Aminosäuren konnten dann in 1,3-Cycloadditionen eingesetzt werden. 1.5.2.3 Kreuzkupplungsreaktionen an Peptiden Palladium-katalysierte Kreuzkupplungsreaktionen gehören zum Standard-Reper- toire der organischen Synthese. In den allermeisten Fällen werden diese Reak- tionen in organischen Lösungsmitteln durchgeführt, jedoch sind auch Beispiele in wässriger Lösung bekannt.[54] Für den Einsatz solcher Reaktionen im wässrigen Medium an Proteinen dürften die Seitenketten der Aminosäuren nicht an der Reaktion beteiligt sein. Der Einsatz von Aminosäuren mit ungeschützten Seitenketten in Peptide ist in nur wenigen Veröffentlichungen über Palladium- vermittelten Kreuzkupplungsreaktionen dokumentiert: Schmidtchen et al. berichteten 1998 von Sonogashira-Reaktionen an Peptiden in wässriger Lösung.[55] Dabei reichten 5 mol% eines wasserlöslichen Palladium- Katalysators aus, um in einem gepufferten Medium bei pH 8.3 Propinsäure an das modifizierte Bradykinin-Peptid 47 zu kuppeln (Schema 6, A) 21 Allgemeiner Teil PdL4 , CuI (5 mol%), 0,2 M TAPS Puffer, pH 8.3, 50 °C, 3 h P H N N(Me)2 NH2 H N N(Me)2 NH2L = I PHN O RPPGFSPFR-OH COOH H+ PHN O RPPGFSPFR-OH COOH 91 % 47 48 I RHN O N NH O NHR O N NH O 3 3 Pd(TPPTS)4 (5 mol%), CuI (5 mol%), H2O, NaOAc, pH = 5.5, RT, 3h +3 R = KVAQLKKVQALKSKVA SR' O quantitativ 49 50 51 A B Schema 6: A Sonogashira-Reaktion an einem Bradykinin-Derivat. B Sonogashira-Reaktion an einem trifunktionellen Amin. Ghadiri et al. konnten am Amin 50 in einem Schritt alle drei terminalen Alkine an Peptide koppeln, die mit para-Iodbenzoesäure aktiviert worden waren (Schema 6, B).[56] Die Reaktion konnte sowohl unter neutralen als auch unter leicht sauren Bedingungen (pH 5.5) erfolgreich durchgeführt werden und zeigte sich kompatibel mit Thioestern wie in Verbindung 49. Freie Thiole, Thioether (wie sie in den Seitenketten der Aminosäuren Cystein oder Methionin vorkommen) oder Bipyridine führten jedoch zu verminderten Umsätzen. Auch die Suzuki-Kupplung konnte an peptidischen Substraten in wässriger Lösung durchgeführt werden (Schema 7). So setzten Moroder et al. die Suzuki- Reaktion intramolekular im Peptid 52 ein, um ein Analogon des Proteasom- Inhibitors TMC95 A zu erhalten.[57] 22 Allgemeiner Teil Z H N N H H N N H N H H N NH2 O O O O O O O N HMeO B O O O Br Z H N N H H N N H N H H N NH2 O O O O O O O MeO HN O 5 mol% Pd(dppf)Cl2, 3 eq. K2CO3, DME/H2O 7:1, 80°C, 5h 52 53 57 % Schema 7: Intramolekulare Suzuki-Reaktion an einem peptidischen Substrat. Zusammengefasst geben diese Arbeiten zu der Hoffnung Anlass, dass sich Übergangsmetall-katalysierte Reaktionen auch an einem vollständigen Protein durchführen lassen. 23 Allgemeiner Teil 24 2 Ziel der Arbeit Die Synthese von Naturstoff-abgeleiteten Verbindungs-Bibliotheken ist eine Strategie zur Entdeckung biologisch aktiver Substanzen. Naturstoffe können als prä-validierte Leitstrukturen angesehen werden, weil sie evolutionär auf die Interaktion mit den Liganden-erkennenden Bindungsstellen in Proteindomänen optimiert wurden. Damit sind Naturstoffe Erfolg versprechende Ausgangspunkte für die Synthese von Verbindungsbibliotheken. α,β-ungesättigte δ-Laktone (Abb. 12) stellen eine Gruppe von Naturstoffen mit einem interessanten biologischen Profil dar: Stoffe dieser Klasse sind hochwirksame Inhibitoren der Phosphatase PP2A, sie stören den Aufbau des Mikrotubulin-Gerüstes in der Zelle oder verhindern den Export von Biomolekülen aus dem Zellkern ins Cytoplasma. Für mehrere Naturstoffe konnte gezeigt werden, dass das ungesättigte Lakton essentiell für die biologische Aktivität ist. Da die Seitenketten dieser Naturstoffe sehr variabel sind, wurde die Grundstruktur dieser Verbindungen als Ausgangspunkt in der Naturstoff-abgeleiteten kombinatorischen Synthese ausgewählt. In dieser Arbeit sollten Synthesewege entwickelt werden, um α,β-ungesättigte δ-Laktone auf einem polymeren Träger auf kombinatorische Art zu erhalten. Dabei sollte eine möglichst große Substituentenvariabililtät in der Seitenkette erreicht werden. O O R1 R2 enantioselektiver Aufbau 6 R1, R2 variable Reste O O OH NaHPO4 OH OH O O Fostriecin: inhibiert PP2A Goniothalamin: cytotoxisch in Krebszellen Zielstruktur dieser Arbeit Abb. 12: Naturstoffe mit α,β-ungesättigten δ-Laktonen; Zielstruktur dieser Arbeit Da das zentrale Lakton an Position 6 in der (R)- oder (S)-Konfiguration vorliegen kann und die Seitenketten der Naturstoffe oft weitere stereogene Zentren besitzen, sollte die Synthese asymmetrisch geführt werden, also zu möglichst Ziel der Arbeit enantiomeren- bzw. diastereomerenreinen Verbindungen führen. Enantio- selektive Reaktionsführungen sind in der Organischen Synthese an der festen Phase –in auffälligem Gegensatz zur Synthese in Lösung – nur in wenigen Fällen dokumentiert. Die Einführung nicht-natürlicher Funktionalitäten in Proteine – z.B. Fluoreszenzfarbstoffe oder molekulare Anker für die Affinitätschromatographie – bietet vielfältige Möglichkeiten zur Untersuchung von Struktur und Funktion von Proteinen. Mit Hilfe unterschiedlicher Methoden ist es in den letzten Jahren gelungen, unnatürliche Aminosäuren in Proteine einzuführen, die Ausgangspunkt verschiedener nicht-natürlicher chemischer Transformationen sein können. In dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob sich Übergangsmetall-katalysierte Reaktionen auch an Proteinen durchführen lassen, wenn diese eine geeignete funktionelle Gruppe tragen (Abb. 13). Typischerweise wäre hier ein halogenierter Aromat eine geeignete Funktionalität. Protein H N NHR I O Protein H N NHR R O Übergangsmetall-Katalysator physiologische Bedingungen + M-R Abb. 13: Übergangsmetallkatalyse an Proteinen 26 3 Spezieller Teil 3.1 Synthese von α,β-ungesättigten δ-Laktonen an der festen Phase 3.1.1 Übersicht Die interessanten biologischen Eigenschaften von Naturstoffen mit α,β- ungesättigten δ-Laktonen als funktioneller Einheit (s. Kap. 1.3) waren der Ausgangspunkt für die Entwicklung von Strategien für die Synthese dieser Verbindungen an der festen Phase. Dabei sollte die Lakton-Untereinheit unter voller Stereokontrolle, also enantioselektiv synthetisiert werden. Da die α,β-ungesättigten δ-Laktone gute Michael-Akzeptor-Eigenschaften aufweisen (hierauf wird u.a. ihre biologische Aktivität zurückgeführt), wurden gezielt solche Wege gesucht, in denen diese reaktive und funktionelle Einheit erst am Ende der Synthesesequenz aufgebaut wurde. Hierzu wurden zwei Syntheserouten entworfen, die in den folgenden zwei Abschnitten vorgestellt und diskutiert werden (Abb. 14): O R1 O O O + hetero-Diels-Alder O O R2 R1 O O R1 O O ∗O O n Route IIRoute I ∗O R OR Ringschlussmetathese asymmetrische Allylierung ∗O R OH Abb. 14: Übersicht über die Syntheserouten Die Route I sieht eine Sequenz von iterativen enantioselektiven Allylierungen an immobilisierten Aldehyden mit abschließender Ringschlussmetathese vor. Route II basiert auf der oxidativen Abspaltung eines immobilisierten Ketals, das durch eine enantioselektive hetero-Diels-Alder-Reaktion gebildet wird. Spezieller Teil 3.1.2 Route I: Enantioselektive Allylierung an der festen Phase mit anschließender Ringschlussmetathese 3.1.2.1 Retrosynthese und Syntheseplan Der ungesättigte Heterozyklus in der Zielverbindung 54 sollte durch Ringschlussmetathese eines geeigneten immobilisierten Vorläufers erhalten werden (Schema 8). R' = H, Schutzgruppe O ∗OR' H O n O H O O ∗ ∗OR' O O HO ∗ ∗OR' n O O R RR R SSyn43.cdx n [RCM] [Veresterung Allylierung] 54 55 5657 Schema 8: Retrosynthese der Zielverbindung 54 nach Route I. Dies kann ein Acrylsäureester wie 55 mit einem Homoallylalkohol als Alkoholkomponente sein, der wiederum durch enantioselektive Allylierung aus Aldehyd 56 gewonnen werden kann. Aldehyd 56 ist über eine Ozonolyse der terminalen Doppelbindung eines ebenfalls durch enantioselektive Allylierung hergestellten Homoallylalkoholes zugänglich. Letztlich lässt sich die Synthese auf einen immobillisierten Aldehyd 57 als Ausgangsverbindung zurückführen. Auf diese Weise sollte es möglich sein, α,β-ungesättigte δ-Laktone mit mehrfach oxygenierten Alkylresten als Seitenkette zu erhalten. Gelänge die Einführung der Stereozentren durch asymmetrische Allylierung mit hoher Stereokontrolle, ließen sich Serien von Verbindungen aufbauen, die sich in Anzahl und Konfiguration ihrer Stereozentren unterscheiden. Letzteres wäre besonders interessant, da sich in einem biologischen Assay die verschiedenen Diastereomere einer Verbindung einzeln testen ließen. Solche Diastereomeren-„Bibliotheken“ wurden nur in wenigen Fällen synthetisiert (s. Kap. 1.2.1.1). 28 Spezieller Teil 3.1.2.2 Vorarbeiten: Enantioselektive Allylierung an fester Phase Die von Brown entwickelte Verwendung von Terpen-substituierten Allylboranen zur enantioselektiven Allylierung hat sich als effektive und verlässliche Methode in der organischen Synthese etabliert (Abb. 15).[58] Die hohen Enantiomerenüberschüsse, die mit dieser Reaktion erzielt werden können, werden mit einem streng geordneten Übergangszustand vom Zimmermann- Traxler-Typ erklärt.[59] In diesem sechsgliedrigen cyclischen Übergangszustand ordnet sich der Aldehyd so an, dass der Substituent R eine äquatoriale Position einnimmt. Durch das chirale Auxiliar kann dieser Übergangszustand in zwei diastereomeren, d.h. energetisch nicht entarteten Formen auftreten. Die asymmetrische Induktion resultiert aus der Bevorzugung eines dieser zwei diastereomeren Übergangszustände. Obgleich stöchiometrisch im Reagenz, finden die Brown-Borane bis heute Anwendung in der Synthese komplexer Naturstoffe, da sie – speziell im Fall einer syn-gerichteten Addition zum 1,3-Diol – ein hohes Maß an Reagenzkontrolle mitbringen.[60] O B Ipc H R BO IpcH R R H O d-Ipc2B R OH R OH Hauptprodukt Nebenprodukt + Ipc Me Me Abb. 15: Mechanismus der asymmetrischen Allylierung nach Brown. In dieser Arbeit vorausgehenden Studien gelang es Dr. Stefan Sommer und Dr. Victor Mamane, die enantioselektive Allyllierung nach Brown auf immobilisierte Aldehyde anzuwenden.[61] Eine Übersicht der Arbeiten ist in Tabelle 1 dargestellt. Neben den von Brown entwickelten Terpen-basierten Reagenzien 60 und 61 wurde auch das von Roush entwickelte,[62] von Diisopropyltartrat ausgehende Boronat 62 eingesetzt. Mit allen drei Reagenzien konnte das Produkt 59 in 79 % bis 95 % Ausbeute erhalten werden. Das d-Diisopinocampheylallylboran 60 (d-Ipc2BAll) lieferte hier zwar den niedrigsten Wert, war aber dafür hinsichtlich der asymmetrischen Induktion den anderen Allylboranen überlegen. Mit 60 wurden Enantiomerenüberschüsse von über 90 % erzielt. Deswegen wurden alle weiteren Studien mit den Pinen-abgeleiteten Reagenzien 60 bzw. ent-60 durchgeführt. 29 Spezieller Teil O O O 7 HO O 7 OH 1) Allylboran (Tab. 1) 2) H2O2, pH 7 buffer, DMF, MeOH, RT 3) 2 Äq. NaOMe, THF/MeOH 2/1 OH Hydroxy-PS Harz 0.98 mmol/g 1) 2 Äq. 10-Undecensäure 2 Äq. DIC, cat. DMAP, DMF/DCM 1/1 2) O3, DCM, -78 °C, dann 5 Äq. PPh3 0.6 mmol/g 58 59 SSyn45.cdx BAll BAll O B O CO2Et CO2Et 2 260 61 62 Nr. Reagenz Ausbeute(a) Selektivität 1 60 79 % 91 %ee (R) 2 61 95 % 81 %ee (S) 3 62 95 % 77 %ee (R) Tabelle 1: Asymmetrische Allylierung an der festen Phase. (a) isolierte Ausbeute Die weitere Entwicklung des Protokolls zeigte, dass die besten Ergebnisse unter Verwendung des besonders reaktiven (Magnesium-)salzfreien Reagenzes[58] erzielt werden können. Um den schlechten Quelleigenschaften von Polystyrol- Harzen in Diethylether, dem bevorzugten Lösungsmittel für diese Reaktion, Rechnung zu tragen, wurde als Lösungsmittel eine Mischung aus THF (beste Quelleigenschaft des Harzes) und Diethylether (höchste Reaktions- geschwindigkeit des Borans) eingesetzt.[63] Unter diesen Bedingungen war bereits eine iterative Anwendung der Allylierung mit hohen Ausbeuten, großer Reinheit der Produkte und hohen Diastereoselektivitäten möglich (Schema 9). 30 Spezieller Teil O MeO O O O O OR O O OR O MeO O O OH O O O O 1) O3, CH2Cl2, -78 °C, dann 5 Äq. PPh3 2) 3 Äq. d-Ipc2BAll THF, -78°C - 0°C 3) pH 7 Puffer, H2O2 DMF/MeOH 1:1, 2h Dimethoxypropan/ CH2Cl2 1:1, cat. CSA RT, 24 h NaOMe, MeOH/THF RT, 15 h 43% (7 Stufen) syn/anti 86:14 1) Ozonolyse 2) Allylierung 3) NaOMe, THF/MeOH 40% (9 Stufen) 4 Diastereomere: 75/13/9/3 6768 69 OH 63 R = H 64 R = TBS TBSCl, cat. DMAP Imidazol, CH2Cl2, RT, 15 h 65 R = TBS 66 R = H TBAF, THF RT, 15 h Schema 9: Asymmetrische Allylierung am Polystyrol-Harz mit Abspaltung unter basischen Bedingungen. Als Vorteil der enantioselektiven Allylierung von Aldehyden an der festen Phase stellte sich heraus, dass sowohl das nach der reduktiven Aufarbeitung der Ozonolyse anfallende Triphenylphosphinoxid, als auch das nach der oxidativen Aufarbeitung der asymmetrischen Allylierung entstehende Pinol sehr bequem abgetrennt werden konnten: mehrfaches Waschen des Trägerpolymers ersetzte aufwendige chromatographische Trennungen. Zusammenfassend wurde in diesen Experimenten gezeigt, dass die Brownschen Allylborane mit Transformationen an immobilisierten Aldehyden kompatibel sind. Auch versprach die Anwendung mehrerer Zyklen von Ozonolyse und Allylierung hohe Selektivität, zumindest für den ausschließlich untersuchten syn-Fall. Jedoch konnte die oben gezeigte Strategie nicht für die Synthese der Zielstrukturen angewendet werden. α,β-ungesättigte-δ-Laktone sind nicht beständig gegenüber den basisch-nukleophilen Abspaltungsbedingungen, wie sie in den hier beschriebenen Experimenten angewendet wurden. Die Synthese von α,β-ungesättigten δ-Laktonen musste also an einem anderen Trägerpolymer durchgeführt werden, von welchem die Substrate unter anderen Bedingungen abgelöst werden können. 31 Spezieller Teil Zudem lagen zu Beginn dieser Arbeit nur rudimentäre Kenntnisse über die Ringschlussmetathese zu elektronenarmen Olefinen an der festen Phase vor, so dass eine detaillierte Untersuchung notwendig war. Schließlich musste bei der Synthese ein Augenmerk auf die Selektivität jedes einzelnen Allylierungsschrittes gelegt werden, um nach der finalen Abspaltung vom Harz ein diastereomerenangereichertes Produkt zu erhalten, das von seinen Isomeren getrennt werden konnte. 3.1.2.3 Wahl des Linkers für die Synthese an der feste Phase Für die organische Synthese an der festen Phase muss ein Substrat auf eine Weise an einem polymeren Träger gebunden sein, die (a) gegenüber den beabsichtigten Reaktionsbedingungen inert ist und (b) eine zersetzungsfreie Abspaltung des Produktes ermöglicht. Die Bindung an den polymeren Träger kann dabei verschiedene funktionelle Gruppen des Substrates ausnutzen. Eine Möglichkeit ist die Immobilisierung des Substrates über eine Hydroxylgruppe. Analog zu den vielfältigen Silizium-basierten Schutzgruppen sind eine Reihe von Silyl-Linkern[64] bekannt (Abb. 16). Diese sind – ebenso wie ihre Schutzgruppen- Analoga – hinsichtlich ihrer chemischen Stabilität differenziert. Die Phenyldiisopropylsilyl-Variante 70 zeichnet sich durch ihre chemische Stabilität aus. Der Linker 71, der durch Hydrosilylierung eines terminalen Alkens hergestellt werden kann, wurde von Schreiber et al. in einer Reihe von Bibliothekssynthesen angewendet[43;65] und ist im kommerziell erhältlichen „Macrobead“-System zu finden.[66] Si O Substrat iPriPr Si O tBu Ph Substrat Si O iPr iPr Substrat 70 71 72 Danishefsky et al. (1995) Tan et al. (2005)Darling et al. (1997) Abb. 16: Silyl-Linker für die organische Synthese an der festen Phase. Angesichts der in diesem Projekt geforderten Eigenschaften – Stabilität unter oxidativen Bedingungen und Abspaltung des Substrates unter nicht-basischen Bedingungen – bot sich der Einsatz eines Silyl-Linkers für die Immobilisierung der Substrate am polymeren Träger an. Durch den Einsatz von Silyl-Schutzgruppen für weitere, im Laufe der Synthese gebildete Alkohole wäre es außerdem 32 Spezieller Teil möglich, nach der Abspaltung in nur einem chromatographischen Aufarbeitungs- schritt zu den (vollständig entschützten) Endprodukten zu kommen. 3.1.2.4 Synthese immobilisierter Aldehyde Um die gewünschte Reaktionssequenz an der festen Phase zu etablieren, wurde zunächst ein Modellsystem entwickelt. Dazu wurde 10-Undecen-1-ol über einen Silyl-Linker an ein Polystyrol-Harz gebunden. An kommerziellem Brom-PS-Harz 73 wurde durch Einsatz von 6 Äq. n-Butyllithium ein Lithium-Halogenaustausch durchgeführt (Schema 10).[64] Der große Überschuss an Lithium-Reagenz, die lange Reaktionszeit und die hohe Reaktionstemperatur (14 h bei 60 °C) sorgten für einen deutlich sichtbaren Umsatz: Am Ende dieses Schrittes lag ein dunkelrotes bis tiefschwarzes Harz vor, das unter Hitzeentwicklung mit Diisopropyldichlorsilan reagierte. Das auf diese Weise entstandene immobilisierte Silylchlorid 75 ist hydrolyseempfindlich[67] und wurde deswegen in situ mit 10-Undecenol oder 4-Pentenol umgesetzt. Eine Beladungsbestimmung wurde mit den terminalen Olefinen 76 und 77 nicht durchgeführt. Dies war erst auf der Stufe der Aldehyde 78 und 79 möglich, die durch Ozonolyse erhalten wurden. PS Harz Br O 6 Äq. n-BuLi, Toluol, 60 °C 16 h PS Harz Li 4 Äq. ( iPr)2SiCl2 THF, 0 °C bis RT PS Harz Si Cl i-Pr i-Pr n 2 Äq. 10-Undecenol (n= 4) oder 2 Äq. 4-Pentenol (n=1) 2 Äq. 2,6-Lutidin 0.5 Äq. DMAP CH2Cl2, RT O Hn O 1) O3, CH2Cl2, -78 °C 2) 5 Äq. PPh3, DCM, -78 °C bis RT 73 74 75 0.5-0.7 mmol/g 25 % ca. 2 mmol/g 76 n = 4 77 n = 1 78 n = 4 79 n = 1 Schema 10: Synthese von immobilisierten Aldehyden Die oxidative Spaltung der terminalen Doppelbindung mit Ozon ist eine Reaktion, die an immobilisierten Substraten sehr einfach durchgeführt werden kann. Das Reagenz – Ozon - liegt im Überschuss vor, ist hochreaktiv und kann schnell wieder mit Argon verdrängt werden. Ist das Lösungsmittel mit Ozon gesättigt, was 33 Spezieller Teil durch das Auftreten einer blauen Farbe angezeigt wird, wird das Substrat innerhalb weniger Minuten vollständig umgesetzt. Für die reduktive Aufarbeitung zum Aldehyd kann Triphenylphosphin in großem Überschuss eingesetzt werden. Überschüssiges Reagenz wird durch mehrfaches Waschen des Harzes vollständig entfernt. Qualitativ konnten die Aldehyde 78 und 79 durch eine charakteristische Bande im FT-IR-Spektrum bei 1726 cm-1 nachgewiesen werden. Darüber hinaus war es möglich, die Beladung des Harzes mit dem FmPH-Reagenz[68] zu quantifizieren, sie betrug 0.5-0.7 mmol/g. Damit betrug die Ausbeute dieser zwei Stufen, bezogen auf die vom Hersteller des Harzes 73 angegebene Bromid-Beladung (ca. 2.6 mmol/g) nur 25 %. Dies könnte darauf zurückzuführen sein, dass Wasser-Rückstände die empfindliche lithiierte Spezies protonierten. Da es sich im Folgenden aber heraus stellte, dass die immobilisierten Produkte in großer Reinheit vom Harz abgespalten werden konnten, wurde die recht niedrige Beladung akzeptiert. 3.1.2.5 Enantioselektive Allylierung Mit dem immobilisierten Aldehyd 78 wurde die enantioselektive Allylierung gemäß dem oben beschriebenen Protokoll durchgeführt (Schema 11). Dazu wurde bei -78 °C mit 6 Äq. des vom (+)-α-Pinen abgeleiteten d-Diisopinocampheylallyl- borans 60 versetzt und über Nacht zur Reaktion gebracht. Die anschließende oxidative Aufarbeitung zum immobilisierten Homoallylalkohol 80 wurde mit wässriger Wasserstoffperoxid-Lösung in einem neutral-gepufferten Medium durchgeführt. Nach Abspaltung des Reaktionsproduktes und kurzer chromato- graphischer Aufreinigung wurde der Homoallylalkohol in 95 % Ausbeute erhalten. 34 Spezieller Teil O H4 O 78 B 2 + 60 1) -78 °C, THF/Et2O 1:1 2) H2O2, DMF/MeOH 1:1 O 4 OH 80 HO 4 OH 81 95 % TBAF, DCM O H O 79 HO OH 82 96 % 1) 4 Äq. 60 THF, -78 °C dann H2O2, DMF/MeOH 2) HF/Pyridin, THF, RT Schema 11: Enantioselektive Allylierung der immobilisierten Aldehyde 78 und 79. Analog dazu wurde der Aldehyd 79 mit kürzerer Methylenkette in der enantioselektiven Allylierung umgesetzt (Schema 11). Nach Abspaltung mit Fluorwasserstoff (s. unten) wurde das Diol 82 nach chromatographischer Aufreinigung in 96 % isolierter Ausbeute gewonnen. Die Bestimmung des Enantiomerenüberschusses von 82 wurde erst auf einer späteren Stufe der Synthese vorgenommen. Im Verlauf der Arbeit konnten einige Parameter für die erfolgreiche Durchführung der enantioselektiven Allylierung gefunden werden. Wie sich herausstellte, war das Gelingen der Reaktion maßgeblich vom Reagenz 60 abhängig: • Das Reagenz 60 musste - am besten ausgehend von (+)-Diisopinocam- pheylmethoxyboran - nach einem Protokoll von Brown „salzfrei“ hergestellt werden, d.h. von den ausfallenden Mg-Salzen extrahiert werden. Brown et al. berichten eine drastisch gesteigerte Reaktivität der Allylborane nach einer solchen Zubereitung, die bei Aldehyden in Lösung selbst bei -100 °C innerhalb von kürzester Zeit (Sekunden bis Minuten, gegenüber Stunden im Falle salzhaltiger Protokolle) abreagieren.[58] Als Erklärung wird für „salzhaltige“ Protokolle die Koordination eines Methoxid-Restes an das Bor-Atom vermutet, welches die Reaktivität des Allylborans herabsetzt. • Das Reagenz 60 konnte nur über begrenzte Zeit gelagert werden: es war nach der Herstellung ca. eine Woche als Lösung in Diethylether bei -20 °C stabil. 35 Spezieller Teil • Der Umsatz und die Enantioselektivität hingen von der Qualität des Reagenzes 60 ab. Diese wiederum wurde entscheidend durch den Zustand des (gekauften) Diisopinocampheylmethoxyborans bestimmt. Die höchsten Selektivitäten wurden mit Allylboranen erzielt, die aus festem Diisopinocampheylmethoxyboran synthetisiert worden waren. 3.1.2.6 Variation der Abspaltungsbedingungen Die Abspaltung der Substrate vom Trägerpolymer wurde zunächst mit 1M TBAF- Lösung in DCM durchgeführt (Schema 11).[69] Der bequemen Handhabung dieses Reagenzes standen allerdings Schwierigkeiten bei der Aufarbeitung des Rohproduktes nach Freisetzung vom Trägerpolymer gegenüber: Da das Tetrabutylammonium-Ion als ein gutes Phasentransfer-Reagenz fungiert, war seine Entfernung aus der organischen Phase durch wässrige Extraktion nicht vollständig möglich. Da zur Abspaltung vom polymeren Träger ein Überschuss an TBAF eingesetzt wurde, fiel diese Eigenschaft stark ins Gewicht. Gerade bei Testabspaltungen im analytischen Maßstab war die chromatographische Trennung der Reaktionsprodukte von TBAF problematisch. Aus diesem Grund wurde ein alternatives Reagenz zur Abspaltung getestet. Die von Schreiber et al.[65] beschriebene Verwendung von Pyridin-gepuffertem Fluorwasserstoff erwies sich als guter Ausweg. Hier konnte der Überschuss an Reagenz durch Quenchen mit Trimethylmethoxysilan (TMSOMe) in flüchtiges Trimethylsilylfluorid überführt werden, das am Hochvakuum entfernt wurde. Dabei war es wichtig, einen ausreichend großen Überschuss einzusetzen. Eine zu geringe Menge an Abspaltungsreagenz führte zum Auftreten von Pyridiniumsalzen, welche die Bestimmung der Ausbeute erschwerten. Erfahrungsgemäß traten bei Einsatz von ca. 10 Äq. TMSOMe keine Pyridinium- Salze mehr auf. 3.1.2.7 Entwicklung der Ringschlussmetathese Die Vorläufermoleküle für die Ringschlussmetathese wurden durch Umsetzung der Homoallylalkohole 80 und 85 mit Acrylsäurechlorid synthetisiert (Schema 12). Bei Einsatz von 5 Äq. Acrylsäurechlorid, 5 Äq. Triethylamin und katalytischen 36 Spezieller Teil Mengen DMAP konnte im FT-IR-Spektrum das Verschwinden der OH-Bande (~3200 cm-1) beobachtet werden. Testabspaltungen zu den entsprechenden Acrylsäureestern 84 und 87 belegten außerdem die erfolgte Veresterung. HO O 84 O O O HO 87 O OH 85 O 4 OH 80 O 4 O 83 O O O O 86 5 Äq. Acryloylchloride 5 Äq. NEt3 cat. DMAP, DCM 5 Äq. Acryloylchloride 5 Äq. NEt3 cat. DMAP, DCM 1M TBAF DCM HF/Pyridin THF 21 % 51 % Schema 12: Synthese der Vorläufer zur Ringschlussmetathese. Damit war der Weg zur Untersuchung der Rinschlussmetathese zum ungesättigten δ-Lakton (Tabelle 2) frei. Der langkettige Ester 83 wurde mit 30- 45 mol% des Grubbs-Katalysators der 1. Generation 88 versetzt (Einträge 1, 2). Trotz langer Reaktionszeit (17-24 h gegenüber 2 h vergleichbarer Substrate in Lösung[23]) konnte das gewünschte Produkt 89 nach Abspaltung vom Harz nicht detektiert werden. Auch der Wechsel des Lösungsmittels zu Dichlorethan, um eine Erhöhung der Reaktionstemperatur zu erreichen, brachte keinen Erfolg (Eintrag 4). HO O 89 O O 4 O 83 O O 4 O O s. Tabelle 2 18 h HF/Pyridin THF Ru PCy3 Cl Cl 88 PCy3 SSyn49.cdx Nr. Katalysator Lösungsmittel Ausbeute(a) 1 30 mol% 88 CH2Cl2 0 % 2 45 mol% 88 CH2Cl2 0 % 3 45 mol% 88 DCE 0 % 5 50 mol% 88 + 1Äq. Ti(OiPr)4 CH2Cl2 7 -9% Tabelle 2: Entwicklung der Ringschlussmetathese am Acrylat 83. (a) isolierte Ausbeute 37 Spezieller Teil Im Rahmen einer Synthese des Naturstoffes Laulimalid berichten Ghosh et al. über einen erfolgreichen Ringschluss zum δ-Lakton 91 (Schema 13):[70] Durch Zugabe von 30 mol%. Titantetraisopropoxylat gelang es, die offenkettige Verbindung 90 zu schließen. Nach Fürstner[71] ist die Beschleunigung der Ring- schlussmetathese dadurch zu erklären, dass die potentielle Koordination des Ruthenium-Katalysators an die Ester-Gruppe durch eine konkurrierende Chelatisierung des Titan(IV)-Ions verhindert wird. BnO O O BnO O O 10 mol% 88 1 Äq. Ti(OiPr)4 DCM, 40 °C 72 % 90 91 Schema 13: Einsatz von Ti(OiPr)4 in der RCM [70] Die Zugabe von einem Äquivalent Titantetraisopropoxylat führte auch im Fall des immobilisierten Acrylats 83 zum erfolgreichen Ringschluss (Tabelle 2, Eintrag 5): Das Produkt 89 konnte in 7-9 % Gesamtausbeute erhalten werden. Durch den Einsatz zweier Metalle im letzten Schritt gestaltete sich aber auch die finale Aufreinigung des Produktes 89 schwierig: Wie an der leicht bräunlichen Farbe zu erkennen war, enthielt es nach der Abspaltung noch Spuren des Katalysators. Erst nach mehrfacher chromatographischer Aufreinigung an Kieselgel und durch präparative HPLC konnte das Produkt 89 analysenrein als farbloses Öl isoliert werden. Der Ester 85 konnte ebenfalls nach dieser Methode cyclisiert werden (Tabelle 3). Auch hier wurde neben der chromatographischen Aufreinigung an Kieselgel eine Trennung des cyclisierten Produktes 93 durch präparative HPLC durchgeführt, um Katalysatorrückstände zu entfernen. Auch die enantiomere Verbindung ent-93 wurde auf diese Weise erhalten. 38 Spezieller Teil O O HO 93 O O O 85 HF/Pyridin THF O O O 92 s. Tabelle 3 CH2Cl2, 45 °C, 18 h Ru PCy3 Cl Cl Ru O NN Ar Ar Cl Cl 9588 Ru NN Ar Ar Cl Cl PCy3 94 PCy3 Nr. Katalysator Ausbeute Anmerkung 1 50 mol% 88+ 1 Äq. Ti(OiPr)4 9 % 2 50 mol% 88 + 1 Äq. Ti(OiPr)4 5 % (S)-Enantiomer ent-93 3 40 mol% 95 12 % Tabelle 3: Ringschlussmetathese des Acrylesters 85 Im Zuge der rasanten Entwicklung der Ringschlussmetathese von einer industriell genutzten „black box“-Reaktion hin zur präparativen Methode mit definierten Katalysatorsystemen[72-74] wurden weitere Ruthenium-Carben-Komplexe entwickelt und kommerziell vermarktet, die dem Grubbs-Katalysator der ersten Generation 88 in ihrer Aktivität an vielen Substraten überlegen sind. Diese Katalysatoren 94 und 95 sind durch ihren gemeinsamen N-heterocyclischen Carben-Liganden (NHC) charakterisiert. Dieser zeichnet sich durch spezielle elektronische Eigenschaften aus: Der Ligand fungiert praktisch ausschließlich als σ-Donor, die π-Rückbindung ist schwächer als bei jedem Phosphin.[75] Als Erklärung für die erhöhte Reaktivität dieser Katalysatoren wird eine vereinfachte Dissoziation des zum NHC trans-ständigen Liganden[76] oder die elektronische und sterische Stabilisierung einer aktiven Carben-Konformation angenommen.[77] Der Katalysator 95 bietet außerdem den Vorteil großer Stabilität an Luft.[78] Mit dem Katalysator 95 konnte die RCM an der festen Phase auch ohne den Zusatz von Additiven durchgeführt werden (Tabelle 3, Eintrag 3). Nach Abspaltung vom Harz lagen Rohprodukte vor, die in den weiteren Aufarbeitungsschritten leichter zu handhaben waren. Aus diesem Grund wurde der Katalysator 95 im weiteren Verlauf dieser Arbeit gegenüber dem Grubbs-Katalysator der ersten Generation (88) bevorzugt eingesetzt. In parallelen Arbeiten, die von Dr. Ana García und 39 Spezieller Teil Dr. Jayant D. Umayre verfolgt wurden, bewährte sich auch der Katalysator 94 (s. Kap. 3.1.2.14). Auffallend war jedoch, dass auch im Falle der aktiveren Katalysatoren 94 und 95 eine hohe Katalysatorladung nötig war. Beim Einsatz von weniger als 40 mol% konnte kein vollständiger Umsatz erzielt werden. Zudem blieb die Abtrennung des Katalysators vom Endprodukt problematisch. 3.1.2.8 Bestimmung des Enantiomerenüberschusses in Lakton 93 Nach vollzogenem Ringschluss gelang es, den Enantiomerenüberschuss der Verbindung 93 zu bestimmen. Die gaschromatographische Analyse der aufgereinigten Verbindung 93 auf einer chiralen Lipodex E Säule (Abb. 17, A) zeigte ein Enantiomerenverhältnis von 94.5 : 5.5 (89 %ee). Aufgrund der Annahme, dass die Allylierung an einem immobilisierten Aldehyd den gleichen stereochemischen Verlauf hat wie in Lösung, wurde als absolute Konfiguration des Hauptproduktes die abgebildete (R)-Konfiguration angenommen. Diese Annahme wurde später bestätigt (s. Kap. 3.1.2.15.2). Der erreichte Wert von 89 %ee bestätigte die Ergebnisse, die bereits früher an immobilisierten Aldehyden erzielt worden waren. Die Verwendung von l-Ipc2BAll führte zur Anreicherung von ent-93 (Abb. 17, B), wenn auch mit geringerer Selektivität (Enantiomerenverhältnis 31 : 69, 38 %ee). Die niedrigere Selektivität ist vermutlich auf eine schlechtere Qualität des bei der Allylierung eingesetzten Borans ent-60 zurückzuführen. 40 Spezieller Teil 10 11 12 13 14 Zeit [min] 10 11 12 13 14 Zeit [min] Abb. 17: Ausschnitt aus dem Gaschromatogramm der Verbindungen 93 und ent-93 auf einer chiralen Lipodex E-Säule. Mit der erfolgreichen Ringschlussmetathese zu den Verbindungen 89, 93 und ent-93 waren alle einzelnen Stufen für eine iterative, kombinatorisch-stereo- differenzierende Syntheseführung entwickelt und konnten damit angewendet werden. 3.1.2.9 Mehrfache Allylierung, Schutzgruppen Der Homoallylalkohol 85 (Schema 14) wurde im Weiteren als Ausgangspunkt genutzt, um eine iterative Synthesesequenz zu entwickeln. Vor der Transformation der terminalen Doppelbindung durch Ozonolyse zur Regenerierung einer Aldehyd-Funktionalität wurde die Hydroxygruppe des Homoallylalkohols geschützt. Um wie geplant das Endprodukt der Sequenz gleichzeitig entschützen und vom polymeren Träger abspalten zu können, wurde die tert.-Butyldimethylsilylschutzgruppe[79] gewählt. Die Schützung mit 5 Äq. TBS- O HO O ent-93 38 %ee A B O HO O 93 89 %ee 41 Spezieller Teil Chlorid in DMF (Schema 14) konnte am Homoallylalkohol 85 durch das Verschwinden der OH-Bande bei 3600 cm-1 im FT-IR-Spektrum verfolgt werden. Damit konnte ein neuer Zyklus von Ozonolyse, Allylierung und RCM begonnen werden (Schema 14). Die Reaktionssequenz wurde erneut mittels FT-IR- Spektroskopie verfolgt. Nach der Ozonolyse trat die Carbonylbande um 1729 cm-1 wieder auf. Die Bestimmung der Beladung nach der FmPH-Methode[68] lieferte ein deutlich geringeres Ergebnis als zuvor: es wurden nur noch 0.22 mmol/g erreicht. O OH 85 O OTBS 96 5 Äq. TBDMSCl 5 Äq. Imidazol, cat. DMAP, DMF O OTBS 1) O3, CH2Cl2, -78 °C 2) PPh3 H O 97 O OTBSOH 98 HO OH OH 1) 5 Äq. d-Ipc2BAll, THF/Et2O 1 : 1 2) aq. H2O2, DMF HF/Pyridin THF 40 °C, 15 h 99 91% syn/ anti 85 :15 Beladung 0.22 mmol/g Schema 14: Zweifache Allylierung an der festen Phase. Das Produkt 98 der syn-dirigierten Allylierung mit d-Ipc2BAll konnte in einer Testabspaltung in 91 % Ausbeute (bezogen auf den Aldehyd 97) nachgewiesen werden. Wie sich dabei herausstellte, reichten die bisher angewendeten Bedingungen für die Abspaltung des Substrates vom Harz nicht aus. Wie die GC- MS-Analyse zeigte, lag nach achtstündiger Reaktionszeit mit Fluorwasserstoff bei Raumtemperatur ein Gemisch aus vollständig entschütztem und TBS-geschützem Produkt vor. Um die gleichzeitige Entschützung und Abspaltung zum Triol 99 zu erreichen, wurde das Harz über Nacht bei 40 °C mit Fluorwasserstoff behandelt. Unter diesen Bedingungen wurde die TBS-Gruppe vollständig entfernt. Das Diasteromerenverhältnis konnte durch gaschromatographische Analyse des persilylierten TMS-Derivats von 99 bestimmt werden. Im Rohprodukt wurde ein syn:anti-Verhältnis von 85 : 15 festgestellt. 42 Spezieller Teil Der Homoallylalkohol 98 wurde in der beschriebenen Weise in den Acrylester 100 überführt (s. Tabelle 4). Bei der nun anstehenden RCM konnte mit dem Grubbs I Katalysator 88 unter Zugabe von Titantetraisopropoxylat kein Produkt isoliert werden (Tabelle 4, Eintrag 1, 2). Möglicherweise war durch die bis hierhin achtstufige Synthese nur noch wenig 100 auf dem Harz immobilisiert, so dass die geringen Produkt- mengen nicht mehr aus dem zähen Rohprodukt isoliert werden konnten. Abhilfe schuf hier die Verwendung von RCM-Katalysatoren der zweiten Generation 94 und 95 (Tabelle 4, Eintrag 3, 4), deren Verwendung das gewünschte Produkt 101 lieferte. Das nach Abspaltung erhaltene Rohprodukt wurde direkt mittels präparativer HPLC aufgereinigt, eine Trennung der Diastereomere konnte jedoch nicht erreicht werden. 98 O OTBSO 100 O HO OH O 101 O 5 Äq. Acryloylchlorid 5 Äq. NEt3, cat. DMAP, CH2Cl2 1) s. Tabelle 4 2) HF/Pyridin, THF, 40 °C Nr. Katalysator Lösungsmittel/ Bedingungen Ausbeute(a) Bemerkung 1 40 mol% 88, 1 Äq. Ti(OiPr)4 DCM, 22 h 0 % 2 40 mol% 88, 1 Äq. Ti(OiPr)4 Toluol, 19 h 0 % 3 45 mol% 94 DCM, 18 h 24 % Umsatz unvollständig 4 40 mol% 95 DCM, 24 h 19 % Umsatz vollständig Tabelle 4: Synthese des syn-Diols 101. (a) isolierte Ausbeute Bei Verwendung des Katalysators 94 konnte nach 18 h unter Rückfluss in der LC- MS-Analyse des Rohproduktes nach Abspaltung immer noch nicht-cyclisierter Acrylester 100 detektiert werden (Eintrag 3). Das gewünschte Produkt 101 konnte aber durch präparative HPLC vom Edukt getrennt werden. Erst nach weiteren 6 h Reaktionszeit war der Umsatz vollständig (Eintrag 4). Beim Einsatz von 40 mol% des Grubbs-Hoveyda-Katalysators 95 lag die isolierte Ausbeute mit 19 % zwar unter dem mit dem Katalysator 94 erreichten Wert, doch zeigten sowohl das 43 Spezieller Teil Chromatogramm der präparativen HPLC als auch das 1H NMR-Spektrum der Endverbindung 101 geringere Mengen von Verunreinigungen an. Mit der erfolgreichen Synthese des Produktes 101 über insgesamt neun Stufen konnte gezeigt werden, dass sich 1,3-Diole und ihre höheren Homologe durch mehrfache Allylierung immobilisierter Substrate herstellen lassen. 3.1.2.10 Acetat als Schutzgruppe Alternativ zur TBS-Schützung wurde die Überführung des Homoallylalkohols 85 ins Acetat angewendet. In diesem Fall überstand die Schutzgruppe die Abspaltung des Endproduktes vom Harz, so dass eine Endverbindung entstand, die in biologischen Assays eine andere Aktivität aufweisen könnte als die Produkte mit freien Hydroxygruppen. Die Acetylierung von Hydroxygruppen ist eine Modifikation, die in Naturstoffen ebenfalls vorkommt. Ein Vorteil der Verbindungen mit acetylierten Hydroxygruppen ist, dass sie leichter die (unpolare) Zellmembran passieren können, so dass die Bioverfügbarkeit der Verbindung steigt. Durch intrazelluläre Esterasen kann die Acetylgruppe wieder abgespalten und damit die evtl. aktivere Stammverbindung freigesetzt werden. O OH 85 O OAc 102 10 Äq. Ac2O, 4 Äq.NEt3, 0.5 Äq. DMAP, CH2Cl2, RT O OAc 103 H O1) O3, -78 °C 2) PPh3 1) 5 Äq. d-Ipc2BAll, THF/Et2O 1 : 1 2) aq. H2O2, DMF/MeOH O OAc R = H 104 OR R = CO(CH=CH2) 105 5 Äq. Acryloylchlorid, 5 Äq. NEt3, cat. DMAP, CH2Cl2 HO OAc O O 1) 40 mol% Hoveyda-Grubbs II 95, CH2Cl2, 45 °C, 24 h 2)HF/Pyridin, THF, 40 °C, 8 h 106 7 % (4 Stufen) Schema 15: Einsatz von Acetat als Schutzgruppe. Die Acylierung von 85 mit Acetanhydrid in Dichlormethan (Schema 15) konnte im FT-IR-Spektrum durch das Verschwinden der OH-Bande und gleichzeitiges Auftauchen einer Carbonyl-Bande bei 1746 cm-1 verfolgt werden. Die weitere Umsetzung zum Aldehyd 103 durch Ozonolyse und weiter zum Homoallylalkohol 104 mit d-Ipc2BAll verlief regulär. Nach der Acylierung mit Acryloylchlorid war jedoch festzustellen, dass sich das Harz mit dem immobilisierten Diester 105 44 Spezieller Teil nicht vollständig trocknen ließ. Weder mehrtägiges Trocknen im Hochvakuum noch mehrfaches azeotropes Destillieren mit Toluol waren erfolgreich. Dies könnte der Grund dafür sein, dass die anschließende Ringschlussmetathese mit dem Hoveyda-Grubbs II Katalysator 95 und/oder die anschließende Abspaltung nur unvollständig abliefen. Nach Aufreinigung über präparative HPLC konnte das Produkt in geringer Ausbeute (ca. 7 % nach vier Stufen, ausgehend vom Aldehyd 103) isoliert werden. Eine weitere Erklärung für die geringe Ausbeute könnte sein, dass die Acetylgruppe den Metathese-Katalysator durch Koordination chelatisierte und damit weiterem Umsatz entzog. Da letztlich die Ursache für den schlechten Ablauf der Reaktionssequenz am acetylierten Substrat nicht näher bestimmt werden konnte, wurde die Acetylierung von freien Hydroxygruppen, die als Zwischenstufen in der Reaktionsfolge auftraten, in dieser Arbeit nicht weiter verfolgt. 3.1.2.11 Höhere Homologe Mit der asymmetrischen Synthese immobilisierter Triole durch drei aufeinander folgende Ozonolyse- und Allylierungsschritte konnte die Vielseitigkeit der Methode weiter verdeutlicht werden. Die weitere Synthese ging von den Homoallylalkoholen 98 und ent-98 (Schema 16) aus. Das Substrat ent-98 wurde ausgehend von 79 durch doppelte Allylierung mit l-Ipc2BAll gewonnen. Die freien Hydroxygruppen in den Homoallylalkoholen 98 und ent-98 wurden erneut als TBS-Ether geschützt. Anschließend erfolgte eine weitere Ozonolyse zu den immobilisierten Aldehyden 107 und ent-107. Die nun folgende Allylierung wurde sowohl syn-selektiv (Schema 16, A) als auch anti-selektiv (B) durchgeführt. 45 Spezieller Teil O OR1 OR2 98 R1 = TBS, R2 = H 106 R1, R2 = TBS 5 Äq. TBDMSCl 5 Äq. Imidazol, cat. DMAP, DMF O H OR1 OR2 O 107 R1, R2 = TBS 1) O3, CH2Cl2, -78 °C 2) PPh3, CH2Cl2 O OR1 OR2 O 109 R1, R2 = TBS O HO OH OH O O 1) 5 Äq. l-Ipc2BAll, THF/Et2O 1 : 1 dann aq. H2O2, DMF/MeOH 2) 7 Äq. Acryloylchlorid, NEt3, cat. DMAP, CH2Cl2 111 26 % O OR1 OR2 ent -98 R1 = TBS, R2 = H ent -106 R1, R2 = TBS 5 Äq. TBDMSCl 5 Äq. Imidazol, cat. DMAP, DMF O H OR1 OR2 O ent -107 R1, R2 = TBS 1) O3, CH2Cl2, -78 °C 2) PPh3, CH2Cl2 O OR1 OR2 O 108 R1, R2 = TBS O HO OH OH O O 1) 5 Äq. l-Ipc2BAll, THF/Et2O 1 : 1 dann aq. H2O2, DMF/MeOH 2) 7 Äq. Acryloylchlorid, NEt3, cat. DMAP, CH2Cl2 110 A B 1) 40 mol% 95, CH2Cl2, 45 °C 2) HF/Pyridin, HF, 40 °C 1) 40 mol% 95, CH2Cl2, 45 °C 2) HF/Pyridin, HF, 40 °C 62'4'62'4' 3 % δ 110 111 C-6 72.6 74.8 C-2’ 69.9 68.0 C-4’ 72.7 72.6 Schema 16: Dreifache Allylierung an der festen Phase und Vergleich der charak- teristischen chemischen Verschiebungen im 13C NMR-Spektrum. Auf die Acylierung mit Acryloylchlorid folgte erneut der Ringschluss zum Lakton, für den in diesem Fall ausschließlich der Hoveyda-Katalysator 95 eingesetzt wurde. Mit zunehmender Komplexität der Verbindungen wurde auch die Aufarbeitung der Rohprodukte schwieriger. Das all-syn-Produkt 110 konnte trotzdem in hoher Isomerenreinheit gewonnen werden; das 1H NMR-Spektrum enthielt nur noch Spuren anderer Diastereomere. Die isolierte Ausbeute nach präparativer HPLC war mit 3 % allerdings sehr niedrig. Weitere Diastereomere konnten auch im 46 Spezieller Teil Chromatogramm der HPLC-Aufreinigung nicht detektiert werden, was für eine gute syn-Selektivität der asymmetrischen Allylierung an der festen Phase spricht. Hingegen konnte das syn-anti-Isomer 111 auch nach präparativer HPLC nur als Gemisch der bis zu acht möglichen Diastereomeren isoliert werden, in der das gewünschte Produkt zu ca. 70 % vorlag. Zwar war die Ausbeute (ausgehend von Aldehyd 107) hier höher, doch konnte auch in einem weiteren sorgfältigen chromatographischen Schritt an Kieselgel keine weitere Anreicherung eines Isomers erreicht werden. Eine eindeutige Unterscheidung der Produkte 110 und 111 konnte aufgrund der 13C NMR-Spektren getroffen werden. Die jeweiligen Resonanzen der Kohlenstoffatome 6, 2’ und 4’ sind in Schema 16 dargestellt. Mit der Synthese dieser beiden Substrate, die aus 4-Pentenol nach 12 Stufen an der festen Phase erhalten wurden, konnte gezeigt werden, dass über diese Syntheseroute die Zielstrukturen enantio- und diastereoselektiv gewonnen werden können. Dabei erwies sich außerdem die gewählte Anbindung der Edukte über einen Silyl-Linker an die feste Phase als stabil genug, auch mehrstufige Sequenzen zu überstehen. 3.1.2.12 Asymmetrische Allylierung und RCM in der Synthese von Naturstoffen Die erfolgreiche Etablierung der asymmetrischen Allylierung mit anschließender Ringschlussmetathese ist bis hierher an immobilisierten Substraten gezeigt worden, die in ihren Eigenschaften für die organische Synthese an fester Phase geeignet schienen, so dass lineare, unverzweigte Alkohole als Ausgangsmaterialien verwendet wurden. Nachfolgend sollte die entwickelte Sequenz in der Synthese von Naturstoffen und ihrer Derivate auf die Probe gestellt werden. Aus den bekannten Naturstoffen mit α,β-ungesättigter-δ-Lakton- Einheit wurden solche ausgewählt, die mit den Möglichkeiten der eingesetzten Reaktionen kompatibel waren. Dies waren Euscapholid 112,[80] Cryptocarya Diacetat 113[81] und das Lakton 114,[82] das aus Ravensara Anisata isoliert wurde (Abb. 18). 47 Spezieller Teil OH O O OAc O O 112 Euscapholid O O OHOAc 114 aus Ravensara Anisata OAc 113 Cryptocyrya Diacetat Abb. 18: Naturstoffe als Zielverbindungen. 3.1.2.13 Euscapholid Euscapholid 112 ist ein Naturstoff mit einer α,β-ungesättigten-δ-Lakton-Einheit, der aus Euscaphis japonica isoliert wurde.[80] Sein Enantiomer ist darüber hinaus ein Fragment des Naturstoffes Tarchonanthuslakton.[83-88] In einem dieser Arbeit angeschlossenen Projekt gelang Dr. Jayant D. Umayre die Synthese von ent- Euscapholide ent-112 an der festen Phase (Schema 17). O O O OH O O ent-112 ent-Euscapholid 44 % bezogen auf 117 syn:anti / 92 : 8 OH + COOEt OHOH O PS resin O O H 115 116 117 118 1) 115, Trichloracetonitril, DBU, CH2Cl2 2) 116, BF3 OEt2, Cyclohexan, CH2Cl2 3) DIBAL-H, THF, -78 °C, 16 h 4) 4 Äq. IBX, DMSO/THF 1 : 1, 16 h 1) d-Ipc2BAll, THF, dann aq. H2O2 2) Acryloylchlorid, NEt3, DMAP, CH2Cl2 3) 40 mol% 94, CH2Cl2, 45 °C 10 Äq. DDQ, CH2Cl2, pH 7 Puffer 0 °C bis RT Wang-Harz Schema 17: Synthese von Ent-Euscapholid an Wang-Harz. Dazu wurde kommerzielles (R)-Ethyl-3-hydroxybutyrat 116 an Wang-Harz 115 gekuppelt, welches zuvor mit Trichloracetonitril aktiviert worden war. Der immobilisierte Ester wurde mit DIBAL-H zum primären Alkohol reduziert und mit IBX zum Aldehyd 117 oxidiert. Die Aldehyd-Beladung betrug 0.4-0.5 mmol/g.[68] Asymmetrische Allylierung mit d-Ipc2BAll, Veresterung mit Acryloylchlorid und anschließende Ringschlussmetathese mit dem Grubbs II Katalysator 94 lieferten das Produkt ent-112, das nach Abspaltung vom Harz mit DDQ in 44 % Ausbeute und einem syn/anti-Verhältnis von 92 : 8 isoliert wurde. 48 Spezieller Teil 3.1.2.14 Synthese einer Cryptocarya Diacetat-Bibliohtek Der Naturstoff Cryptocarya Diacetat 113 (Abb. 18) wurde aus der Rinde des Baumes Cryptocarya latifolia isoliert[81] und enthält neben dem α,β-ungesättigten- δ-Lakton eine Pentyl-Kette mit zwei Acetoxygruppen, die jeweils in syn-Konfi- guration vorliegen. Diese Verbindung wurde als Ausgangspunkt gewählt, um eine stereochemisch diversifizierte Substanzbibliothek aufzubauen, d.h. alle Diastereomere des Naturstoffgerüstes zu synthetisieren. Diese Arbeit wurde von Dr. Ana B. García und Dr. Jayant D. Umayre im Rahmen ihres Postdoc- Aufenthaltes am Max-Planck-Institut für Molekulare Physiologie durchgeführt. Erneut nahm die Synthese ihren Ausgangspunkt in dem immobilisierten Aldehyd 117 (Schema 18), der außerdem auch in seiner enantiomeren Form ent- 117 eingesetzt wurde. Die Allylierung der Aldehyde mit jeweils beiden Enantiomeren von Ipc2BAll lieferte die Homoallylalkohole 119 und 120 und ihre Enantiomeren. Nach Testabspaltungen konnten durch Integration über die Signale der Methylgruppen im 1H NMR-Spektrum Diastereomerenverhältnisse von 90 : 10 im syn-Fall oder 87 : 13 im anti-Fall nachgewiesen werden. Auf die Schützung der Verbindungen als TBS-Ether folgte eine Ozonolyse der terminalen Doppelbindung, und die auf diese Weise generierten Aldehyde 121 und 122 wurden erneut mit beiden Enantiomeren von Browns Boran umgesetzt. Die so erhaltenen immobilisierten Triole wurden mit Acryloylchlorid verestert und mit dem Grubbs II Katalysator 94 in die α,β-ungesättigten-δ-Laktone überführt. 49 Spezieller Teil H OO ORO H O ORO H O OROH O O OROH O O OROH O O OROH O O Beladung ~ 0.5 mmol/g 1) Ipc2BAll, THF 2) TBSCl, Imid., DMAP, CH2Cl2 mit d-Ipc2BAllmit l-Ipc2BAll 4) Ipc2BAll, THF 5) Acryloylchlorid, DIPEA, DMAP 6) 40 mol% 94, CH2Cl2 7) DDQ, CH2Cl2 R = TBS R = TBS R = TBS OAcOAc O O 113 Cryptocarya Diacetat ent-117 121 122 125 40%, >80 : <5 : 13 : 2 124 126123 50%, 18 : 67 : 1 : 14 57%, 13 : 2 : 77 : 8 60%, 2 : 13 : 5 : 80 OROH O O OROH O O OROH O O OROH O O ent-125 42%, >85 : <5 : 7 : 3 ent -124 ent -126ent-123 65%, 27 : 63 : 6 : 9 50%, 13 : 2 : 63 : 22 42%, 2 : 13 : 10 : 75 analog dazu von 117: ORO ORO R = TBS R = TBS 119 120 3) O3, -78 °C, dann PPh3 Selektivität: syn/ ant i 85:15 syn/ ant i 13:87 Schema 18: Synthese aller diastereomeren Gerüste von Cryptocarya Diacetat 113 an Wang-Harz. Damit waren alle möglichen diastereomeren Konfigurationen des Grundgerüsts synthetisiert. Durch Variation der Abspaltungsbedingungen konnten unterschied- liche Endprodukte erhalten werden. Die Abspaltung mit DDQ in einem gepufferten System lieferte ausschließlich die TBS-geschützten Verbindungen 123-126 und ihre Enantiomere in 40-60 % isolierter Ausbeute. Für die Bestimmung der Diastereomerenverhältnisse konnte über die Signale der Methylgruppen im 1H NMR-Spektrum integriert werden, das Ergebnis ist in Schema 18 dargestellt. Es zeigte sich, dass das gewünschte Isomer in allen Fällen das Hauptprodukt war. 50 Spezieller Teil Wurde zur Abspaltung Trifluoressigsäure (TFA) eingesetzt, konnte neben der TBS-geschützten Verbindung auch das jeweilige freie Diol erhalten werden. Dieses konnte durch Acetylierung und chromatographische Aufreinigung in das reine Diastereomer des Naturstoffes 113 überführt werden. Im Rahmen dieser Arbeit konnte diese Synthese sogar noch weitergeführt werden (Schema 19): Ausgehend vom immobilisierten Ester 127 wurden zunächst analog zum in Schema 17 dargestellten Syntheseweg die dreifach oxygenierten und vollständig geschützten Nonene 128 und 129 am Wang-Harz aufgebaut. Die korrekte Bildung der gewünschten Reaktionsprodukte konnte in Testabspaltungen belegt werden; so wurde das bis-silylierte Triol 130 durch Abspaltung mit DDQ in 31 % Ausbeute erhalten. Das 1H NMR-Spektrum zeigte, dass 130 als Gemisch mit einem zweiten Diastereomer im Verhältnis 73 : 27 vorlag. Danach wurde der Zyklus von Ozonolyse und Allylierung nochmals durchlaufen, wobei jeder neu entstandene Aldehyd mit beiden Enantiomeren des Brown-Borans umgesetzt wurde. Die auf diese Weise erhaltenen vier neuen diastereomeren Homoallylalkohole wurden mit Acryloylchlorid verestert und mit dem Metathese-Katalysator 95 umgesetzt. Nach Abspaltung der Substanzen vom Wang-Harz mit DDQ ließ sich jedoch nur noch eines der Produkte (131) isolieren. Es wurde nach einem einzigen chromatographischen Schritt als einzelnes Diastereomer in insgesamt 2 % Ausbeute nach 14 Stufen an der festen Phase gewonnen. Dieses Molekül ist ein modifiziertes Diastereomer von Cryptocarya Triacetat 135.[81] 51 Spezieller Teil OEt OO ORO OR ORO OR R = TBS OROH OR O O 131 R = TBS 2 % OROH OR 130 127 7 Stufen 10 eq. DDQ DCM/Puffer 31 % ca. 73 % Hauptprodukt 1) O3, CH2Cl2, -78 °C, dann PPh3 2) d- oder l-Ipc2BAll 3) Acryloylchlorid 4) 40 mol% 95 5) DDQ 128 129 OROH OR O O 132 R = TBS 0 % OROH OR O O 133 R = TBS 0% OROH OR O O 134 R = TBS 0% OAcOAc OAc O O 135 Cryptocarya Triacetat Schema 19: Synthese eines Gerüst-Diastereomeren von Cryptocarya Triacetat durch dreifache asymmetrische Allylierung an Wang-Harz. In den anderen Fällen ließen sich keine signifikanten Mengen des jeweiligen Diastereomers von 131 im 1H NMR-Spektrum der Reaktionslösung nach Abspaltung detektieren. Die geringe Ausbeute kann mit der Labilität des Wang- Linkers gegenüber den oxidativen Bedingungen der Ozonolyse erklärt werden. Im Gegensatz zu den sonst in dieser Arbeit verwendeten Silyl-Linkern, die bei -78 °C mehrere Minuten lang auch in einer mit Ozon gesättigten Lösung stabil sind, stellte sich für den Wang-Linker heraus, dass hohe Ausbeuten nur nach möglichst kurzer Kontaktzeit des Harzes (ca. 1 min) mit Ozon zu erzielen waren. Angesichts der mehrfachen Ozonolysen, die für die Synthese von 131 nötig waren, gewann dieser Effekt an Relevanz. Zusammenfassend konnte mit diesen Arbeiten gezeigt werden, dass bis zu drei Allylierungen von immobilisierten Aldehyden möglich sind und die Methode zum Aufbau stereochemisch diverser Kohlenstoffgerüste geeignet ist. 52 Spezieller Teil 3.1.2.15 Synthese des Ravensara-Laktons Das Lakton 114 (Abb. 18) wurde 1999 aus der Rinde des Baumes Ravensara Anisata isoliert und zeigte eine schwach fungizide Aktivität gegen C. cucumerinum (MIC ~100 μg/ml).[82;89] Die zunächst angenommene absolute Konfiguration wurde später korrigiert, und im Laufe einer Synthese dieser Verbindung durch Ramana et al. konnte gezeigt werden, dass die Acetylgruppe durch intramolekulare Umlagerung beide Hydroxylgruppen besetzten kann.[90] Für die angestrebte Synthese dieser Verbindung bzw. der deacetylierten Form 136 an der festen Phase nach dem in dieser Arbeit entwickelten Allylierungs-/Metatheseprotokoll wurde der Homoallylalkohol (S)-137 (Schema 20) in möglichst enantiomerenreiner Form benötigt. Auch das Enantiomer (R)-137 wäre im Hinblick auf eine stereodiversifizierende Synthese wünschenswert. O O OHOAc 114 OH (S)-137 OH (R)-137 O O OAcOH aus Ravensara Anisata O O OHOH 136 Schema 20: Retrosynthetische Skizze zum Naturstoff 114. 3.1.2.15.1 Synthese der Edukte (S)-137 und (R)-137 Der enantiomerenangereicherte Baustein (S)-137 sollte durch enantioselektive Allylierung des Aldehyds 138 (s. Tabelle 5) in Lösung hergestellt werden. Hier bot sich die Keck-Allylierung an, bei der ein chiraler Titan-BINOL-Komplex den Aldehyd vor dem Angriff eines Allylstannans aktiviert.[91] Der Aldehyd 138 wurde durch PCC-Oxidation von 5-Phenylpentanol in 71 % Ausbeute gewonnen (Tabelle 5). Die Ergebnisse der daran anschließenden Versuche zur Keck-Allylierung sind in Tabelle 5 zusammengefasst. 53 Spezieller Teil H O 138 OH 71 % PCC CH2Cl2, 4 h OH (R)-137 H O 138 s. Tabelle 5 SnBu3+ Nr. Katalysator Lösungsmittel, Bedingungen Ausbeute(a) Enantiomeren- überschuss in (R)-137(b) 1 10 mol% Ti(OiPr)4, 20 mol% (S)-BINOL CH2Cl2, 23 °C, 5 h 49 % 89 %ee 2 10 mol% Ti(OiPr)4, 20 mol% (S)-BINOL CH2Cl2, 0 °C, 6 54 % 94 %ee 3 20 mol% Ti(OiPr)4, 40 mol% (S)-BINOL CH2Cl2, 0 °C, 5 h 64 % 95 %ee 4 10 mol% Ti(OiPr)4, 20 mol% (S)-BINOL CH2Cl2, -20 °C, 20 h 53 % 96 %ee 5 5 mol% Ti(OiPr)4, 10 mol% (S)-BINOL CH2Cl2, -25 °C, 46 h 15 % 91 %ee 6 1.25 mol% Ti(OiPr)4, 2.5 mol% (S)-BINOL Toluol, MS 4 Å, -15 °C, 70 h 48 % 80 %ee(c) 7 5 mol% Ti(OiPr)4, 10 mol% (S)-BINOL Toluol, MS 4 Å, -15 °C, 38 h 67 % 96 %ee Tabelle 5: Keck-Allylierung des Aldehyds 138. (a) isolierte Ausbeute, (b) bestimmt durch HPLC auf einer AD-Säule, (c) bestimmt durch Überführung in den Mosher-Ester. Die Bestimmung des Enantiomerenüberschusses in 137 gelang durch HPLC auf einer chiralen Daicel Chirapak AD-Säule (Abb. 19). Die als Kontrolle benötigte Verbindung rac-137 wurde aus dem Aldehyd 138 mit Allylmagnesiumchlorid in 91 % Ausbeute synthetisiert. 54 Spezieller Teil min0 5 10 15 20 25 mAU 0 10 20 30 40 50 DAD1 B, Sig=254,4 Ref=360,100 (TORBEN\TL350.D) A re a: 12 61 .33 1 8. 50 7 A re a: 21 .29 78 1 9. 65 5 min0 5 10 15 20 25 mAU -5 0 5 10 15 20 25 DAD1 B, Sig=254,4 Ref=360,100 (TORBEN\23090303.D) A re a: 70 0.5 62 1 8. 56 6 A re a: 68 3.5 23 1 9. 67 4 Abb. 19: Bestimmung des Enantiomerenüberschusses in 137. Oben: (R)-137, unten rac- 137. Chiralpak AD-Säule, Cyclohexan/Isopropanol 97 : 3, Flussrate 0.5 ml/min. Die Anwendung der von Keck et al. beschriebenen Bedingungen (10 mol% Titantetraisopropoxylat, 20 mol% BINOL) lieferten zwar hohe Enantiomeren- überschüsse von >90 % (Eintrag 1, 2, 4), aber nur geringe Ausbeuten um 50 %. Kurosu et al. veröffentlichten eine Variation der Reaktionsbedingungen, die mit 5 mol% Titantetraisopropoxylat und 10 mol% BINOL in Toluol in Anwesenheit von Molekularsieben (4 Å) bei hohen Enantiomerenüberschüssen (> 95 % für aliphatische Aldehyde) Ausbeuten von mehr als 80 % erreichten.[92] Zwar konnte die gute asymmetrische Induktion im Rahmen dieser Arbeit reproduziert werden, jedoch blieben die isolierten Ausbeuten weiterhin niedrig (Einträge 6, 7). Als schwerwiegender erwies sich aber die Beobachtung, dass sich ee-Werte von bis zu 96 %, die unter analytischen Bedingungen (< 2 mmol von Aldehyd 138) erreicht wurden, in größeren Ansätzen nicht reproduzieren ließen (Tab. 6, 1 vs. 3). 55 Spezieller Teil OH (R)-137 H O 138 5 mol% Ti(OiPr)4, 10 mol% (S)-BINOL Toluol, MS 4A, -15 °C SnBu3+ Nr. Ansatzgröße Zeit Ausbeute(a) Enantiomeren- überschuss in (R)-137(b) 1 2 mmol 38 h 67 % 96 % 2 10 mmol 38 h 51 % 91 % 3 27 mmol 64 h 40 % 50 % Tabelle 6: Keck-Allylierung des Aldehyds 138. (a) isolierte Ausbeute, (b) bestimmt durch HPLC auf einer AD-Säule. Während der z.T. langen Reaktionszeiten wurde eine Aufhellung der Reaktionslösung von dunkelrot nach gelb beobachtet, was für eine Zersetzung des BINOL-Katalysators spricht. Damit übereinstimmend war die Beobachtung, dass die Reaktion in den meisten Fällen nicht vollständig ablief und sich der Umsatz nach einer gewissen Zeit nicht mehr veränderte. Das Produkt der Allylierung war auch nach chromatographischer Aufreinigung des Reaktionsproduktes an Kieselgel noch gelblich, was auf einen Restgehalt an Katalysator schließen lässt. Mit dem von Maruoka et al. entwickelten binuklearen Katalysator 139 (Schema 21),[93;94] der in situ hergestellt wurde, konnten schließlich bei einer Substratmenge von 10 mmol 94 %ee erzielt werden. OH (R)-137 H O 138 10 mol% 139 CH2Cl2, -15 °C, 30 h SnBu3+ TiCl4 + 3 Ti(OiPr)4 4 TiCl(OiPr)3 Ag2O CH2Cl2 4 (S)-BINOL CH2Cl2 O O Ti O OTi O O O 2 139 O O Ti O OTi O O O 2 74 %, 94 %ee CH2Cl2 Schema 21: Maruoka-Keck-Allylierung des Aldehyds 138. Mit der von Nokami et al. entwickelten Transfercrotylierung[95] konnte ein noch effektiverer und selektiverer Weg zu den gewünschten Zielverbindungen gefunden werden. Bei dieser Methode wird ein vom Menthol abgeleitetes chirales 56 Spezieller Teil Auxiliar 140 eingesetzt, das einen Crotylrest über einen cyclischen Übergangszustand auf einen Aldehyd überträgt. Der Einsatz des Aldehyds 138 in dieser Reaktion ergab den Alkohol 141 in 70 % Ausbeute nach chromatographischer Aufreinigung (Schema 22). OH O H + PPTS, DCM, 18 h OH 70 % > 98 %ee 138 140 (S)-141 analog dazu mit ent-140 OH 66 % > 98 %ee (R)-141 Schema 22: Nokami-Transfercrotylierung des Aldehyds 138. Unter Verwendung der beiden Enantiomere des Auxiliars 141 (erhalten aus (+)- bzw. (-)-Menthon) konnten die Verbindungen (S)-141 und (R)-141 in sehr hoher Enantiomerenreinheit (>98 %ee, s. Abb. 20) erhalten werden. Die Produkte wurden auch im Multigramm-Maßstab ohne Verlust chiraler Information erhalten. OH (S)-141 OH (R)-141 Abb. 20: Bestimmung des Enantiomerenüberschusses der enantiomeren Alkohole (S)-141 und (R)-141 auf einer Chirapak AD-Säule. Cyclohexan/Isopropanol 98 : 2, Flussrate 0.5 ml/min. 3.1.2.15.2 Durchführung der Synthese Mit der Verfügbarkeit beider Enantiomere des Crotylalkohols 141 konnte die Synthese der Verbindung 136 und ihrer Stereoisomere an der festen Phase durchgeführt werden (Schema 23). Lithiiertes Brom-Polystyrol-Harz 74 wurde mit 57 Spezieller Teil Diethyldichlorsilan versetzt, um dem sterischen Anspruch des sekundären Alkohols (S)-141 zu begegnen. Wie die Massebilanz nach Abspaltung mit HF/Pyridin und ein HPLC-Assay des abgespaltenen Rohproduktes übereinstimmend zeigten, ließ sich (S)-141 mit 0.7 mmol/g auf das Harz laden. Die Ozonolyse der Doppelbindung lieferte einen Aldehyd, der mit dem syn- dirigierenden Reagenz l-Ipc2BAll umgesetzt wurde. Li OPS Harz PS Harz O OTBS O O OH OH O O 4 O 4 OH 4 142 143 136147 Beladung 0.6 g mmol-1 74 O 4 OTBS 145 OH OH 4 OH OH 4 OH OH HF/Pyridin THF HF/Pyridin THF HF/Pyridin THF 144 146 Si Et Et 1) Et2SiCl2, THF 2) (S)-141, 2, 6-Lutidin, DMAP, CH2Cl2 1) O3, -78 °C, dann PPh3 2) l-Ipc2BAll, THF/Et2O, dann aq. H2O2 1) TBSCl, Imid., DMAP 2) O3, -78 °C, dann PPh3 3) l-Ipc2BAll, THF/Et2O, dann aq. H2O2 1) Acryloylchlorid, NEt3, DMAP 2) 40 mol% 95 63 % 38 % OAc OH O O 114 Ac2O, NEt3, DMAP, CH2Cl2 Referenz 90 5 % bezogen auf 142 (9 Stufen) syn/ ant i 19:1 Schema 23: Synthese des Diols 136 durch zweifache asymmetrische Allylierung an der festen Phase. Eine Testabspaltung nach dieser Stufe zeigte, dass die Allylierung hoch diastereoselektiv abgelaufen war. Nach Überführung des Diols ins Acetonid mit 2,2-Dimethoxypropan konnte im GC-MS ein Diastereomerenverhältnis von 19 : 1 58 Spezieller Teil festgestellt werden. Die relative syn-Konfiguration des Abspaltungsproduktes 144 konnte durch die Auswertung des 125 MHz 13C NMR-Spektrums bestätigt werden. Wie in Schema 24 zu sehen ist, liegen die chemischen Verschiebungen der beiden Kohlenstoff-Atome des Acetonids genau im Bereich, der von Rychnowsky et al. als charakteristisch für ein syn-Diol beschrieben wird.[96] OH 4 OH 144 O 4 O 148 CH3H3C O O Cax Ceq H HMeO OMe cat. CSA 46 % syn/ant i 19 : 1 δ (13C), 125 MHz erwartet[96] gefunden Cax 19.66 ± 0.35 19.81 Ceq 30.00 ± 0.30 30.26 Δ( δC) 10.34 ± 0.30 10.45 Schema 24: Überführung des Diols 144 ins Acetonid und Vergleich mit Literaturwerten. Nach Schützung der Hydroxylgruppe als TBS-Ether wurde durch Ozonolyse erneut ein Aldehyd generiert. Dieser wurde durch Reaktion mit l-Ipc2BAll in den immobilisierten Homoallylalkohol 145 transformiert, der ebenfalls zu Testzwecken abgespalten wurde. Auch nach der zweiten Allylierung wurde ein hoch diastreomerenangereichertes Produkt erhalten, wie durch einen sauberen Signalsatz im 1H NMR-Spektrum angezeigt wurde. (Abb. 21). Abb. 21: 1H NMR-Spektrum des Triols 146. 59 Spezieller Teil Durch Veresterung von 145 mit Acryloylchlorid wurde die Vorstufe zur RCM erhalten. Der Ringschluss fand unter Verwendung von 40 mol% des Hoveyda- Grubbs II Katalysators 95 statt. Die Abspaltung vom polymeren Träger mit Fluorwasserstoff lieferte das vollständig entschützte Produkt 136, welches nach neun Stufen an der festen Phase in einer Gesamtausbeute von 5 % isoliert werden konnte. Aus dem Diol 136 lässt sich in einer weiteren Stufe der Naturstoff 114 synthetisieren (Schema 23).[90] Die 1H- und 13C-NMR Spektren von 114 stimmten mit den Literaturdaten von Ramana überein.[90] Ein Vergleich der Drehwerte zeigte weitgehende Übereinstimmung auf: das synthetisierte Produkt 136 hatte einen Drehwert von [α] = +48.4 ° (c 1.0, CHCl20D 3) auf, während Ramana et al. [α] = +62.1 ° (c 1.0, CHCl25D 3) berichteten. Um zu zeigen, dass diese Differenz nicht von einer abweichenden Konfigu- ration herrührt, konnte zum Vergleich die Verbindung 150 hinzugezogen werden, deren Synthese analog zu 136 verlief, jedoch ausgehend vom enantiomeren Homocrotylalkohol (R)-141 ausging (Schema 25). Die Stereozentren wurden einmal syn-dirigierend mit d-Ipc2BAll und einmal anti-dirigierend mit l-Ipc2BAll aufgebaut. OH OH O 150 O O 4 ent-142 O 4 OTBS 149 OH 1) Acryloylchlorid, NEt3 2) 40 mol% 95 3) HF/Pyridin 62'4' 3 % δ (13C) C-6 C-2’ C-4’ 136 (Lit.-Werte)[90] 76.2 69.5 72.7 136 76.3 69.8 72.9 150 74.7 68.1 73.0 Schema 25: Synthese des Naturstoff-Derivats 150 und Vergleich der charakteristischen 13C-Verschiebungen der Verbindungen 136 und 150 mit Literaturwerten. Veresterung mit Acryloylchlorid, Ringschlussmetathese und Abspaltung mit Fluorwasserstoff lieferten das Produkt 150 in insgesamt 3 % Ausbeute. Im 13C NMR-Spektrum des Produktes 150 zeigten die Kohlenstoff-Atome 6, 2’ und 4’ Resonanzen, die eine Abweichung Δ> 1.5 ppm zu den in der Literatur für das all- syn-Produkt berichteten Werten aufweisen. Hingegen stimmen die Werte für das 60 Spezieller Teil mit zwei syn-dirigierenden Allylierungen hergestellte Produkt 136 gut überein, die Differenz beträgt Δ< 0.3 ppm. 3.1.2.16 Biologische Evaluierung 3.1.2.16.1 Phosphatase-Assays In der medizinischen Wirkstoffsuche lag ein Schwerpunkt in den letzten Jahren auf der Suche nach Kinase-Inhibitoren. Die physiologischen Komplemente der Kinasen, die Phosphatasen, rücken hingegen erst in jüngster Zeit in den Fokus der medizinischen Forschung.[97] Die Naturstoffe Fostriecin 8 und Cytostatin[98;99] beziehen ihre biologische Aktivität aus der selektiven Inhibition der Phosphatase PP2A.[16;19;100] Da das α,β-ungesättigte-δ-Lakton im Falle von Fostriecin und Cytostatin für die Inhibition unerlässlich ist, weil es vermutlich als Michael- Akzeptor eines Cysteins im aktiven Zentrum der Phosphatase fungiert, lag es nahe, die in dieser Arbeit synthetisierten α,β-ungesättigte-δ-Laktone ebenfalls auf die Inhibition von Phosphatasen zu testen. Diese Arbeiten wurden von H. Rimpel am Max-Planck-Institut für Molekulare Physiologie durchgeführt. Alle Naturstoffabgeleiteten Verbindungen wurden in einem in vitro-Assay auf Inhibition der Serin/Threonin-Phosphatase PP1, den Tyrosin-spezifischen Phosphatasen PtP1B, MPtPA, MPtPB und PtP-SHP2 sowie den dual-spezifischen Phospha- tasen Cdc25a und VHR getestet. Dabei wurde die Hydrolyse von para- Nitrophenylphosphat, durch Messung der Absorption des freigesetzten Phenolat- Anions verfolgt (Schema 26). O2N O P O - O- O O2N O -Phosphatase 151 152 Absorptionsmaximum bei 405 nm Schema 26: Prinzip der Phosphatase-Assays zur Untersuchung der synthetisierten Substanzen. In einem Screen konnte in keinem Fall ausreichende Inhibition gefunden werden, die die Bestimmung eines IC50-Wertes aussichtsreich erscheinen ließ. 61 Spezieller Teil 3.1.2.16.2 Tubulin-Polymerisation In einem zweiten Assay zur Untersuchung der biologischen Aktivität wurden die Verbindungen in einem Phänotyp-Assay eingesetzt, der Veränderungen des Cytoskeletts detektiert. Angesichts der bekannten Interaktion von Pironetin 10 mit α-Tubulin (s. Kap. 1.3.3) könnte es hier zu interessanten Ergebnissen kommen. Diese Untersuchungen wurden in der Gruppe von Dr. Thomas Mayer am Max- Planck-Institut für Biochemie in Garching durchgeführt. Ergebnisse lagen bei Drucklegung dieser Arbeit noch nicht vor. 3.1.2.17 Diskussion Die in diesem Abschnitt vorgestellte Syntheseroute führte zuverlässig zu Verbindungen, welche die gewünschte α,β-ungesättigte δ-Laktoneinheit trugen. Es konnte gezeigt werden, dass sich die gewünschten Zielstrukturen an der festen Phase mit hoher Stereoselektivität synthetisieren lassen. Dabei konnten unter Einsatz der Brown-Allylborane an achiralen, immobilisierten Aldehyden Enantiomerenverhältnisse von bis zu 95.5 : 4.5 erzielt werden. Wurde eine iterative Reaktionsführung gewählt, wurden Diastereoselektivitäten von bis zu 19 : 1 im Fall von syn-1,3-Diolen erreicht. Damit konnte gezeigt werden, dass die asymmetrische Allylierung mit chiralen Allylboranen zum Aufbau von einem oder mehreren stereogenen Zentren an immobilisierten Substraten geeignet ist. Durch Variation der enantiomeren Allylborane lassen sich in einer iterativen, kombinatorischen Sequenz aus einer gemeinsamen Vorstufe schnell stereochemisch differenzierte Verbindungsbibliotheken aufbauen, die die Produkte des Polyacetatwegs (bzw. unter Hinzunahme der analogen enantioselektiven Crotylierung auch des Polypropionatwegs) der Biosynthese nachahmen. Dies wird in dieser Arbeit exemplarisch an der Synthese α,β- ungesättigter δ-Laktone demonstriert, die ein häufig zu findendes Motiv in Naturstoffen darstellen. Der in dieser Arbeit hauptsächlich eingesetzte Silyl-Linker bietet die attraktive Möglichkeit, die Substrat-Abspaltung parallel zur Entschützung aller übrigen Hydroxyfunktionen durchzuführen. Dadurch muss nach Abspaltung nur noch das 62 Spezieller Teil Endprodukt aufgereinigt werden. Auf diese Weise konnte die decacetylierte Version eines aus Ravensara Anisata gewonnenen Laktons über 9 Stufen mit 5% Ausbeute synthetisiert werden. Dies entspricht einer Ausbeute von 72% pro Stufe. Der alternative Einsatz des Wang-Linkers erlaubte die Abspaltung der Substrate ohne parallele Entschützung. Die Substrate stünden in diesem Fall weiteren Transformationen zur Verfügung. Insgesamt konnten mit der vorgestellten Synthesesequenz bis zu 14 Stufen an der festen Phase durchgeführt werden, darunter 3 asymmetrische Allylierungen. Das Endprodukt wurde nach einem einzigen Aufreinigungsschritt an Kieselgel erhalten. Eine der organischen Synthese an der festen Phase inherente Eigenschaft ist, dass sich Nebenprodukte, die auf dem Syntheseweg entstehen, nicht abtrennen lassen. Dies wirkt sich auf die in dieser Arbeit vorgestellte iterative Sequenz asymmetrischer Allylierungen insofern aus, als das die als Nebenprodukte entstehenden Diastereomere der Zielverbindungen sich nur auf der letzten Stufe chromatographisch abtrennen lassen, was angesichts der geringen strukturellen Unterschiede problematisch sein kann. Ein zweiter Nachteil dieser Syntheseroute ist die große Menge an RCM- Katalysator, der für vollständigen Umsatz benötigt wird. Durch Einsatz der reaktiven Metathese-Katalysatoren der zweiten Generation konnte zwar auf die Zugabe von Additiven wie Titantetraisopropylat verzichtet werden, jedoch mussten mindestens 40 mol% des Metathese-Katalysators eingesetzt werden. Dies macht die Anwendung der RCM an der festen Phase nicht nur zu einem teuren Schritt (2 g des Grubbs II Kats kosten z.Zt. bei ALDRICH 574 EUR), sondern verschärft zusätzlich die Frage nach der Abtrennung des Katalysators von den Endprodukten. Ruthenium-Verbindungen zeigen ein breites biologisches Profil;[101] und bestimmte Ruthenium-Komplexe können die Polymerisation von Tubulin in vitro inhibieren, wie Denium et al. zeigten.[102;103] Andererseits konnten Meggers et al. vor kurzem zeigen, dass Ruthenium(II)-Sandwhich-Komplexe mit labilen Liganden wie Cyclooctaydien ohne toxische Nebenwirkungen in Zellen eingeschleußt werden können.[104] Durch z.T. mehrfache chromatographische Aufreinigung konnten die meisten hier vorgestellten Substanzen als farblose Öle 63 Spezieller Teil erhalten werden, so dass alle Ruthenium-Rückstände beseitigt wurden. Für die anderen Fälle sollte die biologsche Evaluierung unter Berücksichtigung dieses Aspektes durchgeführt werden. 64 Spezieller Teil 3.1.3 Route II: Hetero-Diels-Alder Reaktionen an der festen Phase 3.1.3.1 Einleitung Alternativ zur im vorigen Abschnitt beschriebenen Allylierungs/RCM-Sequenz können α,β-ungesättigte δ-Laktone auch über eine zweite Route an der festen Phase hergestellt werden. Diese von Dr. Michele Leuenberger am Max-Planck- Institut für Molekulare Physiologie entwickelte Strategie an der festen Phase beruht auf einer Oxa-Diels-Alder-Reaktion, die von Kalesse et al. in der Total- synthese von (+)-Ratjadon (Abb. 22) eingesetzt wurde.[105;106] O OH O O OH O OMe OEt O O OMe OEt O H + (+) Ratjadon 153SSyn19.cdx A 155154 [Ti(BINOL)] Abb. 22: Retrosynthetische Schnitte für (+) Ratjadon nach Kalesse et al. Das Fragment A kann in drei Stufen aus dem 1,3-cis substituierten Ketal 153 synthetisiert werden, welches wiederum das Produkt einer endo-selektiven [4+2] Cycloaddition von 1-Methoxy-1,3-butadien 154 und Ethylglyoxylat 155 darstellt. Die asymmetrische Induktion wurde von Kalesse et al. durch die Ver- wendung eines chiralen Titan-Binolat-Komplexes erreicht,[107] der von Mikami[108] und Keck[109] in ähnlichen Cycloadditionen eingesetzt wurde. Das Interesse an verschieden substituierten α,β-ungesättigten δ-Laktonen ließ einen Transfer der hetero-Diels-Alder-Reaktion an die feste Phase attraktiv erscheinen. Der Syntheseplan (Schema 27, A) sah vor, die Dienkomponente an einem geeigneten polymeren Träger zu immobilisieren. Unter Verwendung des Wang-Linkers würde ein Dien entstehen, das dem Benzyloxybutadien 158 (Schema 27, B) ähnelt, das von Jacobsen et al. in der Synthese von Fostriecin 8 eingesetzt wurde.[21] Mit dem von Jacobsen et al. entwickelten und eingesetzten Chrom(II)-Katalysator 159 wurde eine Reihe von Aldehyden in der hetero-Diels- Alder-Reaktion mit sehr hohen Enantiomerenüberschüssen umgesetzt.[110] 65 Spezieller Teil Das Produkt der hetero-Diels-Alder-Reaktion an der festen Phase ist das Ketal 157, das zunächst an der Ester-Seitenkette weiter derivatisiert werden kann und anschließend unter sauer-oxidativen Bedingungen vom polymeren Träger abgespalten wird. O O OEt O H + O + O H TIPS O O TIPS ON Cr O Cl 3 mol% 36 h, RT 90 %, 89 %ee O O O O OEt O Chiraler Katalysator Abspaltung unter sauer-oxidativen Bedingungen Diversifizierung unter basisch- nukleophilen Bedingungen A B 155 157 156 158 159 Schema 27: A Allgemeines Syntheseschema für eine Bibliothek von Laktonen an der festen Phase; B Jacobsens Katalysator in der Totalsynthese von Fostriecin Die von Dr. Michele Leuenberger durchgeführten Versuche zur enantioselektiven Addition des immobilisierten Diens 156 an den Aldehyd 155 zeigten, dass der von Kalesse et al. beschriebene Titan-Binol-Katalysator für die Reaktionen an der festen Phase prinzipiell geeignet ist (Schema 28). Jedoch mussten die Reaktionsbedingungen für den Einsatz polymergebundener Substrate modifiziert werden, wie häufig der Übertragung einer Reaktion aus der Lösung an die feste Phase: Statt 12 mol% des Katalysators, wie von Kalesse et al. für die Reaktion in Lösung berichtet, mussten 50 mol% Titantetraisopropoxylat und 100 mol% (R)-BINOL eingesetzt werden. Ein größerer Überschuss des Dienophils (mindestens 10 Äquivalente) war ebenfalls notwendig. Auch dauerte die Reaktion am immobilisierten Dien länger: statt 2.5 h bei -30 °C in Lösung wurden mindestens fünf Stunden bei -30 °C benötigt, um sowohl akzeptable Umsätze als auch hohe Enantioselektivitäten zu erreichen. Nach diesen Anpassungen lag die Ausbeute nach Abspaltung mit dem Jones-Reagenz bei maximal 40 %. Das Enantiomerenverhältnis im Cycloaddukt konnte bereits direkt nach Abspaltung aus dem Rohprodukt 162 bzw. 163 mittels Gaschromatographie auf einer chiralen Lipodex E-Säule bestimmt werden. Es konnten z.T. Enantiomerenüberschüsse von über 90 % erzielt werden. Durch Oxidation des 66 Spezieller Teil Intermediates 153 aus der Ratjadon-Synthese von Kallesse et al. und Vergleich des Drehwertes mit dem von 162 konnte außerdem belegt werden, dass die hetero-Diels-Alder-Reaktion an der festen Phase den gleichen stereochemischen Verlauf nimmt wie in Lösung. An dieser Stelle der Synthesesequenz wurden folgende Beobachtungen gemacht, die eine weitere Optimierung sinnvoll erscheinen ließen: • Das Enantiomerenverhältnis im Cycloaddukt 157 war nicht konstant. Die erreichten Enantiomerenüberschüsse schwankten stark. • Die oben berichteten Enantiomerenüberschüsse von mehr als 90 % konnten nur erreicht werden, wenn eine geringe Menge des polymergebundenen Diens 156 eingesetzt wurde. Bei mehr als 500 mg eingesetzten Harzes ging die Enantioselektivität auf Werte um 40 %ee zurück. Für eine breite Diversifizierung wurde das polymergebundene Cycloaddukt 157 aber im Multigramm-Maßstab benötigt. R1 O O OEt O H + 0.5 eq. Ti(OiPr)4, 1 eq. (R)-BINOL DCM, -30 °C O O OEt O 155 R1 156 R1 = H 160 R1 = Me O O R2 OR1 O O H 166 O O O 167 R3 2 Stufen 162 R1= H: ca. 40 % Ausbeute, 30-95 %ee 163 R1= Me: ca. 15 % Ausbeute, syn/anti > 95 : 5 47 %ee O O OEt OR1 CrO3, H2SO4 Aceton 2 Stufen A B 157 R1 = H 161 R1 = Me 164R1 = H 165R1 = Me R2= OR', NHR' Schema 28: Synthese einer Bibliothek von α,β-ungesättigten-δ-Laktonen an der festen Phase (M. Leuenberger). Weiterhin konnte gezeigt werden, dass verschiedene Möglichkeiten der Diversifizierung bestehen. Ausgangspunkte hierfür waren die Produkte der Cyclo- addition 157 und 161 (Schema 28): Hydrolyse der Ethylester mit Lithiumhydroxid lieferte die immobilisierten Säuren, die in einer nucleophilen Substitution mit 67 Spezieller Teil aktivierten Halogeniden Ester ausbilden konnten oder nach PyBOP-Aktivierung mit Aminosäuremethylestern gekoppelt werden konnten (Weg A). Zudem konnte durch Reduktion des Ethylesters 157 und Reoxidation mit IBX der Aldehyd 166 erhalten werden (Weg B), der mit sieben unterschiedlichen Wittig-Yliden zu den Olefinen 167 umgesetzt wurde. Insgesamt konnte M. Leuenberger eine Bibliothek von 48 Substanzen synthetisieren. Dabei wurden nach Abspaltung vom polymeren Träger Gesamt- ausbeuten von 1-16 % für die Ester und Amide 164/165 und < 10 % für die Wittig- Produkte 167 erhalten. Im Rahmen dieser Arbeit sollte versucht werden, die hetero-Diels-Alder- Reaktion an der festen Phase weiter zu entwickeln. Insbesondere sollte dabei die Reproduzierbarkeit der erreichten Stereoselektivitäten in der hetero-Diels-Alder- Reaktion verbessert werden. Das Ziel war dabei, einen möglichst hohen Enantiomerenüberschuss im Cycloaddukt 157 in Ansatzgrößen >2 mmol zu erreichen. Außerdem wurde angestrebt, weitere Derivatisierungsmöglichkeiten zu finden, insbesondere solche, in denen neue C-C-Bindungen in der Seitenkette geknüpft werden können. 3.1.3.2 Untersuchung der hetero-Diels-Alder-Reaktion 3.1.3.2.1 Synthese der immobilisierten Diene Die am Trägerharz immobilisierten Diene 156 und 160 konnten in einer kurzen Synthesesequenz erhalten werden (Schema 29). Wässriger Salzsäure öffnete die Ketale in kommerziell erhältlichem 1,1,3,3-Tetramethoxypropan 168. Der auf diese Weise entstehende Propiondialdehyd wurde als Natriumsalz des Enolats 169 gefällt. Dieses wurde durch nukleophile Substitution an Brom-Wang- Harz immobilisiert. Nach zwei Beladungszyklen konnte durch Titration mit 2,4- Dinitrophenylhydrazin[111] eine Beladung von 0.7-1.0 mmol/(g Harz) bestimmt werden, was einer Ausbeute von 40-60 % entspricht. Eine starke Bande des Aldehyds im FT-IR-Spektrum bei 1683 cm-1 zeigte zudem die erfolgreiche Beladung an. 68 Spezieller Teil MeO OMe OMe OMe NaO H O HCl, H2O 169168 39 % Br O Brom-Wang-Harz 1.7 mmol/g DMF O R O OH RCH2PPh3Br n-BuLi THF 170 156 R = H 160 R = Me0.7 - 1.0 mmol/g Schema 29: Synthese der immobilisierten Diene 156 und 160. Durch Einsatz verschiedener Wittig-Salze konnte bereits auf dieser Stufe der Synthese diversifiziert werden. Der Aldehyd 170 wurde in einer Wittig-Reaktion in das unsubstituierte Dien 156 und das 4-Methylsubstituierte Dien 160 überführt. Die Reaktion ließ sich durch das Verschwinden der Aldehyd-Bande im FT-IR- Spektrum verfolgen. Auf die Synthese der Diene 156 und 160 konnte nun die in dieser Arbeit beabsichtigte eingehende Untersuchung der enantioselektiven hetero-Diels-Alder-Reaktion an der festen Phase erfolgen. 3.1.3.3 Versuche mit Titan-BINOL-Katalysatoren Die Untersuchung der hetero-Diels-Alder-Reaktion an der festen Phase begann mit den bereits beschriebenen Bedingungen. Der Ablauf der Reaktion ist in Schema 30 gezeigt. Dabei wurde der Katalysator durch einstündiges Rühren von Titantetraisopropoxylat und (R)-BINOL unter Rückfluss in situ hergetellt und dann bei -30 °C zu dem in DCM gequollenen Dien 156 gegeben. Bei dieser Temperatur wurde das frisch destillierte Ethylglyoxylat 155 über einen Zeitraum von 3 Stunden zugegeben. Nach einer Reaktionszeit von insgesamt 15- 20 Stunden wurde die Reaktion aufgearbeitet. Ein Teil des Harzes wurde für eine Testabspaltung abgenommen und der ee-Wert des Produktes 162 mittels GC auf einer chiralen Lipodex E–Säule bestimmt. O O O OEt O O H O OEt + 50 mol% Ti(OiPr)4 100 mol% (R)-BINOL DCM, -30 °C 156 157 O OEt O O 162 CrO3, H2SO4 Aceton, 3 h 155 Schema 30: Allgemeiner Ablauf der hetero-Diels-Alder-Reaktion. In einer Reihe von Experimenten konnte zunächst gezeigt werden, wie stark die erzielten Enantiomerenüberschüsse in der Reaktion von Lösungsmittel und Vorbereitung des Katalysators abhingen. Wie in Tabelle 7 zu sehen ist, konnten 69 Spezieller Teil mit dem Dien 156 Enantiomerenüberschüsse erzielt werden, die zwischen 29 und 87 % schwankten (Einträge 1 und 3). Da in diesen Versuchen das Dien 156 aus unterschiedlichen Ansätzen stammte, wurden in Einträgen 4 und 5 die zwei Chargen des Diens 156 miteinander verglichen, indem sie unter identischen Bedingungen mit derselben Katalysatorlösung umgesetzt wurden. Nr. Bedingungen Selektivität 1 50 mol% Ti(OiPr)4, 100 mol% (R)-BINOL 29 %ee 2 50 mol% Ti(OiPr)4, 100 mol% (R)-BINOL 47 %ee 3 50 mol% Ti(OiPr)4, 100 mol% (R)-BINOL 87 %ee 4 50 mol% Ti(OiPr)4, 100 mol% (R)-BINOL 53 %ee 5 50 mol% Ti(OiPr)4, 100 mol% (R)-BINOL 47 %ee Tabelle 7: Untersuchung der hetero-Diels-Alder-Reaktion (Reaktionsbedingungen: Schema 30) unter Variation des eingesetzten Diens. Dabei stellte sich heraus, dass die erzielten Stereoselektivitäten zwar leicht schwankten, in diesem Fall um einen Wert von 50 %ee, dass aber innerhalb eines Parallelexperiments reproduzierbare Werte erhalten wurden. Damit war gezeigt, dass die allgemeinen Reaktionsbedingungen, z.B. die Vorbereitung des Katalysators, die Reaktionsführung etc., einen größeren Einfluss auf die Selektivität der Reaktion hatten als das eingesetzte Dien. Um dieser Beobachtung Rechnung zu tragen, wurde bei allen weiteren Optimierungen stets eine Kontrolle durchgeführt, für die das Harz in DCM mit 50 mol% Ti(OiPr)4 und 100 mol% BINOL umgesetzt wurde. Auf diese Weise sollten die anderen Reaktionsparameter relativ zu den Standardbedingungen variiert wrden. 70 Spezieller Teil 3.1.3.3.1 Variation des Lösungsmittels Das Ethylglyoxylat 155 ist kommerziell als Lösung in Toluol (ca. 50 %) erhältlich, um vollständige Polymerisation zu vermeiden. Dennoch liegt es teilweise als Polymer vor, weswegen es vor Einsatz in der hetero-Diels-Alder-Reaktion bei 80 °C depolymerisiert und anschließend destillativ vom Toluol getrennt werden muss. Da im Destillationsprodukt über 1H NMR-Spektroskopie noch Rückstände von Toluol detektiert werden konnten, sollte der Einfluss von Toluol auf den Umsatz und Enantioselektivität der Cycloaddition untersucht werden. Außerdem wurde angenommen, dass evtl. Wasser aus unzureichend getrockneten Lösungsmitteln den Katalysator partiell hydrolysieren und damit einen (potentiell) racemischen zweiten Reaktionspfad öffnen könnte. Die Einflüsse der verschiedenen Lösungsmittel auf die Selektivität der Reaktion sollten im Folgenden untersucht werden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 dargestellt: Nr. Lösungsmittel Selektivität 1 DCM + Toluol aus Glyoxylat-Lösung 65 %ee 2 DCM/Toluol 1 : 1 48 %ee 3 DCM/H2O 10 : 1 24 %ee 4 DCM, Toluol-frei 78 %ee Tabelle 8: Untersuchung des Lösungsmittel-Einflusses auf die hetero-Diels-Alder-Reaktion- Raktion (Schema 30). In einer Serie von Experimenten wurde die hetero-Diels-Alder-Reaktion in verschiedenen Lösungsmittelmischungen durchgeführt. In Dichlormethan, welches noch Toluol aus der Gyloxlyat-Lösung enthielt (Tab. 8 Eintrag1), wurde mit 65 % ein höherer Enantiomerenüberschuss erzielt als in einer 1 : 1 Mischung aus Dichlormethan und Toluol (Eintrag 2) und in Dichlormethan, das mit 10 % Wasser versetzt war. (Eintrag 3). Sorgfältige Destillation des Ethylglyoxylats führte zu Toluol-freien Bedingungen, die sich als überlegen erwiesen (78 %ee, Eintrag 4). Es musste also möglichst Toluol- und Wasser-frei gearbeitet werden. Als weitere Variation des Lösungsmittels wurde Dichlorethan eingesetzt. Wie sich in einem Parallelexperiment herausstellte (Tab. 9), sank der ee-Wert beim Übergang von DCM auf DCE von 75 auf 48 %ee. 71 Spezieller Teil Nr. Lösungsmittel Selektivität 1 DCM 75 %ee 2 DCE 48 %ee Tabelle 9: Einfluss von DCE auf die hetero-Diels-Alder-Reaktion (Schema 30). 3.1.3.4 Variation des Katalysators 3.1.3.4.1 Hydrierung des Liganden Im Rahmen einer Untersuchung der hetero-Diels-Alder-Reaktion in Lösung berichteten Jiang et al., dass die Enantioselektivität bei der Cycloaddition des Danishefsky-Diens (1-Methoxy-3-(trimethylsilyloxy)-1,3-butadien) an Benzaldehyd verbessert werden konnte, wenn der partiell hydrierte BINOL-Ligand 168 eingesetzt wurde. Insgesamt konnte ein Anstieg von 87 %ee auf 97 %ee beobachtet werden.[112] Es erschien daher interessant, auch die hetero-Diels- Alder-Reaktion an der festen Phase mit diesem Liganden zu testen. Die Hydrierung von (R)-BINOL zu (R)-H8-BINOL 168 wurde nach einem Protokoll von Börner et al.[113] durchgeführt (Schema 31). Anstelle der für solche Reaktionen oft eingesetzten Platinoxid-Katalysatoren,[114] die wegen der Gefahr der Racemi- sierung des Substrats nur bei Raumtemperatur und niedrigen H2-Drücken einge- setzt werden können, gelang hier die Hydrierung bei 55 atm Wasserstoff in Gegenwart von 7 mol% Palladium auf Aktivkohle in 87 % Ausbeute nach chroma- tographischer Aufreinigung. Der Drehwert von 168 [α]D = 48.0 °(c 1.07, CHCl3) lag nah am Literaturwert[114] von 52.8 °(c 1.1, CHCl3). OH OH 168 OH OH Pd/C, 55 atm H2, EtOH, 70 °C 87 % Schema 31: Hydrierung des BINOL-Liganden. Der Einsatz des Liganden 168 in der Cycloaddition konnte aber keine Verbesserung bringen; im Gegenteil: in einem Parallelexperiment wurden mit (R)- BINOL 74 %ee erzielt, mit (R)-H8-BINOL aber nur 19 %ee (Tab. 10). 72 Spezieller Teil Nr. Katalysator Selektivität 1 50 mol% Ti(OiPr)4, 100 mol% BINOL 74 %ee 2 50 mol% Ti(OiPr)4, 100 mol% 168 19 %ee Tabelle 10: Vergleich von BINOL-Liganden in der hetero-Diels-Alder-Reaktion (Schema 30). 3.1.3.4.2 Kupfer-basierte Katalysatoren Da Kupfer(II)-Komplexe mit chiralen 2,2-bis-(Oxazolidin-2-yl)-propan-Liganden[115] (sog. „Box“-Liganden, Abb. 23) in den asymmetrischen Varianten von Alder-En- Reaktionen[116] sowie Diels-Alder Reaktionen[117] und hetero-Diels-Alder- Reaktionen mit inversem Elektronenbedarf[43] sehr gute Enantioselektivitäten einbrachten, wurden diese Katalysatoren auch im Rahmen dieser Arbeit in Betracht gezogen. N OO N N OO N t-Bu t -Bu 169 170 Abb. 23: Struktur der „Box“-Liganden. So erzielten Ghosh et al. in einer Glyoxylat-Diels-Alder-Reaktion mit dem Danishefsky Dien und dem Kupfer(II)-Komplex des Liganden 169 eine Selektivität von 72 %ee.[118] In weiteren Studien untersuchten Jørgensen et al. die enantioselektive Glyoxylat-Addition an Cyclohexadien und erreichten hier Enantioselektivitäten von über 97 %ee.[119] Der Aufbau einer Verbindungsbibliothek an der festen Phase durch Schreiber et al.[43] sowie verwandte Arbeiten von Kurosu et al.[120] zeigten, dass die chiralen Kupferkomplexe prinzipiell mit der organischen Synthese an der festen Phase kompatibel waren. Die zwei chiralen Bis(oxazolin)-Liganden, mit denen Schreiber und Kurosu an der festen Phase hohe ee-Werte erreichen konnten, wurden für diese Arbeit in betracht gezogen: „Indabox“ 169 und „tert.-Bu-Box“ 170. Während 170 kommerziell erhältlich ist, wurde der „Indabox“-Ligand in zwei Stufen synthetisiert 73 Spezieller Teil (Schema 32):[120] Zunächst wurde 3-Amino-2-indanol mit Dimethylmalonat gekoppelt, dann erfolgte ohne Isolierung der Zwischenstufe 171 die Kondensation zum heterozyklischen System in siedendem Titantetraisopropoxylat. N OO N OH NH2 Cl Cl O O OH HN HO NH O O 2 NEt3 CH2Cl2 0 °C Ti(OiPr)4 145 °C, 4h 83% (2 Stufen) + 169 169 170 171 Schema 32: Synthese des Indabox-Liganden 167. Die prinzipielle Möglichkeit, mit den Cu-Box-Katalysatoren in der Glyoxylat- Diels- Alder-Reaktion asymmetrische Induktionen zu erzielen, konnte in Lösung gezeigt werden (Schema 33). Dazu wurde 1-Methoxybutadien 154 bei 0 °C mit einer Lösung des Katalysators 172 und des Ethylglyoxylats in THF umgesetzt. Nach Oxidation zum Lakton 162 mit dem Jones-Reagenz konnte der Enantiomeren- überschuss bestimmt werden: wie die GC-Analyse zeigte, war das (S)- Enantiomer mit 88 %ee gebildet worden. Allerdings war die niedrige Ausbeute von 28 % über zwei Stufen ein Hinweis auf eine nur geringe Aktivität des Katalysators 172 in der Reaktion. O O O OEt O O H O OEt + 4 mol%172 THF, 0 °C 154 153 O OEt O O (S)-162 CrO3, H2SO4 Aceton, 3 h Cu(OTf)2 N OO N t-Bu t-Bu N OO N t-Bu t-Bu Cu TfO OTf THF RT + 172 28 % (2 Stufen) 88 %ee 170 155 Schema 33: Einsatz des tert.-butyl-Box-Liganden 168 in der Gyloxylat-Diels-Alder- Reaktion. Der stereochemische Ausgang der Reaktion mit dem Katalysator 172 kann mit einem Verlauf über einen Übergangszustand erklärt werden, der in Abb. 24 74 Spezieller Teil skizziert ist: Das Glyoxylat bildet einen Chelat-Komplex mit dem Kupfer-Zentrum aus, und durch Abschirmung einer Seite des Aldehyds durch die tert.-Butylgruppe ist allein eine Reaktion auf der si-Seite möglich. N OO N Cu O O OEt O O O OEt si-Angrif f MeO S Abb. 24: Modell eines Übergangszustandes zur Erklärung der Stereoselektivität der Glyoxylat-Addition an 1-Methoxybutadien unter Kupfer(II)-Katalyse. Beim Transfer auf die feste Phase brachte keiner der Kupfer-Katalysatoren in der Reaktion Vorteile gegenüber dem Titan/BINOL-System (Tab. 11). N OO N 173 Cu TfO OTf N OO N t-Bu t-Bu Cu TfO OTf 172 O O O OEt O O H O OEt + 50 mol% Kat. s. Tab. 11 156 157 O OEt O O 160 CrO3, H2SO4 Aceton, 3 h 155 Nr. Katalysator Temp. Lösungsmittel Selektivität 1 50 mol% 173 -30 °C CH2Cl2 45 %ee (R) 2 100 mol% 173 -78 °C bis 0 °C CH2Cl2 60 %ee (R) 3 40 mol% 172 0 °C THF 85 %ee (S) Tabelle 11: Einsatz von Cu(II)-Katalysatoren in der Glyoxylat-Diels-Alder-Reaktion. Bei der Verwendung des Indabox-Liganden 167 (Tabelle 11, Einträge 1, 2) führte der Katalysator sogar in stöchiometrischem Einsatz zu deutlich geringerem Umsatz als zuvor. Die gaschromatographische Analyse des Rohproduktes zeigte an, dass bei Einsatz von 50 mol% 173 das gewünschte (R)-Isomer in 45 % Enantiomerenüberschuss vorlag, bei Umsatz in Gegenwart von 100 mol% 173 wurden 60 %ee erreicht. Mit dem Liganden 168 konnte die Enantioselektivität noch deutlich gesteigert werden. Der Katalysator 172 wurde in THF gebildet und in der Glyoxylat-Diels- Alder-Reaktion an der festen Phase getestet. Bei einer Katalysator-Ladung von 50 mol% in Bezug auf das immobilisierte Dien 156 wurde im Cycloaddukt ein Enantiomerenüberschuss von 87 % detektiert, allerdings mit dem (S)-Isomer als 75 Spezieller Teil Hauptprodukt (Tab. 11, Eintrag 3). Da der Ligand 168 in beiden enantiomeren Formen kommerziell erhältlich ist, war dies aber unerheblich. Bei den hier durchgeführten Kupfer-katalysierten Reaktionen blieb der Enantiomerenüberschuss erfreulicherweise beim Übergang von Lösung an das immobilisierte Substrat stabil (wenn auch bei höherer Katalysator-Ladung). Allerdings konnte nach Aufarbeitung und Abspaltung nur so wenig Produkt isoliert werden, dass die Bestimmung des Enantiomerenüberschusses mittels Gaschromatographie noch möglich war, an eine Aufreinigung aber nicht gelang. Damit bestätigte sich der schon in Lösung beobachtete niedrige Umsatz der Kupfer-katalysierten Reaktion auch am immobilisierten Dien 156. Für die Anwendung eines Katalysators in der Synthese einer Verbindungsbibliothek war aber ein hoher Umsatz unerlässlich, da sonst deutlich mehr Trägerharz hätte eingesetzt werden müssen. Damit waren die Kupfer-Katalysatoren mit Box-Liganden dem ursprünglichen Titan-BINOL nicht überlegen. Aus diesen Gründen wurde diese Route nicht weiter verfolgt. 3.1.3.5 Variation des Aldehyds Neben der Variation von Lösungsmittel und Katalysator wurde auch das Dienophil der hetero-Diels-Alder-Reaktion variiert. Der Grund war die aufwendige Gewinnung des Ethylglyoxylats: Es musste von Toluol fraktioniert destilliert werden (Sdp. ca. 130 °C) und außerdem in depolymerisierter Form vorliegen. Die Polymerisation setzte aber nach Abkühlung wieder ein, so dass im Reaktionsverlauf ständig neues Dienophil destilliert werden musste. Als Alternative wurde der Dithian-2-Carbaldehyd 174 in Betracht gezogen, der ebenfalls eine aktivierte Aldehyd-Funktion besitzt [121] und nach Cycloaddition und Entfernung des Dithians direkt einen Aldehyd liefern würde, der in C-C-Bindungs- knüpfenden Reaktionen eingesetzt werden könnte. Aldehyd 174 wurde nach einer Vorschrift von Meyers[122] in 87 % Ausbeute gemeinsam mit dem Dimer 175 erhalten (Schema 34) und in der Titan- oder Kupfer-katalysierten hetero-Diels- Alder-Reaktion eingesetzt. Jedoch konnte weder über IR-Spektroskopie am Harz 76 Spezieller Teil noch nach Abspaltung vom Harz über GC-MS oder 1H NMR-Spektroskopie ein Umsatz mit dem immobilisierten Dien 156 festgestellt werden. O H S S S S S S O OH S S 1.) n-BuLi, THF, -60 °C 2.) DMF, -30 °C to 0 °C + 87 % 174 175 Schema 34: Synthese des Aldehyds 174. 3.1.3.6 Weitere Schritte Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Ziel gesetzt, die Syntheseroute zu α,β- ungesättigten δ-Laktonen über hetero-Diels-Alder-Reaktionen weiter auszubauen und den vom Cycloaddukt 162 abgeleiteten Aldehyd 166 (Schema 35) als Ausgangspunkt weiterer Transformationen zu nehmen. Insbesondere schien die Umsetzung in Aldol-Reaktionen attraktiv, da diese zu naturstoffähnlichen Verbindungen führen würden. Die Reduktion zum Alkohol 176 gelang mit 4 Äq. LiBH4 in THF (Schema 35) und konnte nach Acetylierung der Hydroxygruppe und Abspaltung des Produktes 177 vom Harz nachgewiesen werden. Mittels Fmoc-Tests[123] wurde die Beladung des Harzes 176 zu 0.8-0.9 mmol/g bestimmt. H O O O OEt 162 O O OH 176 4 Äq. LiBH4 THF O O O 177 O 1) Ac2O, NEt3, DMAP, CH2Cl2 2) CrO3, H2SO4, Aceton/H2O 0.8-0.9 mmol/g 4 Äq. IBX DMSO/THF 1:1 O O O 166 Schema 35: Derivatisierungen des Cycloaddukts 162. Bei der folgenden Oxidation zum Aldehyd traten weitere Schwierigkeiten auf. Beim Einsatz von IBX als Oxidationsmittel trat zwar im FT-IR-Spektrum eine Carbonyl-Bande bei 1735 cm-1 auf, doch gelang es auch unter Verwendung von bis zu 8 Äq. IBX und Reaktionszeiten von bis zu 60 h nicht, vollständigen Umsatz zu erzielen, da stets noch eine starke OH-Schwingung zu sehen war. Da ein 77 Spezieller Teil großer Umsatz und eine hohe Beladung des Aldehyds 166 am Harz für weitere Syntheseschritte unerlässlich waren, wurde diese Oxidation weiter untersucht. Nach erfolgter IBX-Oxidation zeigte eine Titration mit DNPH eine Aldehyd- Beladung von 0.65 mmol g-1 an. Auch gelang die Umsetzung mit einem Wittig- Ylid (Schema 36) zu Verbindung 178. O O OH 176 O O O 166 Beladung: 0.65 mmol/g H IBX THF/DMSO, 16 h O O 178 NO2 NO2 BrPh3P 1) n-BuLi, THF 2) CrO3, H2SO4 Aceton Schema 36: Abfangen des Aldehyds 166 mit einem Wittig-Ylid. Weitere Oxidationsmittel wurden untersucht. Da der Aldehyd 166 unter den Abspaltungsbedingungen des Jones-Reagenzes nicht stabil war, konnte die Reaktion nur mittels Infrarot-Spektroskopie am Harz verfolgt werden. Dies erschwerte quantitative Aussagen über den Umsatz der Reaktion. Mit Dess-Martin-Periodinan[124] wurde das Auftreten einer Carbonylbande im FT-IR-Spektrum in mit IBX vergleichbarem Umfang beobachtet. Bei Verwendung von TPAP, einem Ruthenium-basierten Katalysator mit N-Methylmorpholin-N-oxid als Reoxidans,[125] wurde die Carbonyl-Bande ebenfalls detektiert, ohne dass die OH-Schwingung verschwunden war. Hingegen zeigte das IR-Spektrum des Alkohols 176 keine Veränderung, wenn als Oxidationsmittel SO3·Pyridin[126] oder DMSO/Oxaylchlorid[127] eingesetzt wurden. Weitere Experimente wurden durchgeführt, um auszuschließen, dass das Substrat während der langen Reaktionszeit durch Oxidation und Zersetzung des Wang-Linkers vom polymeren Träger abgespalten wurde. Dazu wurden bei Einsatz von IBX nach vier und acht Stunden Reaktionszeit Proben aus dem Überstand mittels GC-MS analysiert. Dabei konnte jedoch kein Abspaltungsprodukt detektiert werden. Da das IR-Spektrum nach der Reaktion von 176 mit IBX eine Carbonylbande zeigte, wurde für weitere Untersuchungen die –zumindest partielle – Umsetzung zum Aldehyd 166 angenommen. Das Harz wurde in weiteren Reaktionen eingesetzt. 78 Spezieller Teil 3.1.3.7 Versuche von Aldol-Reaktionen am immobilisierten Aldehyd 166 Um einen Zugang zu neuartig funktionalisierten α,β-ungesättigten δ-Laktonen zu haben, sollte der sollte der Aldehyd 166 aus der hetero-Diels-Alder-Sequenz in C- C-bindungsknüpfenden Reaktionen eingesetzt werden. Dabei wurden Aldol-artige Reaktionen als besonders interessant angesehen, da auf diese Weise β-Hydroxycarbonylverbindungen entstehen (Schema 37), die z.B. durch stereo- spezifische Reduktion weiter in 1,3-Diole transformiert werden können. Um solche Verbindungen zu erhalten, sollte der Aldehyd 166 mit einem Enolat zur β-Hydroxyverbindung 179 reagieren. Für solche Reaktionen sind für immobilisierte Aldehyde nur wenige Beispiele bekannt, und stereoselektive Varianten dieser Reaktionen sind in der organischen Synthese an der festen Phase sehr selten.[37;39] Im Falle eines Aldol-Produktes vom Typ 179 musste die oxidationsempfindliche Hydroxylgruppe vor der Abspaltung mit dem Jones- Reagenz geschützt werden, dies sollte als Acetat oder TBS-Ether geschehen. O O O R´ R OM O O OH O R´ R + O O OP O R´ RSchützung, Abspaltung Aldol-Reaktion 166 179 H 180 Schema 37: Synthesekonzept für Derivatisierungen des Aldehyds 166 mittels Aldol- Reaktionen. In den Aldol-Reaktionen am Aldehyd 166 wurde die Enolat-Komponente variiert. neben Lithium- und Bor-Enolaten wurden auch Silylenolether eingesetzt. In Schema 38 sind die Versuche zur Enolat-Addition zusammengefasst: 79 Spezieller Teil OTBDMS1) LDA, THF, 0 °C 2) TBDMSCl, HMPA, THF, -78 °C 77 % O BCy2 cHex2BCl NEt3, EtO2 0 °C Et2O, -78 °C, 2 Zyklen 2) TBDMSCl, Imidazol, DMF 1) O O BCy2 cHex2BCl NEt3, EtO2 0 °C Et2O, -78 °C, 2 Zyklen 2) Ac2O, NEt3, DMAP, CH2Cl2 3) CrO3, H2SO4, Aceton/H2O 1) O O OAc O OLiLDA, THF, 0 °C Lewis-Säure (s. Text), THF -78 °C 2) Ac2O, NEt3, DMAP, CH2Cl2 3) CrO3, H2SO4, Aceton/H2O 1) O O OAc O O O R O 1) 20 eq. LiOH, DME, RT oder je 1.6 eq. ZnBr2, DBU, Bipyridin, NMP 3) CrO3, H2SO4, Aceton/H2O + 20 eq. O O R O 181 177 SnCl4, CH2Cl2, -78 °C 1) 181 182 ~ 20 % keine Reaktion 181 keine Reaktion O O O H O O O H O O O H O O O H 186 R = Pentyl 187 R = Phenyl keine Reaktion H 166 177 166 166 166 166 A B C D E 183 185184 Schema 38: Versuche zur Aldol-Reaktion am Aldehyd 166. (A) Das kinetische Lithium-Enolat von 2-Heptanon 181 wurde in Gegenwart von 3 Äq. ZnCl2[128] oder 5 Äq. BF3-Etherat mit dem immobilisierten Aldehyd 166 umgesetzt. Anschließende Acetylierung und Abspaltung führten nur zur Isolierung des acetylierten Alkohols 177 in Ausbeuten um 20 %; ein Zeichen für die unvollständige Oxidation zum Aldehyd 166. (B) Das Abfangen des Enolats von 181 mit TBS-Chlorid gelang mit 77 % Ausbeute.[129] In Anwesenheit der starken Lewis-Säure Zinn(IV)chlorid wurde der Silylenolether 182 zu Aldehyd 166 gegeben,[129] jedoch konnte nach Aufarbeitung der Reaktion im IR-Spektrum keine Veränderung festgestellt werden. 80 Spezieller Teil (C, D) Die Borenolate 183 und 185 wurden ebenfalls mit dem Aldehyd 166 umgesetzt. Ein Additionsprodukt konnte in beiden Fällen nicht isoliert werden. Stattdessen wurde im Fall von 185 erneut nur das acetylierte Lakton 177 isoliert. (E) Marzinzik et al. berichteten über eine Aldol-Kondensation an immobiliserten Substraten unter stark basischen Bedingungen.[130] Einen ähnlichen Weg beschrieb Sensfuss mit einer Aldol-Kondensation an der festen Phase, die in Gegenwart von Zinkbromid, Bipyridin und DBU durchgeführt wurde.[131] Diese Varianten der Aldolkondensation wurden am Harz 166 mit Heptanon 186 und Acetopohenon 187 als Enol-Komponente getestet. In keinem Fall konnte das gewünschte Produkt auch nur in Spuren durch 1H NMR-Spektroskopie oder GC- MS detektiert werden. Nach diesen Versuchen wurde von weiteren Ansätzen abgesehen, den Aldehyd 166 zu funktionalisieren. Da der freie Aldehyd nicht unter oxidativen Bedingungen abgespalten werden kann, konnte nicht festgestellt werden, welcher Anteil des immobilisierten Alkohols 176 wirklich oxidiert worden war. Es gelang nicht, die Ursachen für die geringe Reaktivität des Alkohols 176 bzw. des Aldehyds 166 zu bestimmen. Möglicherweise wurde der Aldehyd rasch hydratisiert, so dass er weniger reaktiv gegenüber Nukleophilen war. 3.1.3.8 Diskussion Die hier vorgestellte Syntheseroute, in der α,β-ungesättigte-δ-Laktone mittels einer hetero-Diels-Alder-Reaktion hergestellt wurden, schien zunächst sehr attraktiv: das enantioselektiv an der festen Phase synthetisierte Cycloaddukt 157 versprach breite Diversifizierungsmöglichkeiten, die eine Anwendung hinsichtlich einer Bibliothekssynthese ermöglichen sollten. Trotz aller dargestellten Ansätze blieb die Stereoselektivität der Gyloxylat- Diels-Alder-Reaktion an der festen Phase schwierig zu kontrollieren. Am Ende der hier gezeigten Untersuchungen war es jedoch möglich, einen Enantiomeren- überschuss von 75 % auch bei größeren Mengen eingesetzten Diens 156 (bis zu 3 g Harz) zu erzielen. Darüber hinaus wurde das Katalysatorsystem von Titan-BINOL auf Kupfer- “Box“-Liganden umgestellt. Besonders der mit zwei tert.-Butyl-Gruppen 81 Spezieller Teil substituierte Bisoxazolin-Ligand brachte ohne weitere Optimierung Enantiomerenverhältnisse von über 92 : 8. Dieser Wert konnte sowohl in Lösung als auch an fester Phase erzielt werden. Diese Werte lagen im Bereich der in der Literatur dokumentierten Enantiomerenüberschüsse an vergleichbaren Systemen.[115] Da die Kupfer-basierten Katalysatoren jedoch zu deutlich geringerem Umsatz führten, wurde ihre Anwendung im Hinblick auf die Bibliothekssynthese nicht weiter verfolgt. Das primäre Cycloaddukt sollte in zwei Stufen in den Aldehyd 166 umgewandelt werden, um ein Edukt für weitere C-C-Bindungs-knüpfende Reaktionen zu erhalten. Da die eindeutige Identifizierung des Aldehyds 166 auf dem polymeren Träger jedoch nicht gelang, konnten weitere Pläne zur Synthese von α,β-ungesättigten δ-Laktonen mit diversifizierten Seitenketten nicht verwirklicht werden. 82 Spezieller Teil 3.2 Sonogashira-Kupplungen an Peptiden und Proteinen 3.2.1 Einleitung Im zweiten Teil dieser Arbeit werden Versuche zur Übergangsmetallkatalyse mit Peptiden und Proteinen beschrieben. Ziel dieses Projektes war es, Palladium- katalysierte Kreuzkupplungsreaktionen, hier im Speziellen die Sonogshira- Reaktion[132], an Proteinen als Substraten unter möglichst physiologischen Bedingungen durchzuführen. Dafür musste nicht nur der metallorganische Kataly- sator dem wässrig-neutralen Milieu angepasst werden, sondern auch das jeweilige Substrat mit einer geeigneten Funktionalität ausgestattet werden. Die Einführung einer funktionellen Gruppe für die Palladium-Chemie in ein Protein würde einen molekularen Anker für eine Reihe von Transformationen schaffen, die zum Spektrum aller natürlichen Modifikationen (z.B. Phosphorylie- rung, Methylierung, Nitrosylierung) orthogonal ist. An diesem Anker könnte das Protein schnell und variabel mit einer Reihe verschiedener Moleküle gekuppelt werden. So ließen sich an einem Protein in einer Reihe von Parallelreaktionen Fluorophore, Markermoleküle wie Biotin oder weitere unnatürliche Funktionalitäten einführen. Mit der Entwicklung neuer in vitro-Translationssysteme und in vivo Metho- den[133] ist es bereits gelungen, unnatürliche Aminosäuren regiospezifisch in Pro- teine einzubauen. Von besonderem Interesse für diese Arbeit ist dabei der in vivo Einbau von para-Iodphenylalanin in Proteine des Bakteriums E.coli mit Hilfe einer para-Iodphenylalanin-selektiven tRNA und einer modifizierten Tyrosin-tRNA- Synthetase.[134] Iodaromaten sind reaktive Komponenten für Übergangsmetall- katalysierte Reaktionen, so dass eine reale Perspektive für die Katalyse an exprimierten Proteinen besteht. Darüber hinaus besteht die Möglichkeit, Peptide mit der gewünschten Funktionalität durch verschiedene Ligationsmethoden an Proteine zu kuppeln. Durch diesen semisynthetischen Ansatz kann die Kreuzkupplung auf der Stufe des vollständigen Proteins getestet werden, ohne dass ein künstliches Expres- sionssystem verwendet werden muss. Eine Übersicht über das Synthesekonzept ist in Abb. 25 dargestellt. 83 Spezieller Teil Pd(0)Ln Pd(II)ILn-1 R Pd(II)Ln-1 R H CuI, Base H N COOH SH N O O O NH-ASx-ASy-ASz-COOH+ I H N COOH S N O O O NH-ASx-ASy-ASz-COOH I MIC-Ligation Protein mit C-terminalem Cys synthetisches Peptid mit Iodaromaten H N COOH S N O O O NH-ASx-ASy-ASz-COOH I R = Acetylen mit Marker Markiertes Protein Abb. 25: Schematischer Reaktionsablauf für die Modifizierung von Proteinen durch Palladium-Katalyse. Erste Experimente auf diesem Gebiet wurden von Dr. Lucas Brunsveld und Dr. Thomas Durek durchgeführt (Schema 39, A). Dazu wurde ein C-terminal um sieben Aminosäuren verkürztes Ypt7-Protein (Ypt7Δ7) mit einem Intein-Konstrukt exprimiert und konnte als MESNA-Thioester isoliert werden. Durch eine native chemical ligation wurde das Protein C-terminal um ein Cystein verlängert, so dass ein freies Thiol für eine MIC-Ligation mit dem Peptid 188 erhalten wurde. Ein MALDI-TOF-Spektrum des Proteins 189 ist in Schema 39 B gezeigt. Das auf diese Weise erhaltene Protein 189 wurde mit dem Dansyl-markierten Acetylen 190 umgesetzt (Schema 39, C): 84 Spezieller Teil Schema 39: Experimente zur Übergangsmetallkatalyse an Proteinen (Brunsveld/Durek) A: Synthese des „iodierten“ Rab-Proteins 189 durch MIC-Ligation, B: MALDI-TOF- Spektrum von 189, C: Sonogashira-Reaktion des Acetylens 190 mit dem Protein 189. Die Ergebnisse der Experimente am Protein 189 sind im Folgenden zusammengefasst: Wurde das Protein in Wasser/Acetonitril 3 : 1 bei pH 7.5 mit 10 Äq. des Acetylens 190 in Gegenwart des Katalysators Pd(TPPTS)4 und Kupfer(I)iodid umgesetzt, dann wurde im SDS-Page-Gel der Reaktionslösung eine fluoreszierende Bande in Höhe des Ypt7-Proteins beobachtet (Abb. 26). Darüber hinaus wurden weitere fluoreszierende Banden auf der Höhe größerer Proteine beobachtet, die mit der Bildung von Oligomeren erklärt werden könnten. Die Bildung von Oligomeren konnte durch Einsatz von 10 Äquivalenten des Katalysators Pd(TPPTS)4 unterdrückt werden. 85 Spezieller Teil Ypt7Δ7CysOH +/- 188 + + + - Acetylen 190 + + + + Pd(TPPTS)4 + + - + CuI + - + + Ypt7 Abb. 26: Sonogashira-Reaktion am Protein Ypt7Δ7Cys-Iod 189 nach Schema 39 (L. Brunsveld/T. Durek). Fluoreszenzaufnahme des SDS-PAGE-Gels nach der Reaktion. Der Pfeil markiert das monomere Protein 189. Eine fluoreszierende Bande trat allerdings auch allein nach Umsatz des nicht- iodierten Proteins mit dem Acetylen 190 in Gegenwart des Katalysators auf (Abb. 26, Spur 4). Nach Gelfiltration und intensivem Waschen mit Chelatbildnern wie Diethyldithiocarbamat und Trithioltriazin nahm die Fluoreszenz hier ab. In diesem Fall könnte sich ein unspezifischer Komplex aus Protein, Palladium und Acetylen gebildet haben. Über eine Analytik mittels Fluoreszenz-Detektion im SDS-Gel kamen die Experimente nicht hinaus; das Reaktionsprodukt konnte z.B. nicht mittels Massenspektrometrie identifiziert werden. 3.2.2 Sonogashira-Reaktionen an Peptiden 3.2.2.1 Synthese und Anwendung von Modellpeptiden Aus den oben skizzierten Vorarbeiten leitete sich die Frage ab, ob Aminosäuren mit Lewis-Basen in der Seitenkette als σ-Donoren den Katalysator chelatisieren können, so dass an einer anderen Stelle als gewünscht am Protein eine Reaktion stattfindet. Dies könnte z.B. zu einer Oligomerisierung führen. Als eine potentielle Stelle im eingesetzten YPT7-Protein kam ein Teil der Aminosäuresequenz in 86 Spezieller Teil Frage, in der Methionin und Histidin aufeinander folgen (Met25-His26, Schema 40, A). Der Einfluss dieses potentiellen Chelatbildners sollte zunächst untersucht werden. HO 1) Fmoc-Gyl-OH, DIC, DMAP, DMF/CH2Cl2 1 : 1 2) DMF/ Piperidin 4 : 1 H2N-Gly-O 1) 4 Äq. Fmoc-AS, 3,6 Äq. HBTU, 4 Äq. HOBt*H2O, 8 Äq. DIPEA DMF/CH2Cl2 1 : 1 2) DMF/Piperidin 4 : 1 H2N-Lys(Boc)-Thr( tBu)-Ser(Bn)-Leu-Met-His(Trt)-Tyr(tBu)-Val-Asn(Trt)-Gly-O H2N-(Phe-I)-Lys(Boc)-Thr( tBu)-Ser(Bn)-Leu-Met-His(Trt)-Tyr(tBu)-Val-Asn(Trt)-Gly-O 1) 4 Äq. Fmoc-(4-I)PheOH, 3,6 Äq. HBTU, 4 Äq. HOBt*H2O, 8 Äq. DIPEA DMF/CH2Cl21 : 1 2) DMF/Piperidin 4 : 1 Wang-Harz 0.98 mmol/g VIILGDSGVG KTSLMHRYVN DKYSQQYKAT 11 40 A B 1) TFA, H2O, EDT, TES 2) Et2O 191 57 % 1) TFA, H2O, EDT, TES 2) Et2O 192 66 % Schema 40: A Ausschnitt aus der Aminosäuresequenz von Ypt7; B Synthese der Peptide 191 und 192. Hierzu wurde das Peptid 191 synthetisiert, welches die Aminosäuren 21-30 von Ypt7 enthält (Schema 40, B). Darüber hinaus wurde durch Verlängerung mit 4-Iodphenylalanin das Peptid 192 synthetisiert, das für weitere Kreuzkupplungsstudien genutzt werden sollte. Für die Synthese der Peptide 191 und 192 wurde Glycin mit Diisopropyl- carbodiimid aktiviert und in Gegenwart von DMAP auf Wang-Harz geladen. Die weitere Synthese erfolgte gemäß Standard-Methoden der Fmoc-Peptid-Synthese an der festen Phase. Nach TFA-Abspaltung und paralleler Entschützung wurden beide Peptide aus Diethylether präzipitiert und ohne weitere Aufreinigung umgesetzt. 87 Spezieller Teil Abb. 27: Stabilitätstest von Peptid 191. Das Peptid wurde mit dem Katalysator Pd(TPPTS)4 inkubiert und nach (A) 0 h, (B) 24 h, (C) 96 h mittels MALDI-TOF untersucht. In einem ersten Experiment wurde untersucht, ob die potentiell chelatisierende Methionin-Histidin-Sequenz im Peptid 191 unter den Katalysebedingungen zur Degradierung oder Oligomerisierung führt. Dazu wurde das Peptid 191 mit 100 mol% des Palladium-Katalysators inkubiert. Wie die MALDI-Spektren in Abb. 27 zeigen, war zwischen dem unbehandelten Edukt (A) und dem Peptid nach 24 h (B) bzw. 96 h (C) keine Veränderung festzustellen. Dies zeigte, dass die gegebene Sequenz unter den Reaktionsbedingungen stabil ist, die potentiell chelatisierende Abfolge von Methionin und Histidin in der Sequenz also nicht zu Nebenreaktionen in katalytischen Umsetzungen führen würde. Nun konnte das iodierte Peptid 192 mit verschiedenen Acetylenen getestet werden, deren Synthese im folgenden Abschnitt beschrieben wird. 3.2.2.2 Synthese von Desthiobiotin-markierten Acetylenen Wie bereits beschrieben, gelang es nicht, das Reaktionsprodukt der Sonogashira- Kupplung des Proteins 189 mit dem Fluoreszenz-markierten Acetylen 190 mittels Massenspektrometrie zu charakterisieren. Abhilfe sollte nun ein anderer Acetylen-Baustein schaffen, der eine Aufreinigung von Sonogashira-Produkten mittels Affinitätschromatographie erlaubte. Dabei wurde auf das gut charakterisierte Biotin/Streptavidin-System zurückgegriffen. Die Bindungs- konstante von Biotin an Streptavidin ist mit K ≈ 1013 M-1 eine der stärksten nicht- 88 Spezieller Teil kovalenten Bindungen in der Natur. Da der Biotin-Streptavidin-Komplex nur unter drastischen Bedingungen gelöst werden kann, wodurch die Funktionalität des Proteins beeinträchtigt werden könnte, wurde mit Desthiobiotin ein Affinitätsmarker ausgewählt, dessen Bindungskonstante mit Streptavidin um Größenordnungen unter Biotin liegt.[135] Je nach Messmethode wird der Affinitätsunterschied auf 1/20 bis 1/1000 beziffert. Für die Affinitätschromatographie sollte das Streptactin-System[136] eingesetzt werden, das in Abb. 28 skizziert ist. Es besteht aus Agarose-Beads, die mit Streptavidin beladen sind. An diese kann ein mit Desthiobiotin markiertes Substrat reversibel binden. Die Eluierung erfolgt mit einem Überschuss an 2-(4- Hydroxyphenylazo)benzoesäure (HABA), die schwach an die Biotinbindungs- stelle im Streptavidin bindet und das Desthiobiotin verdrängt. NHHN O O NHHN O O HO O N N HO + I II Streptavidin- funktionalisierte Beads Abb. 28: Prinzip der Aufreinigung über Strepactin. I Beladung, spezifische Bindung zu Desthiobiotin; II Elution mit HABA Die Synthese der Acetylene, die für diese Arbeit getestet wurden, ist in Schema 41 dargestellt. Desthiobiotin 193 wurde mit HBTU aktiviert und mit Propargylamin in 44 % Ausbeute zum Propargylderivat 194 umgesetzt. Die analoge Umsetzung mit Ethinylanilin ergab ein Produkt, das sich nur schwer von Nebenprodukten trennen ließ. Abhilfe schuf die Aktivierung von Desthiobiotin mit EDC in Gegenwart von einem Äquivalent DMAP: auf diese Weise wurde das aromatische Acetylen 195 nach einfacher Säulenchromatographie in 83 % Ausbeute erhalten. 89 Spezieller Teil HN NH N H O O 194 NH2 HN NH HOOC NH2 O 193 H H H HN NH N H O O 195 H 48 % 83 % EDC, DMAP DMF, RT HBTU, DIPEA DMF, RT Schema 41: Synthese der Desthiobiotin-markierten Acetylene 194 und 195. 3.2.2.3 Sonogashira-Reaktionen an Peptiden in wässriger Lösung Die im vorigen Abschnitt vorgestellten Acetylene 194 und 195 wurden zunächst in Sonogashira-Reaktionen mit Peptiden getestet, um die Reaktionsbedingungen zu optimieren. 3.2.2.3.1 Testreaktionen am Peptid 192 Das para-Iodphenylalanin-haltige Peptid 192 wurde unter verschiedenen Bedingungen mit den Acetylenen 194 und 195 umgesetzt. Als Palladium-Katalysator fungierte ein Derivat des für Sonogashira-Reaktionen etablierten Tetrakis-(triphenylphosphin)palladiums, welches durch Sulfonierung der Phenylringe des Liganden in Wasser löslich ist (Pd(TPPTS)4). Als Co- Katalysator wurde Kupfer(I)iodid als Lösung in Acetonitril eingesetzt. In einer ersten Serie von Experimenten wurde das Peptid 192 in wässriger Lösung mit Phenylacetylen umgesetzt (Tabelle 12). Bei Verwendung eines reinen Wasser/Acetonitril-Gemisches und Triethylamin als Base konnte maximal ein Umsatz von 33 % erreicht werden (Eintrag 1), wenn 20 mol% des Palladiumkatalysators eingesetzt wurden. In neutralen, gepufferten Systemen lagen die Umsätze bei gleicher Katalysatorbeladung höher (Einträge 2, 3): Im Falle des MOPS-Puffers[56] konnten 66 % Umsatz erzielt werden, jedoch war hier eine verstärkte Homodimerisierung des Acetylens zu beobachten. Der zuvor bereits an Proteinen eingesetzte Phosphat-Puffer brachte bei 20 mol% 90 Spezieller Teil Katalysatorbeladung den höchsten Umsatz und wurde deswegen in den weiteren Versuchen eingesetzt. N H H N N H NH2 O O O H N N H H N N H H N N H H N N H OH O O O O O O O O HO OH S N NH HN NH2HN OH H2N O H2N O I N H H N N H NH2 O O O H N N H H N N H H N N H H N N H OH O O O O O O O O HO OH S N NH HN NH2HN OH H2N O H2N O H R R HN NH N H O O HN NH N H O O + 5 5 192 Pd(TPPTS)4, CuI, Bedingungen s. Tab. 12 196a R = 196b R = 196c R = Nr. Acetylen R = mol% Pd/Cu Bedingungen Umsatz(a) 1 20/20 H2O/MeCN 5:17 Äq. Net3, 15 h 33 % 2 20/20 MOPS Puffer 0.2 M, pH 7.5, 15 h 66 % 3 20/20 Phosphat-Puffer 0.2 M, pH 7.5, 15 h >90 % 4 HN NH N H O O 5 20/20 Phosphat-Puffer 0.2 M, pH 7.5, 15 h 0 % 5 HN NH N H O O 5 15/15 Phosphat-Puffer 0.2 M, pH 7.5, 15 h 30 % 6 HN NH N H O O 5 100/100 Phosphat-Puffer 0.2 M, pH 7.5, 4 d 100 % Tabelle 12: Sonogashira-Reaktion am Peptid 192. (a) bestimmt durch LC-MS Die Desthiobiotin-verknüpften Acetylene 194 und 195 wurden ebenfalls in einer Sonogashira-Reaktion am Peptid 192 getestet. Dabei konnte mit dem vom Propargylamin abgeleiteten Baustein 194 kein Umsatz festgestellt werden (Tabelle 12, Eintrag 4). Wurde hingegen das Acetylen 195 eingesetzt, konnte bei einer Katalysatorladung von 15 mol% ein Umsatz von ca. 30 % erzielt werden 91 Spezieller Teil (Eintrag 5). Wenn der Katalysator äquimolar eingesetzt wurde, konnte nach vier Tagen der vollständige Umsatz des Eduktes nachgewiesen werden (Eintrag 6). Damit konnte gezeigt werden, dass das Acetylen 195 in der Sonogashira- Reaktion in wässriger Lösung prinzipiell angewendet werden kann. Alle Experimente an modifizierten Proteinen wurden deswegen mit dem Acetylen 195 durchgeführt. 3.2.2.3.2 Kupplung am Peptid 188 Um zu testen, ob die Detektion und Aufreinigung des mittels Übergangs- metalkatalyse modifizierten Proteins gelingt, sollte die Sonogashira-Reaktion am Peptid-Baustein 188 durchgeführt werden. Dieser sollte anschließend über eine MIC-Ligation an das Protein gekuppelt werden. Um das Peptid 188 zu erhalten, wurde zunächst Fmoc-Lysin mit para- Iodbenzoesäure zum Synthesebaustein 197 umgesetzt (Schema 42). Das Peptid 188 wurde an Wang-Harz mit einer Fmoc-Strategie synthetisiert. Nach Abspaltung der letzten Fmoc-Gruppe wurde der N-Terminus mit Maleinimidocapronsäure funktionalisiert. Durch Abspaltung vom polymeren Träger und Präzipitation mit Diethylether konnte das Peptid in 93 % Ausbeute erhalten werden. HOOC NHFmoc H N HOOC I 1) DCC, HOSu, DMF, 20 min 2) Fmoc-Lys-OH, DIPEA, 36 h O I 197 36 % N N H H N N H H N OH O O O OH O HN O OH O O I O 188 MIC-Ser-Lys(4I-Bzl)-Ser-Gly-COOH2N-Gly-O 1) 4 Äq. Fmoc-AS, 3,6 Äq. HBTU, 4 Äq. HOBt*H2O, 8Äq. DIPEA DMF/CH2Cl2 1 : 1 2) DMF/Piperidin 4 : 1 Wang-Harz 1) TFA, H2O, EDT, TES 2) Et2O 93 % Schema 42: Synthese des iodierten Peptids 188. 92 Spezieller Teil Die Sonogashira-Reaktion am Peptid 188 konnte in wässriger Lösung durchgeführt werden (Schema 43). Analog zur Sonogashira-Reaktion in organischen Lösungsmitteln wurde zunächst unter stark basischen Bedingungen gearbeitet (10 Äq. Triethylamin als Base). Dies erwies sich als ungünstig und überflüssig: zum einen wurde der MIC-Linker unter diesen Bedingungen hydrolysiert. Zum anderen zeigte es sich, dass die Reaktion bereits in wässrigem Phosphat-Puffer bei pH 7.5 vollständig ablief. Das Kupplungsprodukt 198 konnte nach Aufreinigung durch präparative HPLC in 85 % Ausbeute gewonnen werden. N N H H N N H H N OH O O O OH O HN O OH O O I O 188 N N H H N N H H N OH O O O OH O HN O OH O O HN NH N H O OO 198 HN NH N H O O 195 H + 10 mol% Pd(TPPTS)4, 10 mol% CuI H2O/MeCN ~1 : 1 Phosphat-Puffer pH 7.5 RT, 30 min 85 % Schema 43: Sonogashira-Reaktion am Peptid 188 3.2.3 Sonogashira-Reaktionen an Proteinen 3.2.3.1 Versuche an einem modifizierten Rab-Protein Nachdem die Sonogashira-Reaktion an Peptiden in neutral-wässriger Lösung erfolgreich war, wurden nun Proteine als Substrate eingesetzt, die mit dem Peptid 188 ligiert waren. Das modifizierte Protein 189 (Ypt7Δ7Cys-MIC-iodo) wurde mit dem Acetylen 195 umgesetzt (Schema 44). 93 Spezieller Teil H N N H Ser-Gly-OH NH O 189 HN NH N H O O 195 H +Ypt7Δ7CysMIC-Ser I O 4 5 H N N H Ser-Gly-OH NH O 199 Ypt7Δ7CysMIC-Ser O 4 NH N H N H O O 5 10 Äq. Pd(TPPTS)4, 10 Ä19q. CuI H2O/MeCN, Phosphat-Puffer pH 7.5, 16 h Schema 44: Sonogashira-Reaktion am Protein 188. Dabei wurden je 10 Äquivalente des Palladium-Katalysators und des Kupfer-Co- Katalysators eingesetzt. Die Reaktion fand in einem Phosphat-Puffer bei pH = 7.5 statt. Nach 16 h wurde die Reaktion abgebrochen. Die Reaktionslösung wurde an den Streptactinbeads aufgereinigt und mittels LC-MS untersucht (Abb. 29). 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 2 Time (min) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 R el at iv e A bu nd an ce 13.36 14.58 25.55 25.9325.0315.60 17.367.03 18.57 22.342.11 7.50 10.942.32 9.936.560.23 5.35 20000 20500 21000 21500 22000 22500 23000 23500 24000 2450 mass 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 R el at iv e A bu nd an ce 22951.0 22276.0 23338.0 22614.0 24424.021713.0 23477.0 23749.020354.0 21218.020853.0 20000 20500 21000 21500 22000 22500 23000 23500 24000 2450 mass 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 R el at iv e A bu nd an ce 23264.0 22950.0 23574.0 23890.0 2421821.0 22321.0 24382.020750.0 21332.020444.0 22544.0 m/z = 23069 188-Iod m/z = 23264 199 Abb. 29: Untersuchung der Reaktion in Schema 44 mittels LC-MS. 94 Spezieller Teil Das Chromatogramm zeigte deutlich ein Hauptprodukt mit einer Retentionszeit von 13.4 min. Dekonvolutierung des Massenspektrums dieses Signals ergab die beste Übereinstimmung mit einer m/z = 22949-22951. Dies korreliert in etwa mit der Masse des Ypt7Δ7Cys-Proteins mit dem ligierten Peptid, jedoch ohne Iod: Die Masse von Ypt7Δ7CysMICiodo 189 beträgt ca. 23100 g/mol (s. MALDI- Spektrum inSchema 39), Wird von der Summe der Massen die Masse eines Iod- Atoms abgezogen, erhält man 22972 g/mol. Wird das Massenspektrum in der rechten Schulter des Signals bei 13.4 min dekonvolutiert, kann noch ein zweites Produkt detektiert werden. Das dekonvulierte Massenspektrum zeigt größte Übereinstimmung mit einer molaren Masse von 23264 g/mol. Wird für die Masse des Protein-Edukts 23100 g/mol eingesetzt, dann ergibt sich für das gewünschte Sonogashira-Produkt 199 eine Masse von 23286. Aus dem Chromatogramm lässt sich das Integral über die Produkte nicht bestimmen, jedoch ist das deiodierte Produkt eindeutig als Hauptprodukt zu erkennen. Die Entstehung des de-iodierten Produktes anstatt des gewünschten Kupplungsprodukt 199 lässt sich durch Protolyse des nach der oxidativen Addition des Palladiums in die C-I-Bindung entstandenen Komplexes plausibel erklären. Allerdings bleibt unverständlich, warum das deiodierte Produkt auch die Aufarbeitung mit der Streptactin-Säule übersteht: Da es eben nicht über einen Desthiobiotin-Anker verfügt, sollte es nicht an die Oberfläche der Säule binden. Zwei Erklärungen sind möglich: (1) entweder halten unspezifische Wechelwirkungen das Protein auf der Säule, oder (2) es bilden sich nicht- kovalente Komplexe zwischen dem Protein 189 und dem Desthiobiotin- Baustein 195 aus, die unter den Bedingungen der Aufarbeitung stabil sind, spätestens im ESI-MS jedoch zerfallen. Um genaueren Aufschluss über die Reaktion zu erlangen, wurde ein weiteres Experiment durchgeführt: Nach erfolgter Sonogashira-Reaktion sollte nun ein tryptischer Verdau des Proteins durchgeführt werden, und die resultierenden Peptide über die Streptactinsäule aufgetrennt werden. Damit sollten alle (desthio-)biotinylierten Fragmente identifiziert werden. Nachdem die Sonogashira-Reaktion wie in Schema 44 durchgeführt wurde, folgte die direkte Inkubation der Reaktionslösung mit Trypsin. Die resultierende 95 Spezieller Teil Lösung wurde aufgeteilt: ein Teil wurde zur direkten Analyse aufbewahrt (Fraktion I), ein zweiter mit den Streptactin-Beads inkubiert. Durch die ungebundenen Fragmente und das Eluat ergaben sich zwei neue Fraktionen (Fraktion II und III). Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Abb. 30 und Tabelle 13 dargestellt. In der unbehandelten Fraktion I konnten ca. 54 % der Aminosäuresequenz des Proteins Ypt7Δ7Cys-MIC 189 identifiziert werden (Tabelle 13, A). Besonders bemerkenswert ist, dass das C-terminale Fragment im MALDI-TOF detektiert werden konnte, und zwar sowohl in der de-iodierten und in der umgesetzten Form (Abb. 30). Das Signal des Sonogashira-Produktes (m/z = 1392) ist dabei um ein Vielfaches schwächer, was auf geringen Umsatz hinweist. Abb. 30: Tryptischer Verdau von Ypt7Δ/CysMICiodo 189 nach der Sonogashira-Reaktion (Schema 44). A: Identifizierung des de-iodierten und des gekuppelten C-terminalen Fragmentes im MALDI-TOF-Spektrum. 96 Spezieller Teil A Masse berechnet [M+H]+ gefunden Position Peptid 2741.2285 2741.8 175-198 SALQQNQADTEAFEDDYNDA INIR 2587.3190 105-127 DEFLVHANVNSPETFPFVIL GNK 2248.0260 2247.8 81-101 GADCCVLVYDVTNASSFENI K 1591.7533 57-70 VATMQVWDTAGQER 1562.7809 1562.9 161-174 NAINVDTAFEEIAR 1361.7674 1361.8 148-160 SLGDIPLFLTSAK 1187.6207 1187.9 71-80 FQSLGVAFYR 1057.6251 1057.8 11-21 VIILGDSGVGK 1036.5673 1036.6 39-48 ATIGADFLTK 862.4152 49-56 EVTVDGDK 816.3886 33-38 YSQQYK 791.3781 128-134 IDAEESK 746.4043 141-147 SAQELAK 744.3821 22-27 TSLMHR 638.3144 28-32 YVNDK 575.3399 575.5 136-140 IVSEK B Masse berechnet [M+H]+ gefunden Position Peptid 2741.2285 2741.9 175-198 SALQQNQADTEAFEDDYNDA INIR 2587.3190 105-127 DEFLVHANVNSPETFPFVIL GNK 2248.0260 1123.8 (2+) 81-101 GADCCVLVYDVTNASSFENI K 1591.7533 57-70 VATMQVWDTAGQER 1562.7809 1562.7 161-174 NAINVDTAFEEIAR 1361.7674 1361.8 148-160 SLGDIPLFLTSAK 1187.6207 594.3 (2+) 71-80 FQSLGVAFYR 1057.6251 1057.6 11-21 VIILGDSGVGK 1036.5673 1036.6 39-48 ATIGADFLTK 862.4152 862.4 49-56 EVTVDGDK 816.3886 816.4 33-38 YSQQYK 791.3781 791.4 128-134 IDAEESK 746.4043 746.6 141-147 SAQELAK 744.3821 744.4 22-27 TSLMHR 638.3144 28-32 YVNDK 575.3399 575.3 136-140 IVSEK Tabelle 13: Tryptischer Verdau von Ypt7Δ/CysMICiodo 189 nach der Sonogashira- Reaktion (Schema 44: Sonogashira-Reaktion am Protein 188.). A Identifizierte Peptide vor Streptactin-Aufreinigung; B identifizierte ungebundene Peptide. Nach Inkubation der Peptid-Fragmente mit den Streptactin-Beads wurde zunächst die ungebundene Fraktion II erhalten. Hier wurden mittels LC-MS und MALDI-TOF ebenfalls ca. 65 % der Aminosäuresequenz des Eduktes nachgewiesen (Tabelle 13, B). Im MALDI-TOF-Massenspektrum gelang auch 97 Spezieller Teil hier die Detektion des deiodierten C-Terminus’, während das Produkt der Sonogashira-Reaktion nicht gefunden wurde. Angesichts des schwachen Signals dieses Fragmentes in der Fraktion I ist dadurch aber der Erfolg der Aufreinigung nicht belegt. Nach Eluierung der Fraktion III von den Beads konnte das gewünschte Sonogashira-Produkt nicht gefunden werden. Weder eine chromatographische Auftrennung noch die Analyse der Reaktionslösung im MALDI-Massenspektrum erlaubten die Identifizierung weiterer Fragmente. Damit konnte die Frage, welche Produkte bei der Reaktion entstanden sind, nicht beantwortet werden. Da die eindeutige Charakterisierung des Sonogashira-Produktes am Ypt7- Protein 189 weder auf der Ebene des vollständigen Proteins noch auf der Ebene kürzerer Peptidfragmente gelang, wurde der Wechsel zu einem anderen Protein beschlossen. Damit ließe sich untersuchen, ob es im vorliegenden Fall des Ypt7- Proteins spezifische Einflüsse gab, welche die Reaktion inhibieren. Solche Einflüsse könnten z.B. auf reaktive Cysteine, die den Katalysator einfangen, zurückzuführen sein. 3.2.3.2 Versuche am 181N-Ras-Protein Das Ras-Protein ist eine Membran-gebundene GTPase, der eine Schlüsselstellung in Signaltransduktionsprozessen zukommt.[137] Da verschie- dene Ras-Isoformen seit Jahren am Max-Planck-Institut für Molekulare Physiologie untersucht werden, sind für die Gewinnung der Proteine durch Expression robuste Protokolle entwickelt worden, so dass das Protein – in diesem Fall eine N-Ras-Variante – in ausreichender Menge zur Verfügung stand. Die Versuche am Protein wurden durch Christine Nowak aus der Arbeitsgruppe von Jürgen Kuhlmann am MPI Dortmund unterstützt. 3.2.3.2.1 Ligation eines Desthiobiotin-markierten MIC-Peptids an N-Ras Bevor die Sonogashira-Reaktion am Protein weiter untersucht wurde, sollte gezeigt werden, dass das Streptactin-System für die Aufreinigung des Reaktionsproduktes geeignet ist. Dazu wurde das in Kap. 3.2.2.3.2 beschriebene 98 Spezieller Teil Peptid 198 an das 1-181N-Ras-Protein ligiert, um als Positivkontrolle die Aufreinigung via Affinitätschromatographie zu validieren. N N H H N N H H N OH O O O OH O HN O OH O O HN NH N H O OO 198 1-181N-Ras-Cys SH + N N H H N N H H N OH O O O OH O HN O OH O O HN NH N H O OO 200 S TRIS-Puf fer/MeCN 9:1 pH 7.0 1-181N-Ras-Cys Schema 45: Ligation des Peptids 198 an 1-181N-Ras. Die Ligation des Peptids 198 an das Protein (Schema 45) konnte mittels MALDI- MAS bestätigt werden (Abb. 31). Neben dem gewünschten Produkt, dass einfach markiert war (m/z ca. 21400) trat ein doppelt markiertes Protein auf (m/z ca. 22380), welches durch Reaktion eines weiteren Cysteins in der Ras-Sequenz zu erklären ist. 99 Spezieller Teil Abb. 31: MALDI-TOF-Spektrum des Ligationsproduktes 200. Nun wurde die Aufreinigung des Proteins 200 an Streptactin-Beads und die Detektion im SDS-PAGE-Gel mit einem Biotin-Antikörper getestet. Dazu wurde die nach der Ligation erhaltene Proteinlösung auf die Streptactin-Beads geladen und über Nacht inkubiert. Die Beads wurden zunächst mit einem Wasch-Puffer, anschließend mit einem HABA-haltigen Elutionspuffer versetzt. Die einzelnen Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE und Westernblot mit einem Biotin- Antikörper analysiert (Abb. 32). A B Abb. 32: Aufreinigung des Proteins 200 an Streptactin-Beads. (A) Commassie-Färbung des SDS-Gels (B) Westernblot mit Biotin-Antikörper; Spur 2 1-181N-Ras, Spur 3 Ligationsansatz, Spur 4 Überstand nach Inkubation mit Beads, Spur 5-7 Behandlung mit Waschpuffer, Spur 8-10 Elution mit HABA, Spur 11 denaturierte Beads. Wie aus Abb. 32 hervorgeht, wurde ein erheblicher Teil des Proteins nicht an die Beads gebunden (Spur 4). Möglicherweise war die Konzentration der Lösung zu 100 Spezieller Teil hoch (der Hersteller der Beads, IBU Göttingen, gibt keine Empfehlung zur maximalen Beladung der Beads), oder die Bindung war nur schwach. Schwerwiegender war, dass ein Großteil des gebundenen Proteins 200 bereits durch den Waschpuffer wieder eluiert wurde (Spuren 5-7), was für eine schwache Bindung des Desthiobiotin-Konstruktes spricht. Durch Elution mit HABA (Spuren 8-10) wurde nur wenig Protein von den Beads gelöst. Erhitzen der Beads im SDS-Puffer und Analyse dieser Fraktion zeigte, dass noch erhebliche Mengen des Proteins an den Beads gebunden waren (Spur 10). Im Western-Blot konnte das Desthiobiotin in allen Fraktionen erkannt werden. Damit war gezeigt, dass die Aufreinigung an Streptactin-Beads prinzipiell möglich ist. Zwar bestand Bedarf an einem ausgearbeitetem Protokoll zur Bindung und Elution, doch war selbst in der letzten Fraktion, die mit dem Elutionspuffer erhalten wurde, noch genug markiertes Protein 200 vorhanden, um ein deutliches Signal im Western-Blot hervorzurufen. 3.2.3.2.2 Sonogashira-Reaktionen am 1-181N-Ras-Protein Um die Sonogashira-Reaktion am Protein durchzuführen, wurde das iodierte Peptid 188 analog zu Schema 45 durch MIC-Ligation an das Protein 1-181N-Ras (Abb. 33, A) gebunden. Bei Einsatz von 1.6 Äq. des Peptids 188 war das monofunktionalisierte Protein (bei dem nur das C-terminale Cystein reagiert) das Hauptprodukt (m/z = 21 200, s. MALDI-Spektrum inAbb. 33, B). 101 Spezieller Teil Abb. 33: MALDI-TOF-Analytik der MIC –Ligation des Peptids 188 an 1-181N-Ras. A: 1-181N- Ras; B: ligiertes Protein 201 (m/z = 21200). Dieses funktionalisierte Protein wurde unter Sonogashira-Bedingungen mit dem Alkin 195 umgesetzt (Schema 46) und anschließend mittels SDS-PAGE-Gel und Westernblot untersucht. 102 Spezieller Teil A B N N H H N N H H N OH O O O OH O HN O OH O O I O 201 HN NH N H O O 195 H + S 1-181N-RasCys-OH N N H H N N H H N OH O O O OH O HN O OH O O HN NH N H O OO 200 1-181N-RasCys-OH S 10 Äq. Pd(TPPTS)4, 10 Äq. CuI H2O/MeCN 9:1, Phosphat-Puffer pH 7.5, 16 h Schema 46: A Sonogashira-Reaktion des „iodierten“ 1-181N-Ras-Proteins 201. B SDS-Gel der Proteinfraktionen. Spur 1 Marker, Spur 2 1-181N-Ras1, Spur 3 Ligationsprodukt 200, Spur 4 Reaktionsprodukt 200 Pellet, Spur 5 Reaktionsprodukt 200 Überstand nach Einengen. Das SDS-PAGE-Gel zeigt eine Bandenverschiebung zwischen dem unfunktionalisierten Protein und dem Derivat mit dem MIC-ligierten Peptid (Schema 46, B, Spuren 2 und 3). Unter den Reaktionsbedingungen fiel ein großer Teil des Proteins aus (Schema 46 B, Spur 4), im Überstand war auch nach Einengen nur eine geringe Menge an Protein zu detektieren (Schema 46, B, Spur 5). Zwar legt die Analyse des Gels eine weitere Bandenverschiebung nach der Reaktion nahe, was für eine weitere Massenzunahme des Proteins durch eine erfolgte Reaktion spräche. Ein Westernblot mit einem Biotin-sensitiven Antikörper zeigte aber kein Signal. Eine Wiederholung des Experiments zeigte ein schwach verändertes Ergebnis. Inkubation des iodierten Proteins 201 mit einem bzw. zehn Äquivalenten des Palladium-Katalysators führte vor allem zu schneller Präzipitation des Proteins. Die Analyse der einzelnen Fraktionen ist in Abb. 34 gezeigt: Das Ras-Protein 103 Spezieller Teil konnte im abzentrifugierten Pellet beider Ansätze wieder gefunden werden (Abb. 34, Spuren 4,6). Darüber hinaus war es im Überstand der Lösung, in der mehr Katalysator anwesend war, detektierbar (Spur 3). A B C Abb. 34: SDS-Gel nach Sonogashira-Reaktion am N-Ras-Protein: A Fluoreszenz- Detektion, B Coomassie-Färbung, C Western-Blot mit α-Biotin. Spur 1 1-181N-Ras, Spur 2 Protein 201, Spur 3, 4 Ansatz mit 10 Äq. Pd-Katalysator, Überstand (3) und Pellet (4), Spur 5, 6 Ansatz mit 1 Äq. Pd-Katalysator, Überstand (5) und Pellet (6). Der Pfeil in C zeigt die Lage der N-Ras-Bande an. Interessanterweise konnte unter UV-Licht eine Fluoreszenz der mit Palladium- Katalysator behandelten Proteine beobachtet werden (Abb. 34, A, Spuren 3, 4, 6). Da das Acetylen 195 keinen Fluoreszenzfarbstoff trug, ist diese Beobachtung überraschend und es stellt sich damit die Frage, ob der Katalysator in Verbindung mit dem Protein bereits eine Fluoreszenz hervorrufen kann. Daran schlösse sich die Frage an, welche Aussagekraft die Experimente haben, die mit Acetylenen durchgeführt wurden, die mit einem Fluoreszenz- farbstoff markiert waren (s. Kap. 3.2.1). Im Western-Blot mit einem Antikörper gegen Biotin konnte für die mit Acetylen und Katalysator inkubierten Fraktionen ein Signal auf der Höhe der Ras-Bande detektiert werden. Diese waren aber nur schwach. Oberhalb der erwarteten Bande wurden zusätzliche Proteinbanden vom Biotin-Antikörper markiert. Diese zusätzlichen Banden wiesen eine stärkere Signalintensität auf. 104 Spezieller Teil Dies deutet darauf hin, dass sich unter den Reaktionsbedingungen oligomere Verbindungen des Proteins bilden, die ebenfalls von dem Acetylen-Baustein 195 markiert werden. 3.2.3.2.3 Untersuchungen mittels LA-ICP-MS Die Frage nach dem Auftreten eines Aggregates zwischen dem Protein und dem Palladium-Katalysator wurde im folgenden Experiment untersucht. Dabei wurde eine von Dr. N. Jakubowski und I. Feldmann am Institut für Spektrochemie und Angewandte Spektroskopie (ISAS) in Dortmund entwickelte Analysemethode angewendet: laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry (LA- ICP-MS).[138] In diesem Experiment wird die zu analysierende Substanz durch einen Laserstrahl von einem Träger – in diesem Fall einer Westernblot-Membran – ablatiert und in eine Plasmakammer überführt, aus der alle Isotope der vorkommenden Elemente quantitativ mittels Massenspektrometrie gemessen werden können (Skizze s. Abb. 35). Durch eine Korrelation zwischen dem Zeitpunkt der Ablation und dem zeitlichen Verlauf der Detektion eines Element- Ions im Massenspektrometer kann der Gehalt eines Isotops entlang einer Bahn der Blot-Membran verfolgt werden. Dieses Verfahren wurde für die Detektion von Palladium in den Reaktionsprodukten der Protein-Sonogashira-Reaktion eingesetzt. Laser Blot-Membran Plasma-Kammer Massenspektrometer Abb. 35: Versuchsaufbau LA-ICP-MS. Das iodierte Ras-Protein 201 wurde in der Sonogashira-Reaktion umgesetzt. Dabei konnte in einem SDS-PAGE-Gel das Auftreten der bereits berichteten Fluroeszenz bestätigt werden (Abb. 36). Bemerkenswerterweise trat das Fluoreszenzsignal dann auf, wenn in der Reaktionsmischung das Protein 201, das Acetylen 195 und der Palladium-Katalysator anwesend waren. Fehlte eine 105 Spezieller Teil dieser Komponenten, blieb die Fluoreszenz aus. Die molekulare Grundlage dieses Signals wurde nicht weiter untersucht. 201 + + + + + + + 195 + + - + + + + Pd + + + - - + + Cu + + + + + - - Abb. 36: Fluoreszenz nach Durchführung der Sonogashira-Reaktion am Protein 201 mit dem Alkin 195. Die Protein-Bahnen des in Abb. 36 gezeigten SDS-PAGE-Gels wurden auf eine PVDF- Membran geblottet und mittels ICP-MS untersucht. Diese Arbeiten wurden von Dipl.Ing. Ingo Feldmann am ISAS Dortmund durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Abb. 37 dargestellt. 106 Spezieller Teil A nRas 0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 Strecke, mm Bahn 1 Bahn 2 Bahn 3 B Katalyse an nRAS-MIC-iodo 0.0E+00 5.0E+06 1.0E+07 1.5E+07 2.0E+07 2.5E+07 3.0E+07 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Strecke, mm P d 10 6- In te n si tä t, cp s Bahn1 Bahn2 Bahn3 Bahn4 Abb. 37: Untersuchung des 106Pd-Gehaltes entlang der Westernblot-Spur mittels ICP-MS. Unter den 106Pd-Spuren ist jeweils die Proteinbeladung entlang der Membran gezeigt. A 1- 181N-Ras, B Produktgemisch nach Sonogashira-Reaktion (Messung: I. Feldmann, ISAS Dortmund). Das als Kontrolle untersuchte Protein 1-181N-Ras enthält nur wenig Palladium 106 (Abb. 37, A). Oberhalb des Grundrauschens ist nur ein sehr schwacher Ausschlag an der Position des Proteins in der Membran zu erkennen (vgl. die angegebene Spur im SDS-Gel). Das stärkste Signal ist am Ende der Bahn an der Membrankante zu sehen. 107 Spezieller Teil Im starken Kontrast dazu steht die in Abb. 37, B gezeigte Massenspur. Hier liegt die Intensität des 106Pd-Signals um den Faktor 10 über dem Grundrauschen. Besonders bemerkenswert dabei ist, dass die höchsten Ausschläge in der Massenspur mit den Positionen der Proteinbanden im SDS-Gel korrelieren. Der Ausschlag am Ende der Bahn ist ebenfalls in der gleichen Größenordnung (ca. 3 · 106) vorhanden. Die Ergebnisse dieser Messungen lassen darauf schließen, dass an dem Protein nach der Reaktion noch eine große Menge Palladium gebunden ist. Prinzipiell wäre es durch Kalibrierung der Proteinmenge möglich, den Gehalt an Palladium (stöchiometrisch) zu quantifizieren. Dies wurde im vorliegenden Experiment nicht durchgeführt. 3.2.4 Diskussion Der hohe Restgehalt an Palladium-Katalysator wirft unmittelbar die Frage nach der Anwendbarkeit der Palladium-Katalysator auf Protein-Substrate auf. Zum einen kann der Katalysator-Komplex durch Interaktion mit Seitenketten des Proteins die native Struktur des Proteins stören und damit die Funktionalität beeinflussen. Darüber hinaus ist im Hinblick auf zelluläre Anwendungen zu befürchten, dass das Palladium über das modifizierte Protein in die Zelle transportiert wird und dort eine eigene ungewünschte Aktivität ausübt. Um diese möglichen negativen Einflüsse zu minimieren, wären nach der Übergangsmetallkatalyse umfangreiche Aufreinigungsschritte notwendig, die dem Ziel einer schnellen und variablen Derivatisierung von Proteinsubstraten entgegenlaufen. Von noch größerer Bedeutung ist aber die Tatsache, dass die Sonogashira- Reaktion am Protein in Umsatz und Ausbeute fast unmöglich zu kontrollieren war. Die Aufreinigung über ein modifiziertes Streptavidin/Biotin-System führte nicht zur Isolierung des gewünschten Reaktionsproduktes. Wie gezeigt wurde, lassen sich aber mit Desthiobiotin markierte Proteine durchaus (wenn auch nur mit mäßigem Erfolg) an den eingesetzten Streptactin-Beads aufreinigen. Dies deutet darauf hin, dass die Sonogashira-Reaktion am Protein nicht oder nur in geringem 108 Spezieller Teil Umfang stattgefunden hat. Dies könnte auf folgende Ursachen zurückzuführen sein: a) Das Protein präsentiert an seiner hydrophilen Oberfläche zu viele potentielle Koordinationsstellen, so dass der Katalysator immer wieder eingefangen wird oder dauerhaft gebunden wird. b) Findet der Katalysator-Komplex seinen Reaktionspartner, in diesem Falle einen Iodaromaten, und findet die oxidative Addition statt, könnte sich die Konformation des Proteins ändern und der reaktive Komplex abgeschirmt werden. In diesem Fall wäre z.B. die Protolyse durch H2O begünstigt, die in der Tat durch die Detektion des de-iodierten MIC-Markers nachgewiesen werden konnte. Die während der hier vorliegenden Untersuchung Übergangsmetall- katalysierter Reaktionen an Protein-Substraten aufgetretenen Schwierigkeiten, vornehmlich hinsichtlich eines kontrollierbaren Reaktionsumsatzes, des Problems der Aufreinigung der Reaktionsprodukte und der Abtrennung der Katalysatorrückstände, führten schließlich zur Einstellung der Experimente. Zeitgleich zu den hier dargelegten Arbeiten führten Yokoyama et al. eine ähnliche Studie durch, in der ein para-Iodphenylalanin durch ein in vitro Translationssystem in ein Ras-Protein eingeführt und mittels einer Heck-Reaktion derivatisiert wurde.[139] Im Zuge dieser Experimente konnte das gewünschte Reaktionsprodukt, ebenfalls ein biotinyliertes Protein, nachgewiesen werden. Dies geschah durch Detektion mittels LC-MS und durch Western-Blot-Analyse der Reaktionsmischung. Die Autoren kalkulierten den Umsatz der Palladium- katalysierten Heck-Reaktion jedoch auf ca. 2 %. Damit konnte auch in diesem Fall nicht gezeigt werden, dass sich Übergangsmetall-katalysierte Reaktionen für die chemische Modifikation von Proteinen eignen. 109 Spezieller Teil 110 4 Zusammenfassung Die Untersuchung biologischer Prozesse mit Hilfe kleiner Moleküle hat sich in den letzten Jahren zu einem eigenständigen Gebiet der Chemischen Biologie entwickelt. Auf der Suche nach Verbindungen mit bisher unbekannter biologischer Aktivität wurden Naturstoff-abgeleitete Verbindungsbibliotheken synthetisiert. Im Gegensatz zu häufig angewendeten Synthesestrategien in der kombinatorischen Chemie, die vornehmlich auf einfachen Zugang und große Substanzzahlen abzielen, enthalten Naturstoff-abgeleitete Bibliotheken eine begrenzte Anzahl von Mitgliedern. Diese werden aufgrund ihrer strukturellen Ähnlichkeit zu Naturstoffen als besonders Erfolg versprechend angesehen. Naturstoffe werden zum Ausgangspunkt der Wirkstoffsuche gemacht, da sie evolutionär selektiert wurden, mit Biomolekülen wie Proteinen Wechselwirkungen einzugehen. Ziel der Naturstoff-abgeleiteten Synthese ist es, die Affinität eines molekularen Gerüstes für den Faltungs-konservierten Liganden-erkennenden Kernbereich einer Proteindomäne zu nutzen, dabei aber durch Variation des Grundgerüstes die Spezifität zu vergrößern oder mögliche Nebenwirkungen (wie z.B. unspezifische Toxizität) zu verringern. α,β-ungesättigten δ-Laktone bilden eine Gruppe von Naturstoffen mit einem breiten biologischen Aktivitätsprofil. Stoffe dieser Klasse inhibieren z.B. die Phosphatase PP2A oder stören die Tubulin-Polymerisation. Für mehrere dieser Naturstoffe wurde das ungesättigte Lakton als essentiell für die biologische Aktivität nachgewiesen. Dies führte zu der Überlegung, dass es sich hierbei um einen viel versprechenden Ausgangspunkt für die Synthese einer Verbindungsbibliothek handeln könnte. Da neben sehr komplexen Naturstoffen auch kleinere Moleküle biologische Aktivität aufwiesen, wurde die Synthese solcher Verbindungen gezielt in Erwägung gezogen. Gegenstand dieser Arbeit war die Entwicklung von Synthesestrateigen zur stereoselektiven Synthese von α,β-ungesättigten δ-Laktonen an der festen Phase. Zusammenfassung Ein erster Zugang zu der Zielstruktur konnte durch eine Synthesesequenz erhalten werden, die auf enantioselektiven Allylierungen und Ringschluss- metathese an der festen Phase beruht. Dabei konnten sowohl das stereogene Zentrum in der C-6 Position des Laktons, als auch weitere sekundäre Hydroxylgruppen in der Seitenkette mit hoher Stereoselektivität generiert werden. Eine Übersicht über die Entwicklung der Sequenz ist in Schema 47 dargestellt. PS Harz Si Cl i-Pr i-Pr O H O 75 0.5-0.7 mmol/g 25 % HO1) 2,6-Lutidin, cat. DMAP 2) O3, CH2Cl2,-78 °C dann PPh3 79 O OH 82 60, THF, -78 °C dann H2O2, DMF/MeOH B 2 60 1) Acryloylchlorid, NEt3, DMAP 2) 40 %mol 95 3) HF/Pyridin O O HO 93 Ru O NN ArAr Cl Cl 95 12 % Gesamtausbeute 89 %ee 1) TBSCl, Imidazol, cat. DMAP, DMF 2) (i) O3, (ii) PPh3 3) 60, THF, dann H2O2 O OR OH 98 dr 85 :15 HO OH O 101 O 19 % HO OH OH O O 111 26 % bezogen auf 107 O OR OR OH 1) TBSCl, Imidazol, cat. DMAP, DMF 2) (i) O3, (ii) PPh3 3) l-Ipc2BAll ent-60 R = TBS R = TBS107 HO OH OH O O 110 3 % bezogen auf ent-98 O OH ent-82 analog dazu Schema 47: Übersicht über die Entwicklung der Synthese-Sequenz zu α,β- ungesättigten δ-Laktonen über enantioselektive Allylierungen und Ringschlussmetathese. 112 Zusammenfassung Brom-Polystyrol-Harz wurde nach Metall-Halogen-Austausch mit Diisopropyldichlorsilan funktionalisiert. An dieses polymergebundene Silyl- chlorid wurde 4-Penten-1-ol gebunden, welches durch Ozonolyse in den immobilisierten Aldehyd 79 umgewandelt wurde. Enantioselektive Allylierung mit dem Brown-Allylboran d-Ipc2BAll lieferte den immobilisierten Homo- allylalkohol 82, der mit Acrylsäurechlorid verestert werden konnte. Die Ringschlussmetathese zum ungesättigten Lakton erfolgte am immobilisierten Substrat mit 40 mol% des Hoveyda-Grubbs II-Katalysators 95. Alternativ konnte aus dem Homoallylalkohol 82 aber auch erneut ein Aldehyd gewonnen werden, der für eine weitere asymmetrische Allylierung zur Verfügung stand. Das syn-Diol 98 konnte ebenfalls in ein α,β-ungesättigtes δ-Lakton (101) umgewandelt werden. Eine weiterer Zyklus von Ozonolyse und Allylierung, diesmal mit l-Ipc2BAll, führte nach Ringschlussmetathese zum syn, anti-Triol 111. Damit konnte gezeigt werden, dass auf diesem Weg α,β-ungesättigte δ- Laktone an der festen Phase enantio- und diastereoselektiv zugänglich sind. Die Synthese wurde nachfolgend auf Naturstoffe und ihre Diastereomere angewendet. Cryptocarya Diacetat 113 und Cryptocarya Triacetat 135 (Schema 48) wurden aus dem afrikanischen Baum C. Crassifolia extrahiert. Durch Anwendung der oben skizzierten Synthesesequenz gelang es Dr. A. B. García und Dr. J. D. Umarye, alle Diastereomere der Naturstoffes 113 zu erhalten. Die Sequenz ließ sich sogar noch ausweiten, um zu einem (TBS- geschützten) Diastereomer des Triacetats 135 zu gelangen. Dabei wurde das Endprodukt 131 nach 14 linearen Stufen am polymeren Träger in 2 % Gesamtausbeute erhalten. 113 Zusammenfassung OEt OO OROH OR O O 131 R = TBS 2 % nach 13 Stufen (R)-127 oder (S)-127 OH OR O O OAcOAc OAc O O 135 Cryptocarya Triacetat R = TBSalle Diastereomere OAc OAc O O 113 Cryptocarya Diacetat Schema 48: Synthese von Verbindungen aus der Cryptocarya-Gattung. Des Weiteren gelang auf diesem Weg die Synthese des deacetylierten Naturstoffs 114, der aus R. Anisata isoliert wurde (Schema 49). Der dafür benötigte Baustein konnte enantiomerenrein erhalten werden und in neun Stufen, darunter, zwei syn-selektiven Allylierungen, in das Endprodukt 136 transformiert werden. O O OTBS O O OH OH O O 4 O 4 OH 4 142 143 13617 Beladung 0.6 g mmol-1 OH 4 OHHF/Pyridin THF HF/Pyridin THF 144 63 % 5 % (9 Stufen) syn/anti 19:1 SiEt2 OAc OH O O 114 isoliert aus R. Anisata Schema 49: Synthese des Gerüstes des Naturstoffes 114. Mit diesen Beispielen konnte gezeigt werden, dass die enantioselektiven Allylierungen nach Brown in der Synthese an der festen Phase mit hoher Stereoselektivität ablaufen und für die Synthese von Diastereomer- Bibliotheken eines Grundgerüsts geeignet sind. 114 Zusammenfassung Ein zweiter Zugang zu den Zielverbindungen sollte durch eine Übergangsmetall-katalysierte, enantioselektive hetero-Diels-Alder-Reaktion zwischen dem immobilisierten Dien 156 und Ethylglyoxylat 155 erreicht werden. Dafür wurden verschiedene Katalysatoren und Reaktionsbedingungen untersucht (Tabelle 14). O O O OEt O O H O OEt + 50 mol% Katalysator s. Tab. X 156 157 O OEt O O 160 CrO3, H2SO4 Aceton 6 155 Eintrag Katalysator Lösungsmittel Temperatur Selektivität (Konfig. an C-6) 1 O O Ti(OiPr)2 CH2Cl2 -30 °C 87 %ee (R) 2 O O Ti(OiPr)2 CH2Cl2/Toluol 1 : 1 -30 °C 48 %ee (R) 3 O O Ti(OiPr)2 Dichlorethan -30 °C 48 %ee (R) 4 O O Ti(OiPr)2 CH2Cl2 -30 °C 19 %ee (R) 5 N OO N Cu TfO OTf CH2Cl2 -30 °C 45 %ee (R) 6 N OO N t-Bu t-Bu Cu TfO OTf THF 0 °C 85 %ee (S) Tabelle 14: Hetero-Diels-Alder Reaktion an der festen Phase Der für eine ähnliche Reaktion in Lösung bekannte Katalysator aus (R)-BINOL und Titantetraisopropylat führte auch bei Einsatz des immobilisierten Diens 156 zu hohen Enantiomerenüberschüssen, besonders in Dichlormethan. Weitere Katalysatoren wurden getestet. Während sich eine teilweise Hydrierung des BINOL-Liganden negativ auf die Enantioselektivität 115 Zusammenfassung auswirkte (Eintrag 4), konnten mit dem Kupfer(II)-basierten tBu-Box- Katalysator (Eintrag 6) an der festen Phase Enantiomerenüberschüsse erzielt werden, wie sie auch für vergleichbare Systeme in Lösung berichtet wurden. Allerdings schloss der geringe Umsatz, der mit diesem Katalysator erreicht wurde, eine Anwendung in der Synthese einer Verbindungsbibliothek aus. Das immobilisierte Cycloaddukt 157 sollte in zwei Stufen in den Aldehyd 166 (Schema 50) transformiert werden, der Ausgangspunkt für weitere Diversifizierungsschritte mit Enolaten sein sollte. H O O O OEt 157 O O OH 176 LiBH4 THF IBX DMSO/THF O O O 166 OH O O 179 R' O R R R' OM Schema 50: Transformationen des Cycloaddukts 157 Die Oxidation zum Aldehyds 166 erwies sich jedoch als kritisch. Hier konnte – wenn überhaupt – nur unvollständiger Umsatz erzielt werden. Auch gelang es nicht, das Reaktionsprodukt einer Aldol-Reaktion am Aldehyd (179) zu isolieren. Da die C-C-Einfachbindung an dieser Stelle nicht aufgebaut werden konnte, wurde dieser Weg für die Synthese einer Naturstoff-abgeleiteten Bibliothek als wenig aussichtsreich angesehen. Eine Methode zur Untersuchung von Struktur und Aktivität von Proteinen ist die Einführung nicht-natürlicher Funktionalitäten wie z.B. Fluoreszenzfarbstoffen oder molekularer „Anker“ für die Affinitätschroma- tographie. Im zweiten Teil dieser Arbeit sollte die Möglichkeit untersucht werden, Palladium-katalysierte Kreuzkupplungsreaktionen zur Einführung solcher nicht-natürlicher Funktionalitäten an entsprechend modifizierte Pro- teine zu nutzen. Dies wurde anhand der Sonogashira-Reaktion untersucht, in der ein terminales Alkin und eine halogenierte aromatische Verbindung mit einem Palladium-Katalysator in Gegenwart von Cu(I)-Verbindungen gekuppelt werden. Um ein Reaktionsprodukt zu erhalten, das reversibel an Streptavidin bindet und durch Affinitätschromatographie aufgereinigt werden kann, wurde das Acetylen 195 (Schema 51) aus Desthiobiotin und 4-Ethinylanilin synthetisiert. 116 Zusammenfassung Desthiobiotin bindet um Größenordnungen schwächer an Streptavidin als Biotin. Nach ersten Experimenten an einem Peptid, in das ein 4-Iodphenylalanin inkorporiert war, wurde die Sonogashira-Reaktion unter physiologischen Bedingungen (pH 7.5) an dem Peptid 188 getestet, welches später durch eine MIC-Ligation an ein Protein gebunden werden sollte. Dabei wurden 10 mol% eines Palladium-Katalysators eingesetzt, der durch Sulfonsäuregruppen am Phosphinliganden wasserlöslich war. 188 N N H H N N H H N OH O O O OH O HN O OH O O HN NH N H O O O 198 NH HN N H O O 195 H + 10 mol% Pd(TPPTS)4, 10 mol% CuI H2O/MeCN ~1 : 1 Phosphat-Puffer pH 7.5 Raumtemperatur, 30 min 85 % N H NH N H O O HO N H O N O O H N O COOH OH O I 5 Schema 51: Sonogashira-Reaktion an einem Peptid unter physiologischen Bedingungen. Das Kupplungsprodukt 198 konnte in 85 % Ausbeute isoliert werden. Dieses Ergebnis konnte jedoch am Protein nicht reproduziert werden. Wurde das Peptid 188 über das Maleinimid an ein verkürztes Ypt7-Protein oder das 1-181N-Ras-Protein ligiert, konnte das Reaktionsprodukt der Sonogashira- Kupplung auch bei Einsatz von 10 Äquivalenten des Palladium-Katalysators nicht detektiert werden (Schema 52). 117 Zusammenfassung N N H H N N H H N OH O O O OH O HN O OH O O I O 201 HN NH N H O O 195 H + S 1-181N-Ras-Cys-OH N N H H N N H H N OH O O O OH O HN O OH O O HN NH N H O OO 200 S 10 eq. Pd(TPPTS)4, 10 eq. CuI H2O/MeCN Phosphat-Puffer pH 7.51-181N-Ras-Cys-OH Schema 52: Sonogashira-Kupplung am 1-181N-Ras-Protein. Durch massenspektroskopischen Nachweis konnte gezeigt werden, dass das Protein nach der Reaktion und gelelektrophoretischer Auftrennung noch signifikante Mengen an Palladium enthielt. Es könnte durch chelatisierende funktionelle Gruppe an der Oberfläche des Proteins koordiniert worden sein. Da sich das Reaktionsprodukt der Sonogashira-Kupplung am Protein nicht nachweisen ließ und die Aufreinigung des Proteins problematisch war, wurde die Perspektive für eine Entwicklung zu einer schnellen und variablen Routinemethode zur Modifikation von Proteinen als kritisch angesehen und die Experimente eingestellt. 118 5 Experimenteller Teil 5.1 Allgemeines, Messgeräte, Hilfsmittel NMR-Spektren wurden mit einem Varian Mercury-VX 400 und einem Bruker AVANCE DRX 500 aufgenommen. Die Auswertung erfolgte nach erster Ordnung. Die in ppm angegebenen chemischen Verschiebungen beziehen sich auf das jeweilige Restsignal des nicht deuterierten Lösungsmittels. 1H-Signalmultiplizitäten sind wie folgt abgekürzt: s = Singulett, d = Dublett, t = Triplett, q = Quartett, br.s = breites Singulett, m = Multiplett. 13C-Signalmultiplizitäten sind folgendermaßen abgekürzt: s = Singulett (quartäres C-Atom), d = Dublett (Methingruppe), t = Triplett (Methylengruppe), q = Quartett (Methylgruppe). Optische Drehungen wurden auf einem Schmidt&Hänsch Polartronic HHP Polarimeter ermittelt und sind auf die Wellenlänge der Natrium-D-Linie (589 nm) bezogen. Die Konzentration c in g/100 ml und das verwendete Lösungsmittel sind bei den jeweiligen Substanzen angegeben. Hochaufgelöste Massenspektren wurden mit einem Jeol SX102A Spektrometer gemessen. Als Ionisierungsmethode wurde Fast Atom Bombardment (FAB) mit m-Nitrobenzylalkohol als Matrix verwendet. MALDI-TOF Massenspektren wurden an einem Voyager DETM Pro Biospectrometry Workstation Spektrometer der Firma PerSeptive Biosystems gemessen, als Matrix wurde 2,5-Dihydroxybenzoesäure (DHB) eingesetzt. Gekoppelte Liquid Chromatography-Massenspektrometrie (LC-MS) wurde an einem Agilent Series 1100-System der Firma Hewlett Packard mit einer CC 250/4 Nucleosil 120-5 C4 oder einer C18 Gravity-Säule der Firma Macherey-Nagel durchgeführt. Das ESI-Massenspektrometer war ein LCQ Advantage MAX der Firma Finnigan. Experimenteller Teil Sofern nicht anders angegeben, wurde folgender Gradient auf der C18-Säule verwendet: C18grav_split4pos: Laufmittel A: 0.1 % HCOOH in H2O; Laufmittel B: 0.1 % HCOOH in Acetonitril; Flussrate 1 ml/min, 1 min 10 % B, dann linearer Anstieg auf 100 B in 9 min, 2 min 100 % B. Gekoppelte Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) wurde mit einem Gaschromatographen 6890 der Fa. Hewlett Packard mit einer Kapillarsäule HP-5MS, 25 m × 0.2 mm; 0.33 µm. der Fa. Agilent, Helium als Trägergas und einem Massendetektor 5973 von der Fa. Hewlett Packard durchgeführt. Es wurden zwei Temperaturprogramme verwendet: DB_50_S: 50 °C (2 min halten), dann 40 °C/min auf 300 °C (5.75 min halten) DB_100_S: 100 °C (1 min halten), dann 40 °C/min auf 300 °C (5.0 min halten) UV-spektroskopische Messungen wurden an einem Cary 100 der Firma Varian gemessen. FT-IR-Spektren wurden an einem Vector 22-Spektrometer der Firma Bruker aufgenommen. Die Bandenintensitäten sind wie folgt abgekürzt: s = stark, m = mittel, w = schwach, br = breites Signal. Schmelzpunkte wurden an einer Schmelzpunktapparatur 540 der Fa. Büchi gemessen und sind unkorrigiert. Für die Dünnschichtchromatographie (DC) wurden mit Kieselgel 60 F254 beschichtete Aluminiumplatten der Fa. Merck verwendet. Laufmittel und Rf- Werte sind bei den jeweiligen Substanzen angegeben. Zur Detektion wurden UV-Licht (λ = 254 nm) und folgende Anfärbereagenzien verwendet: 120 Experimenteller Teil Reagenz A 2.5 g Molybdatophosphorsäure, 1 g Cer(IV)-sulfat und 6 ml konz. Schwefelsäure in 94 ml Wasser Reagenz B 0.5%ige Lösung von Kaliumpermanganat in Wasser Für die präparative Säulenchromatographie wurden folgende stationäre Phasen verwendet: Kieselgel der Fa. Acros mit der Korngröße 35–70 µm. Basisches oder neutrales Aluminiumoxid (Alox) der Fa. Fluka mit der Korngröße 50–150 µm. Für die analytische chirale HPLC wurde ein Agilent Serie 1100-System mit einer Chiralpak AD-H Säule (Daicel Chemical Industries) eingesetzt. Für die MS-gekoppelte, präparative HPLC wurde folgendes System verwendet: Agilent Series 1100/LC/MSD VL (ESI); Vorsäule: VP50/21 Nucleodur C18 Gravity 5 µm, Hauptsäule: VP125/21 Nucleodur C18 Gravity 5 µm, (beide Macherey&Nagel); Detektion: 210 und 254 nm; Flussrate: 25 ml/min; Wasser für HPLC-Trennungen wurde durch ein Milli-Q-System mit Q- Gard 2-Kartuschen der Fa. Millipore gereinigt. Eluent A: Acetonitril + 0.1 %TFA; Eluent B: Wasser + 0.1 % TFA. Als Lösungsmittel für die Ionisierung wurde Wasser/Acetonitril 1:1 + 0.1 % Ameisensäure verwendet. Es wurde folgender Gradient verwendet: TL321_STD210MM_MS_ON.M: 0 min 10 % A → 1 min 10 % A → 12 min 100 % A → 15 min 100 % A. Zum Einengen der Substanzen nach der präparativen HPLC-Trennung wurde eine alpha 2-4 Lyophyllisiereinheit der Firma Christ verwendet. Alle Reaktionen fanden unter einer Inert-Atmosphäre aus Argon statt. Glasgeräte wurden vor dem Einsatz im Hochvakuum ausgeheizt und nach Abkühlen mit Argon gespült. 121 Experimenteller Teil Lösungsmittel wurden in wasserfreier Form eingesetzt: Diethylether, Tetrahydrofuran und Methanol wurden in getrockneter Form über Molsieb von der Firma Fluka bezogen. Dichlormethan und Acetonitril wurden über Calciumhydrid getrocknet und vor Gebrauch destilliert. Pentan wurde über basischem Aluminiumoxid vorgetrocknet und von Natrium- Ketyl destilliert. Die Harze für die Synthese an der festen Phase wurden von den Firmen Novabiochem oder Rapp Polymere bezogen. Alle übrigen Chemikalien wurden von den Firmen SIGMA-ALDRICH, ACROS, Fluka oder ABCR erworben und ohne weitere Aufreinigung eingesetzt. 122 Experimenteller Teil 5.2 Methoden zur Beladungsbestimmung an der Festphase Bestimmung der Beladung von Aldehyden nach der DNPH-Methode[111] Zunächst werden 100 ml Maßlösung aus 100.0 mg (0.51 mmol) 2,4- Dinitrophenylhydrazin (DNPH) in THF hergestellt. Die Absorption A0 bei 350 nm der zehnfach verdünnten Maßlösung wird in einer 1 mm Quartz- Küvette gemessen. Eine Suspension von 20 mg immobilisierten Aldehyd mit 10 ml Maßlösung wird mit fünf Tropfen TFA versetzt und 2 h bei RT geschüttelt. Wiederum wird ein Teil der Lösung auf das zehnfache verdünnt und die Absorption A1 bei 305 nm in einer 1 mm Küvette gemessen. Die Beladung wird nach folgender Formel bestimmt (V = 1000, m = 20 mg, c0 = 504.7 mmol/l): )1(524.2)1( 0 1 0 10 0 1 0 1 A A A A m cV c A A c c B −⋅=−⋅⋅=⇒= Bestimmung der Beladung von Aldehyden nach der FmPH Methode[68] Zu 5 mg des Aldehyd-Harzes in 0.5 ml DMF werden 3 Äq. FmPH·TFA (3.3 mg bei einer Harzbeladung von ca. 0.5 mmol/g), 3 Äq. (2.6 μl DIPEA) und 0.5 ml Trimethoxyorthoformiat gegeben. Es wird 30 min auf 80 °C erwärmt, und nach Filtration mit je 5 x DMF, MeOH und wieder DMF gewaschen. Nach kurzem Trocknen am Hochvakuum (30 min) wird das Harz in 1 ml DMF/Piperidin 1 : 1 aufgenommen. Nach 30 min wird die Lösung in einem 50 ml-Maßkolben gesammelt, das Harz noch 5 x mit DMF/Piperidin 1 : 1 gewaschen. Alle Fraktionen werden in dem Maßkolben aufgefangen und schließlich auf 50 ml aufgefüllt. In einer 1 cm Quartz-Küvette wird die Absorption der Lösung bei 301 nm gegen das DMF/Piperidin-Gemisch bestimmt. Die Beladung wird nach folgender Formel bestimmt: cAldehyd = m VA ⋅ ⋅⋅ ε 1000 [mmol/g] mit ΔA = Absorption, V = Volumen in ml (hier 50 ml), ε = 7800 M-1 cm-1, m = Masse in mg 123 Experimenteller Teil Bestimmung der Beladung von primären Alkoholen mit der Fmoc- Methode[123] 30 mg (ca. 15-30 μmol) des Harzes werden in 5 ml Dichlormethan mit 55 mg (0.21 mmol) Fmoc-Chlorid und 17 mg (0.22 mmol) Pyridin versetzt und 5 h bei Raumtemperatur geschüttelt. Nach Filtration wird fünfmal mit Dichlormethan gewaschen und im Vakuum getrocknet. 1.50 mg des so erhaltenen Harzes werden in 3 ml DMF/Piperidin 4 : 1 30 min bei Raumtemperatur geschüttelt. Anschließend werden zweimal je 1.0 ml von der überstehenden Lösung mit weiteren 2 ml DMF/Piperidin 4 : 1 verdünnt. Im UV-Spektrometer wird in einer 1 cm Quartz-Küvette die Absorption A bei 301 nm gemessen. Die Konzentration des Dibenzofulven-Piperidin-Adduktes ergibt sich zu: d A c ⋅ ⋅= εν 310 Die Beladung cB des Harzes mit Fluorenylgruppe wird mit folgender Formel bestimmt (V = 9 ml, ε = 780, m = eingewogene Masse): m A m Vc cB ⋅ ⋅⋅=⋅= 7800 9103ν 124 Experimenteller Teil 5.3 Versuche zu Kapitel 3.1.2 AAV 1: Synthese und Beladung der Silyl-Linker Bromo-PS-Harz (2.68 mmol/g, 100-200 mesh) wurde 2 x in Toluol gequollen, abfiltriert und über Nacht im Hochvakuum getrocknet. Von dem auf diese Weise vorbereiteten Harz wurden n mmol-Äquivalente in einen Schlenk- Kolben überführt und in 5n ml Toloul gequollen. Es wurde mit 3n mmol einer 2.5M Lösung von n-BuLi in Hexan versetzt und bei 60 °C über 3 h langsam gerührt. Dann wurden erneut 3n mmol n-BuLi zugegeben, und es wurde über Nacht bei 60 °C gerührt. Dabei nahm das Harz eine dunkelrote bis tiefschwarze Farbe an. Unter Argon wurde das Harz in einen Rosenbaum- Reaktor überführt und filtriert. Es wurde mit Toluol und 5 x THF gewaschen und in 1.5n ml THF aufgenommen. Nun wurden 4 Äq. des Silans (Diisopropyldichlorsilan für primäre Alkohole, Diethyldichlorsilan für sekundäre Alkohole) tropfenweise (Hitzeentwicklung!) mit einer Spritze zugegeben. Dabei verschwand die Farbe des Harzes fast vollständig. Nach 2 h Schütteln bei Raumtemperatur wurde erneut filtriert, mit THF (2 x) und DCM (2 x) gewaschen und in DCM aufgenommen. Es wurden 0.5n mmol DMAP, 2n mmol 2,6-Lutidin und 2n mmol des primären Alkohols zugegeben. Dann wurde über Nacht bei Raumtemperatur geschüttelt, filtriert und gewaschen: 3 x DCM, 2 x DMF, 2 x DMF/H2O 3 : 1, 2 x DMF, 5 x DCM und 2 x MeOH. Abschließend wurde im Hochvakuum getrocknet. AAV 2: Ozonolyse immobilisierter Alkene zu Aldehyden In einem Schlenk-Kolben wurden n g des Harzes in 20n ml DCM gequollen und auf -78 °C abgekühlt. Bei dieser Temperatur wurde durch eine Fritte Ozon eingeleitet, durch öffnen des Schlenkhahnes wurde ein Überdruck vermieden. Nachdem das Lösungsmittel mit Ozon gesättigt war, angezeigt durch einer tiefblaue Farbe, wurde das Einleiten in Abhängigkeit vom verwendeten Linker fortgesetzt: Im Falle des Wang-Linkers wurde weitere 1- 4 min, im Falle der Silyl-Linker 8-10 min Ozon eingeleitet. Unmittelbar nach Ende der Reaktionszeit wurde Argon eingeleitet, um überschüssiges Ozon zu verdängen. Nachdem das Lösungsmittel wieder farblos war, wurden 5 Äq. Triphenylphosphin (bezogen auf die theoretische Beladung des Harzes) 125 Experimenteller Teil zugegeben. Nun wurde die Suspension langsam (16 h) auf Raumtemperatur gebracht. Das Harz wurde filtriert und mit DCM (5 x) und Methanol (2 x) gewaschen. Es wurde im Hochvakuum getrocknet. AAV 3: Asymmetrische Allylierung von immobilisierten Aldehyden Das mit n mmol Aldehyd beladene Harz wurde getrocknet, indem Rückstände von Wasser 2-3 mal mit Toluol azeotrop destilliert wurden. Anschließend wurde mind. 3 h im Hochvakuum getrocknet. Das Harz wurde in THF gequollen (10 ml/g Harz) und im Kältebad auf -78 °C abgekühlt. Dann wurden 3-6 Äq. eine 1M Lösung des entsprechenden Allylborans in Ether zugegeben, und es wurde mindestens 8 h geschüttelt, wobei das Lösungsmittel Raumtemperatur annahm. Überschüssiges Boran wurde mit MeOH (1 ml/g Harz) gequencht, und das Harz wurde filtriert und gewaschen: 2 x pH 7 Puffer, 2 x H2O, 4 x THF, 4 x Et2O, 4 x DCM, 2 x MeOH. Nach kurzem Trocknen (1 h) im Hochvakuum wurde in DMF gequollen (ca. 6 ml/g Harz), auf 0 °C abgekühlt und mit MeOH (ca. 6 ml/g Harz), pH 7 Puffer (2 ml/g Harz) und 30% H2O2. in H2O (2 ml/g Harz) versetzt. Es wurde 2 h bei 0 °C (Wang- Linker) bzw. Raumtemperatur (Silyl-Linker) geschüttelt, danach filtriert und gewaschen: 2 x H2O, 4 x THF, 4 x Et2O, 4 x DCM, 2 x MeOH. Es wurde im Hochvakuum getrocknet. AAV 4: TBDMS-Schützung der immobilisierten Homoallylalkohole Das mit n mmol Homoallylalkohol beladene Harz wurde in DMF (7- 10 ml/g Harz) gequollen und mit 5n mmol TBDMS-Chlorid, 5n mmol Imidazol und 0.3n mmol DMAP versetzt. Nach 24 h schütteln bei Raumtemperatur wurde das Harz filtriert und gewaschen: 3 x DMF, 2 x H2O, 3 x THF, 3 x DCM, 2 MeOH. Es wurde im Hochvakuum getrocknet. AAV 5: Acylierung der immobilisierten Homoallylalkohole mit Acryloylchlorid Das mit n mmol Homoallylalkohol beladene Harz wurde in DCM (8 ml/g Harz) gequollen und auf 0 °C abgekühlt. Sodann wurden 5n mmol Acryloylchlorid, 5n mmol Triethylamin und 0.3n mmol DMAP zugegeben. Es wurde 15 h 126 Experimenteller Teil geschüttelt, wobei die Reaktionsmischung Raumtemperatur annahm. Anschließend wurde das Harz filtriert und gewaschen: 4 x DCM, 4 x DMF, 4 x DCM, 2 x MeOH. Es wurde im Hochvakuum getrocknet. AAV 6: Ringschlussmetathese zum immobilisierten α,β-ungesättigten δ- Lakton In einem Schlenk-Kolben mit Magnetrührstab wurde das mit n mmol des acylierten Homoallylalkohols beladene Harz in DCM (ca. 12 ml/g Harz) gequollen und ggf. mit 1n mmol Ti(OiPr)4 versetzt. Nun wurde eine Lösung von 0.2n mmol des jeweiligen Katalysators in 1-3 ml DCM zugegeben. Im Argonstrom wurde nun ein bei 101 °C gelagerter Rückflusskühler aufgesetzt und die Schliffverbindung sehr gut abgedichtet. Es wurde 3 h unter Rückfluss gerührt. Dann wurden erneut 0.2n mmol des Katalysators in DCM zugegeben, und es wurde weiter unter Rückfluss gerührt, bis die angegebene Reaktionszeit abgelaufen war. Nach Abkühlen wurde das Harz filtriert und gewaschen: 4 x DCM, 4 x DMF, 4 DCM. Es wurde im Hochvakuum getrocknet. AAV 7: Abspaltung vom Silyl-Linker Da bei Verwendung von HF keine Glasgeräte eingesetzt werden können, wurden die Abspaltungen je nach Reaktionsvolumen in 1.5 ml Eppendorf- Gefäßen oder 15 ml Falcon-Tubes mit Magnetrührstab und aufgesetztem Septum durchgeführt. Diese Reaktionsgefäße wurden mit Argon gespült, um eine Inertatmosphäre zu erreichen. Das getrocknete Harz wurde in THF (5-10 ml/g Harz) gequollen. Dann wurden Pyridin und HF/Pyridin mittels Spritze zugegeben. Bei der Zugabe von HF war eine sofortige Reaktion, angezeigt durch Hitzeentwicklung und fahle Dämpfe, zu beobachten. Für die Abspaltung eines Substrates vom Silyl-Linker wurde 6-8 h bei Raumtemperatur geschüttelt (Eppendorf-Gefäße) oder gerührt (Falcon Tubes). 127 Experimenteller Teil Für die Abspaltung eines Substrates vom Linker und gleichzeitiger Entschützung der Hydroxyfunktionen wurde eine Reaktionsdauer von mindestens 14 h bei 40 °C gewählt. Nach Ablauf der jeweiligen Reaktionszeit wurde unverbrauchtes HF mit einem großen Überschuss Trimethylsilylmethanol (ca. 5 ml TMSOMe pro ml HF/Pyridin) vernichtet. Dabei war ein Anstieg des pH-Wertes der Lösung auf 5-7 zu beobachten. Die Reaktionslösung wurde durch Kieselgel filtriert, das Kieselgel gründlich mit THF nachgewaschen. Das Filtrat wurde eingeengt und im Hochvakuum getrocknet. AAV 8: Abspaltung vom Wang-Harz mit DDQ In einem Schlenk-Kolben wurde das mit n mmol beladene Harz in 100n ml DCM gequollen und mit 4n ml Phosphat-Puffer pH 7 versetzt. Bei 0 °C wurden 10n mmol DDQ zugesetzt, und es wurde 16 h gerührt, wobei die Lösung Raumtemperatur annahm. Nach Zugabe von 100n ml NaHCO3 ges. wurde filtriert, und die Phasen wurden getrennt. Die wässrige Phase wurde 4 x mit DCM extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über MgSO4 getrocknet und eingeengt. AAV 9: TMS-Derivatisierung von Alkoholen und Polyolen für die GC-Analyse In einem mit Argon gespülten GC-Probengefäß wurden ca. 0.5 mg des zu untersuchenden Produktes in 0.5 ml N,O-Bis(trimethylsilylacetamid (BSA) gelöst und 30 min auf 80 °C erhitzt. Die auf diese Weise erhaltene Lösung wurde direkt mittels GC-MS untersucht. Dabei wurde stets die Methode DB_100_S verwendet, da bei geringerer Ofentemperatur das Lösungsmittel zu lange Retentionszeiten hatte. d-Diisopinocampheylallylboran (d-Ipc2BAll) (60) Zur Synthese des Brown-Reagenzes wurden n mmol (+)- Diisopinocampheylmethoxyboran in n ml Diethylether gelöst. Es wurde im Eisbad auf 0 °C abgekühlt, dann wurden langsam 0.9n ml einer 1M Lösung von Allylmagnesiumbromid in Diethylether zugetropft. Nach Entfernen des 128 Experimenteller Teil Eisbades wurde 1 h bei Raumtemperatur gerührt. Spätestens zu diesem Zeitpunkt trat ein weißer voluminöser Niederschlag von Magnesiumsalzen auf. Unter Rühren wurde der Ether im Vakuum entfernt, und das Rohprodukt wurde im Hochvakuum getrocknet (2.5 h). Dann wurde in 1.5n ml Pentan aufgeschlämmt. Nachdem sich der Niederschlag wieder gesetzt hatte, wurde der Überstand mit einer Transferkanüle durch eine Fritte in einen zweiten Kolben überführt. Dieser Vorgang wurde 4 x wiederholt, anschließend wurde das Pentan im Vakuum entfernt. Das auf diese Weise erhaltene transparente Öl wurde in Diethylether aufgenommen, so dass eine 1M Lösung entstand. Immobilisiertes 10-Undecen-1-ol (76) Nach AAV 1 wurden 3.38 g (9 mmol) Brom-PS-Harz mit 6.67 g (36 mmol) Diisopropyldichlorsilan und 2.96 g (17.2 mmol) 10-Undecen-1-ol umgesetzt. Nach Entfernen aller Lösungsmittelrückstände im Hochvakuum wurde ein leicht gelbliches Harz erhalten. FT-IR ν~ [cm-1] = 3000-2584 (br s), 2101 (m), 1943 (m), 1874 (m), 1807 (m), 1744 (w), 1599 (m). Immobilisiertes 4-Penten-1-ol (77) Nach AAV 1 wurden 3.08 g (8.1 mmol) Brom-PS-Harz mit 4.62 g (25 mmol) Diisopropyldichlorsilan und 1.05 g (12.2 mmol) 4-Penten-1-ol umgesetzt. Nach Entfernen aller Lösungsmittelrückstände im Hochvakuum wurde ein leicht gelbliches Harz erhalten. FT-IR ν~ [cm-1] = 3500-3000 (br s), 1944 (m), 1878 (m), 1802 (m), 1739 (w), 1667 (s), 863 (s). Immobilisiertes 10-Hydroxydecenal (78) Nach AAV 2 wurden 2.05 g des immobilisierten Alkens 76 in 40 ml DCM umgesetzt. Nachdem überschüssiges Ozon mit Argon verdrängt wurde, wurde bei -78 °C mit 3.73 g (14.2 mmol) Triphenylphosphin gequencht. 129 Experimenteller Teil Nachdem im Hochvakuum alle Lösungsmittelreste entfernt worden waren, wurde ein fast farbloses Harz erhalten, dessen Beladung mittels FmPH-Test zu 0.5-0.8 mmol/g bestimmt wurde. FT-IR ν~ [cm-1] = 3524 (br m), 2954 (s), 2719 (m), 1944 (m), 1875 (w), 1804 (w), 1726 (s), 1599 (m), 1457 (m). Immobilisiertes 4-Hydroxybutanal (79) Nach AAV wurden 2.8 g des immobilisierten Alkens 77 in 40 ml DCM umgesetzt. Nachdem überschüssiges Ozon mit Argon verdrängt wurde, wurde bei -78 °C mit 2.98 g (11.4 mmol) Triphenylphosphin gequencht. Nachdem im Hochvakuum alle Lösungsmittelreste entfernt worden waren, wurde ein fast farbloses Harz erhalten, dessen Beladung mittels FmPH-Test zu 0.5-0.8 mmol/g bestimmt wurde. FT-IR ν~ [cm-1] = 3447 (br m), 2948 (s), 2721 (m), 1946 (m), 1877 (w), 1806 (w), 1726 (s), 1597 (m), 1456 (w). Immobilisiertes (R)-12-Tridecen-1,10-diol (80) Nach AAV 3 wurden 1.00 g (0.5 mmol) des immobilisierten Aldehyds 78 in 10 ml THF mit 2.5 ml (2.5 mmol) einer 1M Lösung von d-Ipc2Ball in Et2O umgesetzt. Nach oxidativer Aufarbeitung und Entfernung aller Lösungsmittelreste am Hochvakuum wurde ein leicht gelbliches Harz erhalten. FT-IR ν~ [cm-1] = 3465 (br s), 2948 (s), 1943 (s), 1873 (w), 1806 (s), 1719 (m), 1643 (w), 1600 (m), 1461 (w). (R)-12-Tridecen-1,10-diol (81) 439 mg (0.31 mmol) des Harzes 80 wurden nach AAV 7 in 2.5 ml THF gequollen und mit 300 μl Pyridin und 400 μl HF/Pyridin umgesetzt. Es wurde 130 Experimenteller Teil mit 3 ml TMSOMe gequencht und am Vakuum eingeengt. Das Rohprodukt (87 mg) wurde blitzchromatographisch aufgereinigt (KG, 4.7 g, 8 x 1 cm, PE/EE 2 : 1 (v/v) + 0.1 % MeOH). Es wurden 62.3 mg (0.29 mmol, 93 %) eines farblosen Öls erhalten. Rf = 0.13 in PE/EE 2 : 1 (v/v) + 0.1 % MeOH. [α] : +4.9 ° (c 1.06, CHCl20D 3), Enantiomerenverhältnis 94 : 6 (bestimmt aus dem 1H NMR Spektrum des Mosher-Esters). HO OH 81 1 11 1H NMR (400.45 MHz, CDCl3): δ = 5.88-5.78 (m, 1H, 12-H), 5.16-5.11 (m, 2H, 13-H), 3.67-3.61 (m, 1H, 10-H), 3.63 (t, 2H, 3J = 6.6 Hz, 1-H), 2.34-2.27 (m, 1H, 11-Ha), 2.18-2.10 (m, 1H, 11-Hb), 1.60-1.30 (m, 16H, 2-H, 3-H, 4-H, 5-H, 6-H, 7-H, 8-H, 9-H). 13C NMR, DEPT (100.70 MHz, CDCl3): δ = 135.2 (d, C-12), 118.3 (t, C-13), 70.9 (d, C-10), 63.2 (t, C-1), 42.2 (t, C-11), 37.1 (t, C-9), 33.1 (t), 29.9 (t), 29.8 (t), 29.7 (t), 29.6 (t), 26.0 (t), 25.9. GC-MS des TMS-Derivates (DB_100_S): tR = 5.22 min, m/z (rel. Intens.) 357(1) [M-1]+, 343(3) [M-15]+, 317(85) [M-C3H5]+, 217(13), 157(12), 147(30), 129(28), 95(37), 73(100). MS (FAB) m/z 215.1 [M+H]+ HR-MS (FAB) ber. für C13H27O2 215.2011 [M+H]+, gef. 215.2039. Immobilisiertes (R)-6-Hepten-1,4-diol (85) Nach AAV 3 wurden 1.04 g (ca. 0.7 mmol) des immobilisierten Aldehyds 79 in 10 ml THF bei -78 °C mit 3.2 ml einer 1M Lösung von d-Ipc2BAll in Et2O umgesetzt. Nach oxidativer Aufarbeitung und Entfernung aller 131 Experimenteller Teil Lösungsmittelreste am Hochvakuum wurde ein leicht gelbliches Harz erhalten. FT-IR ν~ [cm-1] = 3447 (br s), 2952 (s), 1943 (s), 1806 (s), 1716 (m), 1560 (m), 1458 (w). (R)-6-Hepten-1,4-diol (82) Gemäß AAV 7 wurden 80 mg (0.06 mmol) des immobilisierten Alkohols in 0.9 ml THF mit 50 μl HF/Pyridin und 50 μl Pyridin umgesetzt. Es wurde mit 100 μl TMSOMe gequencht. Nach Filtration wurde das Rohprodukt auf Celite aufgezogen und blitzchromatographisch gereinigt (KG, 2.0 g, 9 x 1 cm, PE/EE 1 : 2 (v/v) + 0.1 % MeOH). Es wurden 7.5 mg (0.058 mmol, 96 %) eines farblosen Öls erhalten. Rf = 0.11 in PE/EE 1 : 2 (v/v) + 0.1 % MeOH. [α] : + 8.4 ° (c 0.75, CHCl20D 3), HO OH 82 1 1H NMR (400.45 MHz, CDCl3): δ = 5.88-5.77 (m, 1H, 6-H), 5.17-5.12 (m, 2H, 7-H), 3.73-3.63 (m, 3H, 1-H, 4-H), 2.36-2.27 (m, 3H, 2 O-H, 5-Ha), 2.23-2.17 (m, 1H, 5-Hb), 1.74-1.63 (m, 3H, 2-H, 3-H), 1.57-1.46 (m, 1H, 2-H, 3-H). 13C NMR, DEPT (100.70 MHz, CDCl3): δ = 134.7 (d, C-6), 118.2 (t, C-7), 70.6 (d, C-4), 63.0 (t, C-1), 42.1 (t, C-5), 33.8 (t, C-2 oder C-3), 29.2 (t, C-2 oder C- 3). Die angegebenen Daten stimmen mit der Literatur überein.[140] GC-MS (DB_50_S): tR = 4.85 min, m/z (rel. Intens.) 129(1) [M-H]+, 89(10) [M- allyl]+, 71(100), 57(5), 43(62), 41(38). 132 Experimenteller Teil Immobilisiertes (R)-13-hydroxytridec-1-en-4-yl acrylat (83) Gemäß AAV 5 wurden 805 mg (0.5 mmol) des immobilisierten Homoallylalkohols 81 in 15 ml DCM mit 333 mg (3.68 mmol) Acryloylchlorid, 319 mg (3.16 mmol) Triethylamin und 19 mg (0.15 mmol) DMAP umgesetzt. Nach Entfernen aller Lösungsmittelreste im Hochvakuum wurde ein leicht gelbliches Harz erhalten. FT-IR ν~ [cm-1] = 3500-3200 (br m), 2949 (s), 1943 (m), 1873 (w), 1806 (w), 1730 (s), 1642 (w), 1600 (m), 1459 (w). (R)-13-hydroxytridec-1-en-4-yl acrylat (84) 160 mg (0.08 mmol) des Harzes 83 wurden in 2.5 ml einer 1M Lösung von TBAF in DCM 16 h lang geschüttelt. Nach Filtration wurde 6 x mit DCM gewaschen. Die vereinigten Phasen wurden mit NaCl ges. gewaschen und eingeengt. Es wurde auf Celite aufgezogen und blitzchromatographisch gereinigt (KG, 2.7 g, 12 x 1 cm, PE/EE 4 : 1 (v/v) + 0.1 % MeOH). Es wurden 11.1 mg (0.04 mmol, 51 %) eines farblosen Öls erhalten. Rf = 0.20 in PE/EE 4 : 1 (v/v) + 0.1 % MeOH. [α] : + 15.91 ° (c 0.23, CHCl20D 3), HO O 84 1 O 1' 1H NMR, gCOSY, gHMBC (400.45 MHz, CDCl3): δ = 6.38 (dd, 1H, 2J = 1.5 Hz, 3J = 17.3 Hz, 3’-Ha), 6.10 (dd, 1H, 3J = 17.3, 10.4 Hz, 2’-H), 5.80 (dd, 1H, 2J = 1.5 Hz, 3J = 10.4 Hz, 3’-Hb), 5.80-5.71 (m, 1H, 2-H), 5.10-5.03 (m, 2H, 1-H), 5.02-4.96 (m, 1H, 4-H), 3.64 (t, 2H, 3J = 6.6 Hz, 13-H), 2.37-2.32 (m, 2H, 3-H), 1.61-1.27 (m, 16H). 133 Experimenteller Teil 13C NMR (100.70 MHz, CDCl3): δ = 165.9 (s, C-1’), 133.7 (d, C-2), 130.3 (t, C- 3’), 128.9 (d, C-2’), 117.6 (t, C-1), 73.6 (d, C-4), 63.1 (t, C-13), 38.6 (t, C-3), 33.6, 32.8, 29.44, 29.37 (2 x t), 29.3, 25.7, 25.2. MS (FAB) m/z 269.1 [M+H]+ HR-MS (FAB) ber. für C16H29O3 269.2117 [M+H]+, gef. 269.2128. Immobilisiertes (R)-7-Hydroxyhept-1-en-4-yl acrylat (86) Gemäß AAV 5 wurden 950 mg des immobilisierten Homoallylalkohols 85 in 15 ml DCM mit 444 mg (4.91 mmol) Acryloylchlorid, 290 mg (2.87 mmol) Triethylamin und 35 mg (0.29 mmol) DMAP umgesetzt. Nach Entfernen aller Lösungsmittelrückstände im Hochvakuum wurde ein gelbliches Harz erhalten. FT-IR ν~ [cm-1] = 3500-3200 (br m), 2954 (s), 1944 (m), 1873 (w), 1806 (m), 1728 (s), 1644 (w), 1600 (m), 1459 (w). Immobilisiertes (R)-7-Hydroxyhept-1-en-4-yl acrylat (87) Analog zu AAV 7 wurden 425 mg des Harzes 86 in 4 ml THF mit 300 μl Pyridin und 400 μl HF/Pyridin umgesetzt. Es wurde filtriert, das Harz wurde mit 3 x 2 ml THF gewaschen. Dann wurde mit 5 ml Ethylacetat verdünnt und mit 3 x 5 ml NaHCO3 ges. und 2 x 3 ml NaCl ges. gewaschen. Die wässrigen Phasen wurden mit 3 x 5 ml Ethylacetat rückextrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über MgSO4 getrocknet, eingeengt und blitzchromatographisch gereinigt (Alox neutral Aktivitätsstufe IV, 6 g, 6 x 1 cm, PE/EE 4 : 1 (v/v)). Auf diese Weise konnten 9.2 mg (0.05 mmol, 23 %) 87 als farbloses Öl neben 5.1 mg (0.04 mmol, 21 %) 82 isoliert werden. Rf = 0.23 in PE/EE 4: 1 /v/v) [α] : +11.06 ° (c 0.94, CHCl20D 3), 134 Experimenteller Teil O O 1' HO 1 87 1H NMR, gCOSY, gHSQC (400.45 MHz, CDCl3): δ = 6.39 (dd, 1H, 2J = 1.5 Hz, 3J = 17.3 Hz, 3’-Ha), 6.10 (dd, 1H, 3J = 17.3, 10.4 Hz, 2’-H), 5.81 (dd, 1H, 2J = 1.5 Hz, 3J = 10.4 Hz, 3’-Hb), 5.81-5.71 (m, 1H, 2-H), 5.11-5.00 (m, 3H, 1-H, 4-H), 3.65 (t, 2H, 3J = 6.3 Hz, 7-H), 2.39-2.35 (m, 2H, 3-H), 1.73- 1.56 (m, 4H, 5-H, 6-H). 13C NMR, (100.70 MHz, CDCl3): δ = 165.9 (s, C-1’), 133.4 (d, C-2’), 130.6 (t, C-3’), 128.7 (d, C-2), 117.9 (t, C-1). GC-MS (DB_50_S): tR = 5.81 min, m/z (rel. Int.): 167(1) [M-OH]+, 143(1) [M- C3H5]+, 94(3), 71(80), 55(100), 41(16), 31(12). MS (FAB): 185.1 [M+H]+ HR-MS (FAB): ber. für C10H17O3 185.1178 [M+H]+, gef. 185.1175. (R)-6-(9-Hydroxynonyl)-5,6-dihydro-2H-pyran-2-on (89) Analog zu AAV 8 wurden 1.12 g (0.5 mmol) des immobilisierten Acrylesters 83 in 12 ml DCM mit 148 μl (142 mg, 0.5 mmol) Titan(IV)tetraisopropoxylat versetzt, und es wurde mit insgesamt 194 mg (0.24 mmol) Grubbs I Katalysator (2 Portionen in je 4 ml DCM) zum Rückfluss erhitzt. Nach Entfernen aller Lösungsmittelrückstände im Hochvakuum wurde ein schwarzes Harz erhalten, welches gemäß AAV 7 mit 350 μl HF/Pyridin versetzt wurde. Nach Filtration wurde das Rohprodukt eingeengt und auf Celite aufgezogen. Es wurde blitzchromatographisch gereinigt (KG, 15 g, 13 x 2.5 cm, PE/EE 4 : 1 (v/v) + 0.1 % MeOH auf EE + 0.1 % MeOH), wobei 52.5 mg eines grünen, viskosen Öls erhalten wurden, welches mittels präparativer HPLC aufgetrennt wurde (C18-Säule, linearer Gradient H2O/MeCN 90 : 10 135 Experimenteller Teil + 0.1 % TFA auf H2O/MeCN 0 : 100 + 0.1 % TFA in 10 min, tR = 7.6 min). Auf diese Weise wurden 8.2 mg (0.03 mmol, 7 %) eines grünlichen Öles erhalten. Rf = 0.31 in PE/EE 1 : 1 (v/v) + 0.1 % MeOH [α] : -110 ° (c 0.50, CHCl20D 3), HO 89 2 5 O O 1' 1H NMR, (400.45 MHz, CDCl3): δ = 6.89-6.85 (m, 1H, 4-H), 6.01 (ddd, 1H, 3J = 9.6, 2.1, 1.5 Hz, 3-H), 4.45-4.38 (m, 1H, 6-H), 3.64 (t, 2H, 3J = 6.6 Hz, 9’- H), 2.34-2.30 (m, 2H, 5-H), 1.84-1.75 (m, 1H, 1’-Ha), 1.68-1.49 (m, 5H), 1.43- 1.30 (m, 10H). 13C NMR, DEPT (100.70 MHz, CDCl3): δ = 164.5 (s, C-2), 144.9 (d, C-4), 121.4 (d, C-3), 77.9 (d, C-6), 63.0 (t, C-9’), 34.8 (t, C-5), 32.7 (t, C-1’), 29.4 (2 x t), 29.3 (2 x t), 29.2 (t), 25.6 (t), 24.7 (t). LC-MS (C18grav_split4pos): tR = 10.43 min, m/z = 241.10 [M+H]+. MS (FAB) m/z 241.2 [M+H]+ HR-MS (FAB) ber. für C16H29O3 241.1804 [M+H]+, gef. 241.1789. (R)-6-(3-Hydroxypropyl)-5,6-dihydro-2H-pyran-2-on (93) Gemäß AAV 6 wurden 589 mg (0.5 mmol/g, 0.29 mmol) des immobilisierten Esters 85 in 5 ml DCM mit dem Hoveyda-Grubbs II Katalysator 95 in zwei Portionen von 36.3 mg (0.06 mmol) in 2 ml DCM und 36.8 mg (0.06 mmol) in 2 ml DCM umgesetzt. Nach Entfernung aller Lösungsmittelrückstände im Hochvakuum wurde ein braunes Harz erhalten. Das Harz wurde nach AAV 7 in 5 ml THF gequollen und mit 300 μl Pyridin und 300 μl HF/Pyridin umgesetzt. Es wurde mit 300 μl TMSOMe gequencht. Nach Filtration durch Florisil wurde blitzchromatographisch gereinigt (KG, 136 Experimenteller Teil 5.6 g, DCM/MeOH 98 : 2 auf 95 : 5). Dabei wurden 12.5 mg eines grünen Öls erhalten, das mittels präparativer HPLC aufgereinigt wurde (C18-Säule, lin. Gradient 10 % MeCN in H2O + 0.1 vol% TFA auf 100 % MeCN + 0.1 vol% TFA in 10 min, tR = 3.6 min). Auf diese Weise wurden 11.7 mg (12 %) eines farblosen Öls erhalten. Rf = 0.18 in CH2Cl2/MeOH 95:5 Reinheit >95 % (1H NMR) [α] : -102 ° (c 0.2, CHCl20D 3); Enantiomerenüberschuss 89% (bestimmt mittels GC). O HO O 93 3 4 1' 1H NMR (400.45 MHz, CDCl3): δ = 6.91-6.86 (m, 1H, 4-H), 6.03 (ddd, 1H, 3J = 9.7 Hz, 4J = 2.1 Hz, 1.5 Hz, 3-H), 4.51-4.44 (m, 1H, 6-H), 3.72-3.69 (m, 2H, 3’-H), 2.38-2.34 (m, 2H, 5-H), 1.91-1.66 (m, 4H, 2’-H, 3’-H). 13C NMR, DEPT (100.71 MHz, CDCl3): δ = 164.4 (s, C-2), 145.0 (d, C-4), 121.4 (d, C-3), 77.8 (d, C-6), 62.8 (t, C-3’), 31.2, 29.5, 28.0 (3 x t, C-5, C-1’, C- 3’). GC (Lipodex E, 100 °C (1 min), dann 30 °C/min auf 179 °C (1 min), dann 1 °C/min auf 182 °C, dann 0.3 °C auf 185 °C, dann 10 °C/min auf 200 °C (3 min).): tR (R -93): 12.63 min. tR (S -93): 12.37 min. MS (FAB) m/z 157.1 [M+H]+ HR-MS (FAB) ber. für C8H13O3 157.0865 [M+H]+, gef. 157.0880. 137 Experimenteller Teil (S)-6-(3-Hydroxypropyl)-5,6-dihydro-2H-pyran-2-on (ent-93) Gemäß AAV 6 wurden 1.06 g (0.5 mmol) des immobilisierten Esters ent-85 in 10 ml DCM mit 113 mg (0.4 mmol) Ti(OiPr)4 versetzt. Es wurden 2 Portionen des Grubbs I-Katalysators 84 zugegeben: 84.0 mg (0.102 mmol) in 2 ml DCM und 84.3 mg (0.102 mmol) in 2 ml DCM. Nach Entfernen aller Lösungsmittelrückstände im Hochvakuum wurde ein braunes Harz erhalten, welches in 7 ml THF gequollen wurde und gemäß AAV 7 mit 400 μl Pyridin und 400 μl HF/Pyridin umgesetzt wurde. Es wurde mit 3 ml TMSOMe gequencht. Das Rohprodukt, ein braunes Öl (200 mg), wurde blitzchromatographisch aufgereinigt (KG, 11.2 g, 8 x 2 cm, DCM/MeOH 98 : 2 auf 95 : 5). Nach weiterer Aufreinigung mit präparativer HPLC (C18- Säule, linearer Gradient 10 % MeCN in H2O + 0.1 vol% TFA auf 100 % MeCN + 0.1 vol% TFA in 10 min, tR = 3.6 min) wurden 3.8 mg (0.024mmol, 5 %) eines farblosen Öls erhalten, dessen NMR-spektroskopische Daten mit denen von 93 identisch waren. O HO O ent-93 3 4 1' [α] : +47° (c 0.2, CHCl20D 3); Enantiomerenüberschuss 38% (bestimmt mittels GC). MS (FAB) m/z 157.1 [M+H]+ HR-MS (FAB) ber. für C8H13O3 157.0865 [M+H]+, gef. 157.0893. Immobilisiertes (R)-4-(tert.-Butyldimethylsilyl)-6-hepten-1,4-diol (96) Nach AAV 4 wurden 1.61 g (0.8 mmol) des Homoallylalkohols 85 in 10 ml DMF mit 855 mg (5.7 mmol) tert.-Butyldimethylsilylchlorid; 393 mg (5.8 mmol) Imidazol und 12 mg (0.1 mmol) DMAP umgesetzt. Nachdem am Hochvakuum alle Lösungsmittelreste entfernt worden waren, lag ein leicht gelbliches Harz vor. 138 Experimenteller Teil O OTBS 96 1 FT-IR ν~ [cm-1] = 3453 (w), 2962 (s), 1941 (w), 1804 (w), 1721 (m), 1600 (m), 1467 (w). Immobilisiertes (R)-3-(tert.-Butyldimethylsilyl)-6-hydroxy-hexanal (97) Nach AAV 2 wurden 1.15 g (ca. 0.58 mmol) des Harzes 96 ozonolysiert und mit 808.7 mg (3.10 mmol) Triphenylphosphin reduziert. Nach Entfernen aller Lösungsmittelrückstände im Hochvakuum wurde ein hellgelbes Harz erhalten. FT-IR ν~ [cm-1] = 3437 (m), 3050-2800 (s), 2722 (m), 1941 (w), 1871 (w), 1804 (m), 1730 (s), 1599 (m), 1466 (w). Immobilisiertes (4R,6S)-4-(tert.-Butyldimethylsilyloxy)-1,6-dihydroxy-8- nonen (98) Nach AAV 3 wurden 1.250 g (0.275 mmol) des immobilisierten Aldehyds 97 in 12 ml THF mit 1.6 ml (1.6 mmol) einer 1M Lösung von d-Ipc2BAll in Diethylether umgesetzt. Nach Entfernen aller Lösungsmittelrückstände im Hochvakuum wurde ein hellgelbes Harz erhalten. (4R,6S)-8-Nonen-1,4,6-triol (99) Gemäß AAV 7 wurden 319 mg (0.095 mmol) Harz in 3 ml THF mit 150 μl Pyridin und 150 μl HF/Pyridin umgesetzt. Nach Filtration wurde eingeengt, und es wurden 66.7 mg eines Rohproduktes erhalten, das blitzchromatographisch aufgereinigt wurde (KG, 4.7 g, 13.5 x 1.5 cm, DCM/MeOH 95 : 5 (v/v) auf DCM/MeOH 85 : 15). Es konnten 15.1 mg (0.086 mmol, 91 %) eines farblosen Öls isoliert werden. Rf = 0.17 in PE/EE 1 : 1 (v/v) + 0.1 % MeOH 139 Experimenteller Teil Diastereomerenverhältnis syn:anti 85 : 15 (bestimmt durch GC-MS des persilylierten Rohprodukts HO OH 99 1 OH 1H NMR, (400.45 MHz, CDCl3): δ = 5.85-5.75 (m, 1H, 8-H), 5.14-5.09 (m, 2H, 9-H), 3.94-3.87 (m, 1H, 6-H), 3.71-3.61 (m, 3H, 4-H, 1-H), 2.27-2.20 (m, 2H, 7-H), 1.79-1.49 (m, 6H). 13C NMR, DEPT (100.70 MHz, CDCl3): δ = 134.2 (s, C-8), 118.2 (d, C-9), 72.5 (d, C-6 oder C-4), 71.9 (d, C-6 oder C-4), 62.8 (t, C-1), 42.5 (t, C-5 oder C-7), 42.3 (t, C-5 oder C-7), 35.8 (t, C-3), 28.9 (t, C-2). GC-MS (DB_100_S) tR = 4.03 min, m/z (rel. Int.) 175(1), 133(1), 115(27), 97(18), 89(21), 71(100). GC-MS des TMS-Derivates (DB_100_S): tR (syn-99) = 4.36 min. tR (anti-99) = 4.41 min. MS (FAB) m/z 175.2 [M+H]+ HR-MS (FAB) ber. für C8H13O3 175.1334 [M+H]+, gef. 175.1330 Immobilisiertes (4S,6R)-6-(tert.-Butyldimethylsilyloxy)-9-hydroxy-1- nonen-4-yl acrylat (100) Gemäß AAV 5 wurden 709 mg (0.28 mmol) des Harzes 98 in 6 ml DCM mit 333 mg (3.68 mmol) Acryloylchlorid, 218 mg (2.15 mmol) Triethylamin und 9.5 mg (0.08 mmol) DMAP umgesetzt. Nach Entfernen aller Lösungsmittelrückstände im Hochvakuum lag ein hellgelbes Harz vor. FT-IR ν~ [cm-1] = 3500 (br m), 3100-2850 (br s), 1944 (w), 1875 (w), 1743 (s), 1601 (m), 1462 (m). 140 Experimenteller Teil (S)-5,6-Dihydro-6-((R)-2,5-dihydroxypentyl)pyran-2-on (101) Gemäß AAV 6 wurden 580 mg (0.174 mmol) des immobilisierten Acrylesters 98 in 6 ml DCM gequollen und mit zwei Portionen des Katalysators 95 versetzt: 23.3 mg (0.037 mmol) in1.5 ml DCM und 24.0 mg (0.038 mmol) in 1.5 ml DCM. Nach Entfernen aller Lösungsmittelrückstände wurde ein braunes Harz erhalten, das Im Hochvakuum getrocknet wurde. Zur Abspaltung wurde nach AAV 7 in 4 ml THF aufgenommen und mit 300 μl Pyridin und 300 μl HF/Pyridin umgesetzt. Nach 18 h bei 40 °C wurde mit 1.5 ml TMSOMe gequencht. Die Lösung des Rohproduktes wurde eingeengt, so dass ein grün-braunes Öl (60 mg) erhalten wurde. Das Rohprodukt wurde in MeCN aufgenommen und mittels präparativer HPLC gereinigt (C18-Säule, 1 min 10 % MeCN in H2O + 0.1 % TFA, dann linearer Gradient auf 100 % MeCN + 0.1 % TFA in 11 min, 3 min halten). Auf diese Weise wurden 18.6 mg (0.033 mmol, 19 %) eines farblosen Öls erhalten. Rf = 0.2 in CH2Cl2/Aceton 1:1 [α] : -10.8° (c 0.65, CHCl20D 3) Diasteromerenverhältnis 81:19 (bestimmt durch 1H NMR) O O 101 3 4 1' HO OH 1H NMR (400.45 MHz, CDCl3): δ = 6.93 (ddd, 1H, 3J = 9.7, 4.7, 3.7 Hz, 4-H), 6.02 (ddd, 1H, 3J = 9.8 Hz, 4J = 1.5, 3.4 Hz, 3-H), 4.80-4.72, 4.71-4.64 (2 x m, 1H), 4.08-4.02, 3.96-3.90 (2 x m, 1H), 3.76-3.62 (m, 2H), 2.44-2.40, 2.39-2.35 (2 x m, 2H), 2.07-1.50 (m, 6H). 13C NMR (100.71 MHz, CDCl3): δ = 164.1 (s, C-2), 145.3 (d, C-4), 121.2 (d, C-3), 76.9 (d, C-6), 68.8 (d, C-2’), 62.8 (d, C-5’), 42.0, 34.8, 29.5, 28.8 (4 x t, C-5, C-1’, C-3’, C-4’). 141 Experimenteller Teil LC-MS (C18grav_split4pos): tR = 4.10 min, 4.39 min, m/z 201.0 [M+H]+. MS (FAB) m/z 201.1 [M+H]+ HR-MS (FAB) ber. für C8H13O3 201.1127 [M+H]+, gef. 201.1173. Immobilisiertes (R)-1-Hydroxy-6-hepten-4-yl acetat (102) In einem Schlenk-Kolben wurden 1.07 g (0.5 mmol) 85 in 10 ml DCM gequollen und bei 0 °C mit 31 mg (0.25 mmol) DMAP, 202.4 mg (2 mmol) Triethylamin und 550 mg (5.3 mmol) Essigsäureanhydrid versetzt. Es wurde über 16 h geschüttelt, wobei die Reaktionsmischung Raumtemperatur annahm. Das Harz wurde abfiltriert und gewaschen: 3 x 10 ml DCM, 2 x 10 ml DMF, 2 x 10 ml DMF/H2O 1 : 1, 2 x 10 ml DMF, 3 x 10 ml DCM, 2 x 10 ml MeOH. Nach Trocknen im Hochvakuum wurde ein gelbliches Harz erhalten. FT-IR ν~ [cm-1] = 3458 (w), 3050-2800 (s), 1943 (w), 1872 (w), 1804 (w), 1746 (s), 1601 (m), 1494 (w). Immobilisiertes (R)-6-Hydroxy-hexanal-3-yl acetat (103) Nach AAV 2 wurden 980 mg (0.45 mmol) des Harzes 102 in 20 ml DCM mit Ozon umgesetzt und mit 607 mg (2.32 mmol) Triphenylphosphin reduziert. Nach Entfernen aller Lösungsmittelrückstände im Hochvakuum wurde ein farbloses Harz erhalten. FT-IR ν~ [cm-1] = 3444 (w), 3050-2800 (s), 2729 (m), 1943 (w), 1872 (w), 1804 (w), 1750 (s), 1600 (m), 1495 (w). Immobilisiertes (4R,6S)-1, 6-Dihydroxy-8-nonen-4-yl acetat (104) Gemäß AAV 3 wurden 892 mg (0.44 mmol) des Harzes 103 in 9 ml THF mit 2 ml einer 1M Lösung von d-Ipc2BAll umgesetzt. Nach oxidativer Aufarbeitung und Entfernen aller Lösungsmittelrückstände im Hochvakuum lag ein leicht gelbliches Harz vor. 142 Experimenteller Teil FT-IR ν~ [cm-1] = 3475 (w), 3050-2800 (s), 1942 (w), 1871 (w), 1804 (w), 1740 (s), 1642 (w), 1599 (m), 1464 (w). Testabspaltung Gemäß AAV 7 wurden 53 mg des Harzes 104 in 1 ml THF mit 100 μl Pyridin und 100 μl HF/Pyridin umgesetzt und mit 200 μl TMSOMe gequencht. Nach Filtration des Rohproduktes wurde eingeengt. LC-MS (C18grav_split4pos): tR = 7.00 min, m/z = 216.83 [M+H]+. Immobilisiertes (4S,6R)-6-Acetoxy-9-hydroxy-1-nonen-4-yl acrylat (105) Gemäß AAV 5 wurden 757 mg (0.35 mmol) des immobilisierten Homoallylalkohols 104 in 7 ml DCM mit 342 mg (3.78 mmol) Acryloylchlorid, 218 mg (2.15 mmol) Triethylamin und 15 mg (0.12 mmol) DMAP umgesetzt. Das gelbliche Harz, das auf diese Weise erhalten wurde, ließ sich auch durch längeres Trocknen am Hochvakuum und azeotrope Destillation mit Toloul nicht von allen Lösungsmittelrückständen trennen, so dass es stets in feucht- klumpiger Form vorlag. FT-IR ν~ [cm-1] = 3475 (br s), 3050-2800 (s), 1942 (w), 1868 (w), 1749 (br s), 1642 (w), 1599 (w), 1492 (w). (R)-5-Hydroxy-1-((S)-6-oxo-3,6-dihydro-2H-pyran-2-yl)pentan-2-yl acetat (106) Nach AAV 6 wurde das Harz 105 (0.2 mmol) in 7 ml DCM mit 27.4 mg und 24.5 mg (0.08 mmol) des Hoveyda-Katalysators 95 in 1 ml und 3 ml DCM umgesetzt. Nach Entfernen aller Lösungsmittelrückstände im Hochvakuum lagen 739 mg eines grünlich-braunen Harzes vor. Zur Abspaltung in 7 ml THF wurden 300 μl HF/Pyridin und 300 μl Pyridin zugegeben. Nach 8.5 h bei 40 °C wurde mit 1 ml TMSOMe gequencht, durch Kieselgel filtriert und eingeengt. 143 Experimenteller Teil Es wurden 91 mg eines viskosen braunen Öls erhalten, welches mittels präparativer HPLC aufgereinigt wurde (C18-Säule, 25 ml/min, 1 min 10 % MeCN + 0.1 % TFA in H2O + 0.1 % TFA, linearer Gradient in 11 min auf 100 % MeCN + 0.1 % TFA, tR = 5.20-5.68). Auf diese Weise wurden 3.6 mg (0.015 mmol, ca. 7 %) eines grünlichen Öls erhalten werden, in welchem das Produkt mit ca. 80 % Reinheit (bestimmt durch 1H NMR) vorlag. Rf = 0.48 in DCM/Aceton 1 : 1 (v/v). HO O O O O 106 1 2 2' 1'' 3' 1H NMR, gCOSY, gHSQC, gHMBC (400.45 MHz, CDCl3): δ = 6.87 (ddd, 1H, 3J = 9.8, 6.1, 2.4 Hz, 4’-H), 6.02 (ddd, 1H, 3J = 9.8, 2.6, 0.9 Hz, 5’-H), 5.13- 5.07 (m, 1H, 2’-H), 4.54-4.47 (m, 1H, 2-H), 3.66 (t, 2H, 3J = 6.2 Hz, 5-H), 2.51- 2.41 (m. 1H, 1-Ha), 2.35-2.26 (m, 1H, 1-Hb), 2.22-2.14 (m, 1H, 3’-Ha), 2.07 (s, 3H, 2’’-H), 1.92-1.85 (m, 1H, 3’-Hb), 1.76-1.69 (m, 2H, 4-H), 1.63-1.55 (m, 1H, 3-H). 13C NMR (100.70 MHz, CDCl3): δ = 170.8 (s, C1’’), 144.8 (d, C-4’), 121.4 (d, C-5’), 75.1 (d, C-5’), 70.3 (d, C-2), 62.3 (t, C-5), 39.4 (t, C-3’), 30.8 (t, C-4), 29.3 (t, C-1), 28.2 (t, C-3), 21.2 (q, C-2’’). LC-MS (C18grav_split4pos): tR = 7.17 min, m/z 243.0 [M+H]+. MS (FAB) m/z 243.1 [M+H]+ HR-MS (FAB) ber. für C12H19O5 243.1232 [M+H]+, gef. 243.1203. 144 Experimenteller Teil Immobilisierten (4R,6S)-4,6-Bis(tert-butyldimethylsilyloxy)non-8-en-1-ol (106) Nach AAV 4 wurden 1.36 g (0.68 mmol) des immobilisierten Homoallylalkohols 98 in 6 ml DMF mit 587 mg (3.91 mmol) TBS-Chlorid, 272 mg (3.99 mmol) Imidazol und 75 mg (0.61 mmol) DAMP umgesetzt. Nach Entfernen aller Lösungsmittelrückstände im Hochvakuum wurde ein gelbliches Harz erhalten. FT-IR ν~ [cm-1] = 3488 (br w), 3050-2800 (s), 1939 (w), 1802 (m), 1720 (m), 1641 (w), 1601 (m), 1495 (w). Immobilisiertes (3R,5R)-3,5-Bis(tert-butyldimethylsilyloxy)-8-hydroxy- octanal (107) Nach AAV 2 wurden 1.39 g (0.5 mmol) des Bis-TBS-Ethers 106 in 15 ml DCM bei -78 °C mit Ozon umgesetzt und anschließend mit 937 mg (3.57 mmol) Triphenylphosphin reduziert. Nach Entfernen aller Lösungsmittelrückstände im Hochvakuum wurde ein hellgelbes Harz erhalten. FT-IR ν~ [cm-1] = 3483 (br s), 3050-2800 (s), 2741 (m), 1941 (w), 1871 (w), 1803 (m), 1730 (s), 1642 (w), 1600 (m), 1454 (w). Immobilisiertes (4R,6S,8R)-6,8-Bis-(tert-butyldimethylsilyloxy)-11- hydroxyundec-1-en-4-yl acrylat (109) Gemäß AAV 3 wurden 1.25 mg (0.63 mmol) in 12 ml THF mit 4 ml einer 1M Lösung von l-Ipc2BAll in THF umgesetzt. Nach oxidativer Aufarbeitung und Entfernen aller Lösungsmittelrückstände im Hochvakuum wurde ein leicht gelbes Harz erhalten. FT-IR ν~ [cm-1] = 3485 (br m), 3050-2800 (s), 1941 (w), 1871 (w), 1804 (m), 1678 (s), 1600 (m), 1493 (w). 145 Experimenteller Teil Nach AAV 5 wurden 1.045 g (0.5 mmol) des immobilisierten Homoallylalkohols in 8 ml DCM mit 319 mg (3.5 mmol) Acryloylchlorid, 290 mg (2.9 mmol) NEt3 und 88 mg (0.72 mmol) DMAP umgesetzt. Nach entfernen aller Lösungsmittelrückstände im Hochvakuum wurde ein gelb- orangenes Harz erhalten. FT-IR ν~ [cm-1] = 3600-3050 (br s), 3050-2800 (s), 1941 (w), 1731 (br s), 1600 (m), 1492 (w). (R)-6-((2R,4R)-2,4,7-Trihydroxyheptyl)-5,6-dihydro-2H-pyran-2-on (111) Gemäß AAV 6 wurden 822 mg (0.25 mmol) des immobilisierten Acrylsäureesters 109 in 7 ml DCM mit zwei Portionen des Hoveyda-Grubbs II- Katalysators 95 umgesetzt: 30.6 mg (0.05 mmol) in 1 ml DCM und 21.3 mg (0.03 mmol) in 2 ml DCM. Nach Aufarbeitung wurde ein braunes Harz erhalten. Zur Abspaltung wurden750 mg des Harzes nach AAV 7 in 7 ml THF mit 400 μl Pyridin und 600 μl HF/Pyridin umgesetzt. Es wurde mit 2.5 ml TMSOMe gequencht, durch Kieselgel filtriert und eingeengt. Das Rohprodukt (160 mg) wurde in MeCN/H2O 1 : 1 aufgenommen und mittels präparativer HPLC gereinigt. (C18-Säule, Gradient wie für 101). Auf diese Weise wurden 16.3 mg (0.066 mmol, 26 %) eines transparenten farblosen Öls erhalten, in welchem die Verbindung 111 zu ca. 70 % neben nicht charakterisierten Diastereomeren vorlag. Rf = 0.10 in CH2Cl2/Aceton 1:1 [α] : + 62.5 ° (c 0.16, CHCl20D 3) 146 Experimenteller Teil O HO O OHOH 111 1H NMR, HSQC, HMBC (500.13 MHz, CDCl3): δ = 6.90 (ddd, 1H, 3J = 9.6, 5.6, 2.8 Hz, 4-H), 6.02 (br d, 1H, 3J = 9.9 Hz, 3-H), 4.77-4.72 (m, 1H, 6-H), 4.27-4.21 (m, 1H, 4’-H), 3.96-3.90 (m, 1H, 2’-H), 3.74-3.62 (m, 2H, 7’-H) 2.44- 2.32 (m, 2H, 5-H), 2.05-1.51 (m, 8H, 6’-H, 5’-H, 3’-H, 1’-H). 13C NMR (100.71 MHz, CDCl3): δ = 168.5 (s, C-2), 145.5 (d, C-4), 121.3 (d, C-3), 74.8 (d, C-6), 72.6 (d, C-4’), 68.0 (d, C-2’), 62.9 (d, C-7’), 43.3 (t, C-3’), 43.0 (t, C-1’), 35.7 (t, C-6’), 29.9 (t, C-5), 28.7 (t, C-5’). LC-MS (C18grav_split4pos): tR = 2.0 min, m/z 245.0 [M+H]+. MS (FAB) m/z 245.2 [M+H]+ HR-MS (FAB) ber. für C12H21O5 245.1389 [M+H]+, gef.245.1414. Immobilisiertes (4R,6R,8S)-6,8-Bis(tert-butyldimethylsilyloxy)-11- hydroxyundec-1-en-4-yl acrylat (108) Nach AAV 3 wurden 704 mg (0.21 mmol) des immobilisierten Bis-TBS- Ethers ent-107 in 7 ml THF mit 1.5 ml einer 1M Lösung von l-Ipc2BAll umgesetzt. Nach Entfernung aller Lösungsmittelrückstände im Hochvakuum wurde ein gelbliches Harz erhalten. FT-IR ν~ [cm-1] = 3600-3050 (br s), 3050-2800 (s), 1940 (m), 1914 (w), 1869 (w), 1803 (m),1713 (s), 1600 (m), 1468 (w). Nach AAV 5 wurden 652 mg (0.2 mmol) des immobilisierten Homoallylalkohols in 10 ml DCM mit 114 mg (1.3 mmol) Acryloylchlorid, 109 mg (1.1 mmol) NEt3 und15.5 mg (0.12 mmol) DMAP umgesetzt. Nach 147 Experimenteller Teil Entfernen aller Lösungsmittelrückstände im Hochvakuum wurde ein gelbliches Harz erhalten. FT-IR ν~ [cm-1] = 3600-3050 (br m), 3050-2800 (s), 1940 (m), 1868 (w), 1732 (br s), 1600 (m), 1471 (w). (R)-6-((2S,4S)-2,4,7-Trihydroxyheptyl)-5,6-dihydro-2H-pyran-2-on (110) Nach AAV 6 wurden 661 mg (0.198 mmol) des immobilisierten Acrylsäureesters 108 in 7 ml DCM gequollen und mit dem Hoveyda-Grubbs II Katalysator 95 umgesetzt, der als Lösung von 27.0 mg (0.04 mmol) in 1 ml DCM und 20.9 mg (0.03 mmol) in DCM vorlag. Es wurde ein braunes Harz (601 mg) erhalten, das nach AAV 7 in 6 ml THF mit 300 μl Pyridin und 300 μl HF/Pyridin umgesetzt wurde. Nach Quenchen mit 2 ml TMSOMe und Filtration durch Kieselgel wurde ein grünliches Öl (60 mg) erhalten, welches mittels präparativer HPLC aufgereinigt wurde (C-18 Säule, Gradient wie für 101, tR = 6.00 min). Es wurden 1.3 mg (0.005 mmol, 3 %) eines farblosen Öls erhalten, in welchem 110 zu 90 % .neben anderen Diastereomeren vorlag. Rf = 0.16 in CH2Cl2/Aceton 1:1 [α] : + 62.5 ° (c 0.16, CHCl20D 3) O HO O OHOH 110 1H NMR, HSQC, HMBC (500.13 MHz, CDCl3): δ = 6.92-6.88 (m, 1H, 4-H), 6.03 (ddd, 1H, 3J = 9.8 Hz, 4J = 1.8, 1.7 Hz, 3-H), 4.72-4.66 (m, 1H, 6-H), 4.19-4.14 (m, 1H, 2’-H), 3.97-3.92 (m, 1H, 4’-H), 3.76-3.64 (m, 2H, 7’-H) 2.45- 2.41 (m, 2H, 5-H), 2.07-2.01 (m, 1H, 1 x 5’-H), 1.81-1.53 (m, 7H, 1’-H, 3’-H, 1 x 5’-H, 6’-H). 13C NMR (100.71 MHz, CDCl3): δ = 163.8 (s, C-2), 145.5 (d, C-4), 121.2 (d, C-3), 76.2 (d, C-6), 72.7 (d, C-4’), 69.9 (d, C-2’), 62.8 (d, C-7’), 42.8 (t, C-1’ oder C-3’), 42.1 (t, C-5’), 35.4 (t, C-1’ oder C-3’), 29.4 (t, C-5), 28.7 (t, C-6’). 148 Experimenteller Teil LC-MS (C18grav_split4pos): tR = 3.01 min, m/z 245.03 [M+H]+. MS (FAB) m/z 245.2 [M+H]+ HR-MS (FAB) ber. für C12H21O5 245.1389 [M+H]+, gef.245.1401. Immobilisierter Ethyl-(3R)-Hydroxypropionsäureester (127) In einem Schlenk-Kolben wurden 6.13 g Wang-Harz (1.2 mmol/g, 7.36 mmol) in 80 ml DCM gequollen und auf 0 °C abgekühlt. Es wurden 6 ml Trichloracetonitril zugegeben, anschließend wurden 572 mg (3.76 mmol) DBU langsam zugetropft. Es wurde 45 min bei 0 °C geschüttelt, dann wurde filtriert und gewaschen: DCM, THF/DMSO 2 : 1, 2 x 100 ml THF, 2 x 50 ml DCM. Es wurde im Hochvakuum getrocknet. Das Harz wurde in je 60 ml Cyclohexan und DCM gequollen. Dann wurde mit 3.17 g (26.8 mmol) Ethyl-(3R)- hydroxypropionat versetzt und 0.36 ml BF3-Etherat zugegeben. Nach 20 min Schütteln bei Raumtemperatur wurde filtriert und gewaschen: DCM, THF, Et2O, DCM, MeOH. Es wurde am Hochvakuum getrocknet. FT-IR ν~ [cm-1] = 3050-2800 (s), 1945 (s), 1876 (s), 1803 (m), 1747 (s), 1607 (m), 1501 (w). Immobilisiertes (R)-3-Hydroxybutyral (117) In einem Schlenk-Kolben wurden 3.02 g des immobilisierten Esters 127 in 32 ml THF gequollen und auf -78 °C abgekühlt. Dann wurden 15 ml einer 1 M Lösung von DIBAL-H in Toluol zugegeben. Es wurde 16 h lang geschüttelt, wobei die Reaktionslösung langsam Raumtemperatur annahm. Es wurde filtriert und gewaschen: THF, THF/MeOH 1 : 1, THF/MeOH 1 : 1 + 5 % HOAc, THF/MeOH 1 : 1, THF, DCM, MeOH. Es wurde im Hochvakuum getrocknet. Nach Entfernen aller Lösungsmittelrückstände wurde ein hellgelbes Harz erhalten. 149 Experimenteller Teil FT-IR ν~ [cm-1] = 3457 (br s), 3059-2814 (s), 1948 (s), 1877 (s), 1807 (m), 1746 (w), 1600 (m). In einem Schlenk-Kolben wurden 5.3 g (ca. 5 mmol) in 60 ml THF gequollen. Parallel dazu wurden 4.90 g (17.5 mmol) IBX bei 40 °C in 70 ml DMSO gelöst. Die IBX-Lösung wurde zum Harz gegeben, und es wurde bei Raumtemperatur geschüttelt. Nach 28 h wurde filtriert und gewaschen: 100 ml DMSO/THF 1 : 1, 100 ml THF/DMSO 3 : 1, 200 ml THF, 170 ml DCM, 80 ml MeOH. Es wurde im Hochvakuum getrocknet. Dieser Vorgang wurde zweimal durchgeführt. FT-IR ν~ [cm-1] = 3443 (br s), 3050-2800 (s), 2726 (m), 1946 (m), 1875 (m), 1804 (w), 1726 (s), 1606 (m), 1500 (w). (2R,4S,6S)-4,6-Bis(tert-butyldimethylsilyloxy)-8-nonen-2-ol (130) Gemäß AAV 8 wurden 201 mg (0.08 mmol) des Harzes 129 in 10 ml DCM und 0.5 ml Phosphat-Puffer pH 7 mit 159 mg DDQ umgesetzt. Es wurden 12.7 mg eines farblosen Öls erhalten, welches säulenchromatographisch aufgereinigt wurde (KG, 0.8 g, PE/EE 97 : 3 (v/v)). Es wurden 10.1 mg (0.025 mmol, 31 %) eines farblosen Öls isoliert. Rf = 0.33 in PE/EE ) 9 : 1 (v/v) + 0.1 % MeOH. [α] : -3.9 ° (c 1.00, CHCl20D 3) Diastereomerenverhältnis: 73 : 27 (1H NMR) OOH O SiSi 130 1 1' 2'' 1H NMR, gHSQC (500.13 MHz, CDCl3): δ = 5.85-5.74 (m, 1H, 8-H), 5.08-5.04 (m, 2H, 9-H), 4.19-4.13 (m, 1H), 4.03-4.02 (m, 1H), 3.76-3.71 (m, 1H), 2.28- 150 Experimenteller Teil 2.16 (m, 2H, 7-H), 1.81-1.65 (m, 3H), 1.56-1.52 (m, 1H), 1.64 (d, 3H, 3J = 6.2 Hz, 1-H), 0.89, 0.88 (2 x s, 18H, 2’’-H), 0.12, 0.08, 0.06, 0.04 (4 x s, 12H, 1’-H). 13C NMR (125.77 MHz, CDCl3): δ = 134.5 (d, C-8), 117.3 (t, C-9), 69.8 (d, C-4 oder C-6), 69.7 (d, C-4 oder C-7), 64.6 (d, C-2), 43.8 (t, C-3 oder C-5), 43.4 (t, C-3 oder C-5), 42.0 (t, C-7), 25.8 (q, C-2’’), 23.7 (q, C-1) 18.1, 17.9 (2 x s, C- 1’’), -4.1, -4.3, -4.4, -4.6 (4 x q, C-1’). MS (FAB) m/z 403.4 [M+H]+ HR-MS (FAB) ber. für C21H47O3Si2 403.4036 [M+H]+, gef. 403.3054. (R)-6-((2R,4S,6R)-2,4-Bis(tert-butyldimethylsilyloxy)-6-hydroxyheptyl)- 5,6-dihydro-2H-pyran-2-on (131) Gemäß AAV 6 wurden 450 mg (0.18 mmol) des aus 128 gewonnenen Acrylsäureesters in 7 ml DCM mit 2 x 22.5 mg (0.036 mmol) des Katalysators 95 in jeweils 1 ml DCM zur Reaktion gebracht. Nach Entfernen aller Lösungsmittelrückstände im Hochvakuum wurde ein braunes Harz erhalten. Zur Abspaltung wurde das Harz (351 mg) nach AAV 8 in 15 ml DCM und 0.5 ml pH 7-Puffer mit 221 mg (0.97 mmol) umgesetzt. Das Rohprodukt wurde säulenchromatographisch gereinigt (KG, 0.8 g, PE/EE 4 : 1 + 0.1 % MeOH auf PE/EE 2 : 1 (v/v) + 0.1 % MeOH). Auf diese Weise wurden 1.6 mg (0.0034 mmol, 2 %) eines farblosen Öls erhalten. Rf = 0.08 in Petrolether / Ethylacetat 4 : 1 + 0.1 % MeOH [α] : + 10.5 ° (c 0.19, CHCl20D 3) O O 3 4 1' OTBSOTBS 131 OH 1H NMR, gHSQC (500.13 MHz, CDCl3): δ = 6.87 (ddd, 1H, 3J = 9.5, 4.9, 3.6 Hz, 4-H), 6.02 (ddd, 1H, 3J = 9.9 Hz, 4J = 1.9, 1.9 Hz, 3-H) 4.64-4.55 (m, 1H, 151 Experimenteller Teil 6-H), 4.17-4.07 (m, 2H, 2’-H, 4’H), 4.01-3.93 (m, 1H, 6’-H), 2.37-2.32 (m, 2H, 5-H), 2.06 (ddd, 1H, 2J = 14.4, 3J = 8.3, 4.2 Hz), 1.90 (ddd, 1H, 2J = 13.6, 3J = 7.0, 5.3 Hz), 1.81-1.57 (m, 4H), 1.18 (d, 3H, 7’-H), 0.90 (s, 9H, SiCCH3), 0.88 (s, 9H, SiCCH3), 0.12 (s, 3H, SiCH3), 0.09 (s, 3H, SiCH3), 0.07 (s, 3H, SiCH3), 0.65 (s, 3H, SiCH3). 13C NMR (125.77 MHz, CDCl3): δ = 144.4 (d, C-4), 121.2 (d, C-3), 74.4 (d, C- 6), 68.8, 66.0, 64.5 (3 x d, C-2’’, C-4’’, C-6’’), 42.9, 42.8, 42.1 (3 x t, C-1’, C-3’, C-5’), 30.1 (t, C-5), 25.9 (q, SiCCH3), 24.1 (q, C-7’), -4.4 (q, SiCH3). LC-MS (C18grav_split4pos): tR = 11.55 min, m/z 473.1 [M+H]+. MS (FAB) m/z 473.5 [M+H]+ HR-MS (FAB) ber. für C24H49O5Si2 473.3119 [M+H]+, gef.473.3141. 5-Pentanal (138) In einem 1l-Dreihalskolben wurden unter Argon 29.9 g (138.7 mmol) Pyridiniumchlorochromat, 17 g Kieselgel und 21 g zerriebenes Molsieb 4Å miteinander vermengt. Es wurde mit 200 ml DCM versetzt und auf 0 °C abgekühlt. Eine Lösung von 15.6 g (95.0 mmol) 5-Phenylpentanol in 100 ml DCM wurde langsam mittels Tropftrichter zugegeben. Nach 5.5 h war der Umsatz vollständig es wurde mit 300 ml Diethylether versetzt, durch Celite filtriert und eingeengt. Das schlammige Rohprodukt wurde auf Celite aufgezogen und blitzchromatographisch gereinigt (KG, 250 g, 22 x 6 cm, PE/EE 95 : 5 (v/v) auf PE/EE 9 : 1 (v/v)). Es wurden 11.01 g (67.9 mmol, 71 %) eines leicht gelblichen Öls erhalten. H O 1 138 1H NMR (400.45 MHz, CDCl3): δ = 9.76 (t, 1H, 3J = 1.7 Hz, 1-H), 7.30-7.27 (m, 2H, Carom.-H), 7.21-7.17 (m, 3H, Carom.-H), 2.66-2.61 (m, 2H, 5-H), 2.47- 2.43 (m, 2H, 2-H), 1.70-1.65 (m, 4H). Die gemessenen Daten stimmen mit Literaturwerten überein.[141] 152 Experimenteller Teil GC-MS (DB_50_S): tR = 5.75 min; m/z(rel. Int.) 162(43) [M]+, 144(25), 129(40), 177(51), 105(39), 91(100), 77(21), 65(33). (4R)-8-Phenyl-1-octen-4-ol ((R)-137) Methode A[142] Für einen typischen analytischen Ansatz (0.4 mmol 138) wurde die in Tabelle 4 angegebene Menge (S)-BINOL in 1 ml DCM gelöst und mit Titantetraisopropoxylat versetzt. Nach 1 h rühren bei Raumtemperatur war eine tiefrote Lösung entstanden, zu der der Aldehyd 138 gegeben wurde. Nach Abkühlen auf die beabsichtigte Temperatur wurde das Allyltributylstannan langsam zugegeben, und es wurde über die angegebene Zeit gerührt. Dabei wurde die Farbe der Lösung langsam heller und schlug nach gelb-orange um. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 3 ml gesättigter NaHCO3-Lösung beendet, und es wurde auf Raumtemperatur gebracht. Die Phasen wurden getrennt, und die wässrige Phase wurde mit 3 x 2 ml DCM extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über MgSO4 getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt, ein zähes, gelb-rotes Öl, wurde auf Celite aufgezogen und blitzchromatographisch aufgereinigt (KG, 10 g, 21 x 1 cm, PE/EE 95 : 5 (v/v) + 0.1 % MeOH). Auf diese Weise wurde (R)-137 als farbloses bis gelbliches Öl gewonnen werden. Methode B[92] Aktiviertes, gemahlenes Molsieb 4Å (100-200 mg/ml Lösungsmittel) wurde in einem Schlenk-Kolben erneut im Hochvakuum ausgeheizt. Nach Abkühlen wurde in einer Argon-Atmosphäre (S)-BINOL vorgelegt und in Toluol suspendiert. Nach Zugabe von Titantetraisopropoxylat wurde 2 h bei Raumtemperatur gerührt und auf die beabsichtigte Temperatur abgekühlt. Dann wurden der Aldehyd 138 und das Allyltributylstannan zugegeben. Nach Ablauf der Reaktionszeit wurde zunächst vom Molsieb abfiltriert, bevor mit 3 ml gesättigter NaHCO3-Lösung gequencht wurde. Die weitere Aufarbeitung war analog zu Methode A. 153 Experimenteller Teil Methode C[93] Zur Synthese des Katalysators 139 wurden 4.2 ml einer 0.12M Lösung von TiCl4 (entspricht 94.5 mg, 0.50 mmol) in DCM mit weiteren 6 ml DCM verdünnt und auf 0 °C abgekühlt. Dann wurden 427 mg (1.50 mmol) Ti(OiPr)4 zugegeben, und es wurde 1 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach Zugabe von 235 mg (1.01 mmol) Silber(I)oxid wurde 4.5 h unter Lichtausschluss gerührt. Anschließend wurde mit 20 ml DCM verdünnt, woraufhin 580 mg (2.03 mmol) (S)-BINOL zugegeben wurden. Es wurde erneut 2 h bei Raumtemperatur gerührt, dann auf -15 °C abgekühlt und mit 1.70 g (10.48 mmol) Aldehyd 138 und 3.99 g (12.02 mmol) Allyltributylstannan versetzt. Nach 37 h bei -15 °C wurde mit 10 ml gesättigter NaHCO3-Lösung gequencht, und es wurde 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Phasen wurden getrennt, und die wässrige Phase wurde mit 3 x 30 ml DCM extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden zunächst von schlammigen Rückständen abfiltriert, dann über MgSO4 getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt wurde auf Celite aufgezogen und blitzchromatographisch gereinigt (KG, 210 g, 20 x 6 cm, PE/EE 9 : 1 (v/v) + 0.1 % MeOH). Auf diese Weise konnten 1.58 g (7.75 mmol, 74 %) eines gelben Öls gewonnen werden. Synthese von rac-137 Der Aldehyd 138 (82.0 mg, 0.51 mmol) wurde in 2 ml Diethylether bei 0 °C mit 0.7 ml (0.7 mmol) einer 1M Lösung von Allylmagnesiumbromid in Ether versetzt. Nach 6 h wurde mit 3 ml Ether verdünnt, mit H2O gequencht und der entstandene Niederschlag mit 2M HCl aufgelöst. Nach Phasentrennung Extraktion mit Ether wurde über MgSO4 getrocknet und auf Celite aufgezogen. Nach blitzchromatographischer Trennung wie oben beschrieben wurden 92.1 mg (0.45 mmol, 90 %) eines farblosen Öls erhalten. Rf = 0.34 in Petrolether/Ethylacetat 4 : 1 + 0.1% MeOH. [α] : + 6.6 ° (c 1.02, CHCl20D 3) (R)-137 Enantiomerenverhältnis 98 :2 (bestimmt über HPLC). 154 Experimenteller Teil OH 1 4 1' (S)-137 OH 1 4 1' (R)-137 1H NMR, (400.45 MHz, CDCl3): δ = 7.30-7.25 (m, 2H, Carom.-H), 7.19-7.15 (m, 3H, Carom.-H), 5.87-5.77 (m, 1H, 2-H), 5.16-5.10 (m, 2H, 1-H), 3.68-3.62 (m, 1H, 4-H), 6.23 (t, 2H, 3J = 7.7 Hz, 8-H), 2.30 (dddt, 1H, 2J = 13.9 Hz, 3J = 6.5, 4.2 Hz, 4J = 1.3 Hz, 3-Ha), 2.13 (dddt, 1H, 2J = 13.9 Hz, 3J = 7.9, 7.9 Hz, 4J = 1.02 Hz, 3-Hb), 1.70-1.61 (m, 2H, 5-H oder 6-H oder 7-H), 1.53-1.35 (m, 4H, 5-H, 6-H, 7-H). 13C NMR (100.70 MHz, CDCl3): δ = 142.6 (s, C-1’), 134.8 (d, C-2), 128.4 (d, Carom.), 128.3 (d, Carom.), 125.6 (d, Carom.), 118.1 (t, C-1), 70.5 (d, C-4), 42.0 (t, C-3), 36.6 (t, C-5 oder C-7), 35.9 (t, C-8), 31.5 (t, C-5 oder C-7), 25.3 (t, C-6). LC-MS (C18grav_split4pos): tR = 9.74 min, m/z 186.87 [M-H2O+H]+. HPLC (Chiracel® AD, Hexan/Isopropanol 97 : 3, 0.5 ml/min): tR ((R)-137) = 18.5 min; tR ((S)-137) = 19.6 min. MS (FAB) m/z 205.1 [M+H]+ HR-MS (FAB) ber. für C14H21O 205.1592 [M+H]+, gef.205.1603. 5-Hydroxy-9-phenyl-2-nonen ((S)-141 und (R)-141) Zur Synthese von (S)-141 wurden 1.852 g (11.42 mmol) des Aldehyds 138 in 11 ml DCM gelöst, im Eisbad auf 0 °C abgekühlt und nach Zugabe von 2.757 g (13.11 mmol) des Neomenthol-Reagenzes 140[95] und 217 mg (1.14 mmol) PPTS bei Raumtemperatur gerührt. Nach 20 h zeigte eine DC- Kontrolle vollständigen Umsatz an, und es wurden 450 mg (5.36 mmol) festes NaHCO3 zugegeben und 2 h gerührt. Es wurde vom Präzipitat abfiltriert und eingeengt und blitzchromatographisch aufgereinigt (KG, 200 g, 16 x 6 cm, von 155 Experimenteller Teil PE/EE 95 : 5 (v/v) + 0.1 % MeOH auf PE/EE 9 : 1 (v/v) + 0.1 % MeOH). Es wurden 1.748 g (8.01 mmol, 70 %) eines farblosen Öls erhalten. Analog dazu wurde (R)-141 aus Aldehyd 138 mit dem enantiomeren Auxiliar ent-140 in 66 % Ausbeute als farbloses Öl erhalten. OH 1 5 1' (S)-141 OH 1 5 1' (R)-141 Rf = 0.19 in Petrolether / Ethylacetat 9 : 1 + 0.1% MeOH. [α] : -1.0 ° (c 1.02, CHCl20D 3) (S)-141 [α] : + 1.1 ° (c 1.05, CHCl20D 3) (R)-141 Enantiomerenverhältnis > 99 : 1 (HPLC) 1H NMR, gHSQC gHMBC (400.45 MHz, CDCl3): δ = 7.30-7.25 (m, 2H, Carom.- H), 7.19-7.38 (m, 3H, Carom.-H), 5.56 (dtq, 1H, 2J = 15.2 Hz, 3J = 6.3 Hz, 4J = 1.2 Hz, 2-H), 5.43 (dddq, 1H, 2J = 15.2 Hz, 3J = 7.8, 6.3 Hz, 4J = 1.4 Hz, 3-H), 3.61-3.55 (m, 1H, 5-H), 2.62 (t, 2H, 3J = 7.7 Hz, 9-H), 2.22 (dddt, 1H, 2J = 13.9 Hz, 3J = 6.3, 4.0 Hz, 4J = 1.3 Hz, 4-Ha), 2.05 (dddt, 1H, 2J = 14.0 Hz, 3J = 7.8, 7.8 Hz, 4J = 0.9 Hz, 4-Hb), 1.70 (br d, 1H, 3J = 6.4 Hz, 1-H), 1.68-1.35 (m, 6H, 6-H, 7-H, 8-H). 13C NMR (125.77 MHz, CDCl3): δ = 142.62 (s, C-1’), 129.01 (d, C-2), 128.4 (d, Carom.), 128.2 (d, Carom.), 127.1 (d, C-3), 125.6 (d, Carom.), 70.8 (d, C-5), 40.7 (t, C-4), 36.6 (t, C-6 oder C-7 oder C-8), 35.9 (t, C-9), 31.5, 25.4 (2 x t, C- 6 oder C-7 oder C-8), 18.1 (q, C-1). GC-MS des TMS-Derivates (DB_100_S): tR = 4.78 min, m/z (rel. Intens.) 275(7) [M-15]+, 235(100), 157(12), 145(100), 117(40), 103(20), 91(70), 73(100). 156 Experimenteller Teil HPLC (Chiracel® AD, Hexan/Isopropanol 98 : 2, 0.5 ml/min): tR ((R)-141) = 21.1 min; tR ((S)-141) = 21.6 min. HR-MS (FAB) ber. für C15H23O 219.1749 [M+H]+, gef. 219.1739. Immobilisiertes (S)-9-Phenyl-5-hydroxy-2-nonen (142) In Analogie zu AAV 1 wurden 1.52 g (4.2 mmol) Brom-PS-Harz mit 1.26 g (8.0 mmol) Diethyldichlorsilan und 667 mg (3.05 mmol) des Homoallylakohols (S)-141 umgesetzt. In diesem Fall wurde für die Lithiierung des Harzes jedoch eine 10M Lösung von n-BuLi verwendet. Nach Entfernen aller Lösungsmittelrückstände im Hochvakuum wurde ein leicht gelbliches Harz erhalten. FT-IR ν~ [cm-1] = 3028-2875 (br s), 1942 (m), 1881 (w), 1804 (w), 1745 (w),1665 (s), 1599 (m). Die Beladung wurde über einen HPLC-Assay gemessen: Dazu wurden 104 mg des Harzes in 0.8 ml THF mit 50 μl Pyridin und 50 μl HF/Pyridin abgespalten. Nach einer Reaktionszeit von 6.5 h wurde mit 800 μl TMSOMe gequencht, die Lösung durch Kieselgel filtriert und eingeengt. Es wurden 17.5 mg (0.08 mmol, 28 %) eines farblosen Öls erhalten. Das Rohprodukt wurde in 3.00 ml Hexan aufgenommen und auf einer Chiracel AD-Säule (Hexan/Isopropanol 98 : 2, 0.5 ml/min) mit einer Kalibrierkurve (aufgenommen mit einer Verdünnungsreihe von (S)-141 mit den Konzentrationen 1.86, 0.93, 0.46, 0.23, 0.12 mg/ml) verglichen. Damit konnte die Beladung des Harzes zu 0.71 mmol/g (25.8 %, bezogen auf die theoretische Beladung des Harzes) bestimmt werden. 157 Experimenteller Teil Immobilisiertes (4R, 6S)-10-Phenyl-1-decen-4,6-diol (143) Gemäß AAV 3 wurden 1.4 g (0.84 mmol) des aus 142 gewonnenen Aldehyds in 15 ml THF mit 4 ml einer 1M Lösung von lIpc2Ball umgesetzt. Nach oxidativer Aufarbeitung lag ein gelbliches Harz vor. FT-IR ν~ [cm-1] = 3518 (s), 3100-2850 (s), 1946 (m), 1875 (s), 1807 (s), 1733 (m), 1688 (s), 1546 (w), 812 (w). (4R, 6S)-10-Phenyl-1-decen-4,6-diol (144) Gemäß AAV 7 wurden 270 mg (0.16 mmol) des Harzes 143 in 2.5 ml THF mit 200 μl Pyridin und 300 μl HF/Pyridin umgesetzt. Das Rohprodukt wurde blitzchromatographisch aufgereinigt (KG [Partikelgröße 0.015-0.04 mm], 3.1 g, 9 x 1 cm, PE/EE 4 : 1 (v/v) + 0.1 % MeOH]. Nach Einengen wurden 24.2 mg (0.10 mmol, 63 %) eines farblosen Öls erhalten. Rf = 0.11 in Petrolether / Ethylacetat 4 : 1 + 0.1% MeOH. [α] : -5.6 ° (c 1.17, CHCl20D 3) OHOH 144 14 1' 1H NMR, g COSY, gHSQC gHMBC (400.45 MHz, CDCl3): δ = 7.30-7.26 (m, 2H, Carom.-H), 7.19-7.16 (m, 3H, Carom.-H), 5.87-5.76 (m, 1H, 2-H), 5.16-5.11 (m, 2H, 1-H), 3.93-3.82 (m, 2H, 4-H, 6-H), 2.63 (t, 2H, 3J = 7.7 Hz, 10-H), 2.30-2.18 (m, 2H,3-H), 1.71-1.60 (m, 2H, 9-H), 1.61 (dt, 1H, 2J = 14.5 Hz, 3J = 2.4 Hz, 5-Hsyn), 1.56-1.39 (m, 4H, 7-H, 8-H), 1.48 (dt, 1H, 2J = 14.4 Hz, 3J =10.0 Hz, 5-Hanti). 13C NMR (100.70 MHz, CDCl3): δ = 142.5 (s, C-1), 134.2 (d, C-2.), 128.3 (d, Carom., 128.2 (d, Carom.), 125.6 (d, Carom.), 118.3 (t, C-3), 72.7 (d, C-6), 71.9 (d, C-4), 42.5 (t, C-3), 42.3 (t, C-5), 37.9 (t, C-7), 35.9 (t, C-10), 31.4 (t, C-9), 24.9 (t, C-8). 158 Experimenteller Teil LC-MS (C18grav_split4pos): tR = 9.85 min, m/z 248.99 [M+H]+. GC-MS (DB_100_S) des TMS-Derivats: tR (syn) = 5.27 min, m/z (rel. Intens.) 377(1) [M-15]+, 281(9), 235(100), 145 (53) 91(30), 73(63). tR (anti) = 4.60 min, m/z (rel. Intens.) 377(1) [M-15]+, 281(10), 235(90), 145 (100) 91(70), 73(90). MS (FAB) m/z 249.07 [M+H]+ HR-MS (FAB) ber. für C16H25O2 249.1855 [M+H]+, gef. 249.1830. (4R, 6S)-4-Allyl-2, 2-dimethyl-6-(4-phenylbutyl)-1, 3-dioxan (148) In einem Schlenk-Rohr wurden 22.8 mg (0.09 mmol) des Diols 144 und 1.8 mg (0.007 mmol) (+)-CSA in 2 ml Dimethoxypropan gelöst und bei Raumtemperatur gerührt. Nach 3.5 h zeigte eine DC- Kontrolle (PE/EE 4 : 1 (v/v)) vollständigen Umsatz an, und die Reaktionslösung wurde mit 5 ml Ethylacetat verdünnt. Es wurde mit ges. NaHCO3-Lösung und ges. NaCl- Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über MgSO4 getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt wurde auf Celite aufgezogen, und es wurde in einer Pasteur-Pipette chromatographisch aufgereinigt (KG, 0.7 g, PE/EE 99 : 1 (v/v) auf 95 : 5). Es wurden 12.0 mg (0.04 mmol, 46 %) eines farblosen Öls erhalten. Rf = 0.27 in Petrolether / Ethylacetat 95 : 5. [α] : +4.3 ° (c 1.40, CHCl20D 3) Diastereomerenverhältnis syn /anti 19 :1 (bestimmt durch GC-MS). 159 Experimenteller Teil OO 1'' 148 4 1 61' 1''' 1'''' 1H NMR, gHSQC gHMBC (500.13 MHz, CDCl3): δ = 7.29-7.26 (m, 2H, Carom.- H), 7.19-7.17 (m, 3H, Carom.-H), 5.85-5.77 (m, 1H, 2’’’-H), 5.11-5.04 (m, 2H, 3’’’-H), 3.89-3.83 (m, 1H, 4-H), 3.81-3.76 (m, 1H, 6-H), 2.61 (t, 2H, 3J = 7.6 Hz, 4’-H), 2.31 (ddd, 1H, 2J = 13.9 Hz, 3J = 6.3, 6.3 Hz, 1’’’-Ha), 2.15 (ddd, 1H, 2J = 13.8 Hz, 3J = 7.0, 6.9 Hz, 1’’’-Hb), 1.65-1.52 (m, 4H, 1’-H, 3’-H), 1.49 (ddd, 1H, 2J = 12.8 Hz, 3J = 2.4, 2.4 Hz, 5-Heq.), 1.43 (s, 3H, 1’’’’-H), 1.41-1.34 (m, 2H, 2’-H), 1.40 (s, 3H, 1’’’’-H), 1.12 (ddd, 1H, 2J = 12.2 Hz, 3J = 12.0, 12.0 Hz, 5-Hax). 13C NMR (125.77 MHz, CDCl3): δ = 142.7 (s, C-1’’), 134.3 (d, C-2’’’.), 128.4 (d, Carom.), 128.2 (d, Carom.), 125.6 (d, Carom.), 117.0 (t, C-3’’’), 98.4 (s, C-2), 68.9 (d, C-6), 68.7 (d, C-4), 40.9 (t, C-1’’’), 36.5 (t, C-5), 36.3 (t, C-1’), 35.9 (t, C-4’), 31.5 (t, C-3’), 30.3 (q, C-1’’’’), 24.7 (t, C-2’), 19.8 (q, C-1’’’’). GC-MS (DB_100_S): tR (syn) = 5.48 min, m/z (rel. Intens.) 288(1) [M+H]+, 273(25), 171(41), 91(100). tR (anti) = 5.44 min, m/z (rel. Intens.) 288(1) [M+H]+, 273(29), 171(56), 91(100). MS (FAB) m/z 289.3 [M+H]+ HR-MS (FAB) ber. für C19H29O2 289.2168 [M+H]+, gef. 289.2139. (4R,6S,8S)-6-(tert-Butyldimethylsilyloxy)-12-phenyldodec-1-ene-4,8-diol (145) Gemäß AAV 4 wurden 1.23 g (0.78 mmol) des immobilisierten Homoallylalkohols 143 in 9 ml DMF mit 588 mg (3.92 mmol) TBDMSCl, 264 mg (3.88 mmol) Imidazol und 27 mg (0.2 mmol) DMAP umgesetzt. Nach 160 Experimenteller Teil Entfernen aller Lösungsmittelrückstände im Hochvakuum lag ein leicht gelbliches Harz vor. FT-IR ν~ [cm-1] = 3621 (w), 3100-2850 (s), 1941 (s), 1869 (m), 1802 (m), 1723 (m), 1638 (w), 1599 (s), 1494 (w). Gemäß AAV 2 wurden 1.33 g (0.78 mmol) des immobilisierten Alkens in 15 ml DCM mit Ozon umgesetzt und anschließend mit 1.04 g (3.97 mmol) Triphenylphoshin reduziert. Nach Entfernen aller Lösungsmittelrückstände im Hochvakuum lag ein gelbliches Harz vor. FT-IR ν~ [cm-1] = 3620 (m), 3100-2850 (s), 2141 (m), 1941 (s), 1870 (m), 1729 (s), 1635 (w), 1600 (s), 1493 (w). Gemäß AAV 3 wurden 1.22 g (0.7 mmol) des immobilisierten Aldehyds in 12 ml THF mit 6 ml einer 1M Lösung von lIpc2BAll umgesetzt. Nach oxidativer Aufarbeitung und Trocknung im Hochvakuum wurde ein leicht gelbliches Harz erhalten. FT-IR ν~ [cm-1] = 3520 (s), 3100-2850 (s), 1942 (s), 1871 (m), 1803 (m), 1719 (m), 1641 (w), 1600 (s), 1495 (w). (4R,6S,8S)-12-Phenyldodec-1-ene-4,6,8-triol (146) Gemäß AAV 7 wurden 211 mg (0.13 mmol) des Harzes 145 in 2 ml THF mit 300 μl Pyridin und 400 μl HF/Pyridin versetzt. Das Rohprodukt (39.8 mg) wurde auf Celite aufgezogen und blitzchromatographisch gereinigt (KG, 3 g, 8 x 1 cm, PE/EE 4 : 1 (v/v) + 0.1 % MeOH auf PE/EE 2 : 1 (v/v) + 0.1 % MeOH). Es wurden 14.0 mg (0.05 mmol, 38 %) eines farblosen Öls erhalten. 161 Experimenteller Teil Rf = 0.20 in Petrolether / Ethylacetat 1 : 1 + 0.1% MeOH. [α] : -4.86 ° (c 1.4, CHCl20D 3) OHOHOH 1'' 146 1468 12 1H NMR, gHSQC gHMBC (500.13 MHz, CDCl3): δ = 7.29-7.26 (m, 2H, Carom.- H), 7.19-7.17 (m, 3H, Carom.-H), 5.85-5.76 (m, 1H, 2-H), 5.15-5.11 (m, 2H, 1- H), 4.30-4.13 (m, 1H, 6-H), 4.08-3.95 (m, 1H, 4-H), 3.89-3.84 (m, 1H, 8-H), 2.62 (t, 2H, 3J = 7.6 Hz, 12-H), 2.29-2.19 (m, 2H, 3-H), 1.69-1.32 (m, 10H, 5- H, 7-H, 9-H, 10-H, 11-H). 13C NMR (125.77 MHz, CDCl3): δ = 142.5 (s, C-1’), 134.2 (d, C-2.), 128.4 (d, Carom., 128.2 (d, Carom.), 125.6 (d, Carom.), 118.3 (t, C-1), 73.6 (d, C-6), 72.7 (d, C-8), 71.7 (d, C-6), 43.4 (t, C-5 oder C-7), 43.0 (t, C-5 oder C-7), 42.5 (t, C-3), 38.0 (t, C-9), 35.9 (t, C-12), 31.4 (t, C-11), 24.9 (t, C-10). LC-MS (C18grav_split4pos): tR = 9.26 min, m/z 293.0 [M+H]+. HR-MS (FAB) ber. für C18H29O3 293.2117 [M+H]+, gef. 293.2132. (R)-6-((2S,4S)-2,4-Dihydroxy-8-phenyloctyl)-5,6-dihydro-2H-pyran-2-on (136) Gemäß AAV 5 wurden 1.01 g (0.61 mmol) 145 in 8 ml DCM mit 285 mg (3.15 mmol) Acryloylchlorid, 327 mg (3.23 mmol) Triethylamin und 12 mg (0.11 mmol) DMAP umgesetzt. Nach Entfernen aller Lösungsmittelrückstände im Hochvakuum wurde ein gelbliches Harz erhalten. FT-IR ν~ [cm-1] = 3412-3131 (br m), 3100-2850 (s), 1946 (s), 1874 (m), 1803 (m), 1730 (s), 1597 (s). 162 Experimenteller Teil Gemäß AAV 6 wurden 906 mg (0.54 mmol) in 12 ml DCM mit 53.3 mg (0.085 mmol) des Katalysators 95 in 3 ml DCM und 24.1 mg (0.038 mmol) in 2 ml DCM umgesetzt. Nach Entfernen aller Lösungsmittelrückstände im Hochvakuum wurde ein braunes Harz (792 mg) erhalten, welches nach AAV 7 in 6 ml THF mit 600 μl Pyridin und 800 μl HF/Pyridin umgesetzt wurde. Nach Quenchen mit 5 ml TMSOMe, Filtration und Einengen wurden 38 mg eines hochviskosen grün-braunen Öls erhalten, welches säulenchromatographisch aufgereinigt wurde (1. Säule: KG, 2.8 g, 7.5 x 1 cm, PE/EE 4 : 1 (v/v) + 0.1 % MeOH auf EE + 0.1 % MeOH; 2. Säule: KG, 0.55 g, DCM/Aceton 9 : 1 (v/v) auf DCM/Aceton 1 : 1). Auf diese Weise wurden 8.9 mg (0.028 mmol, 5.2 %) eines leicht braunen Öls erhalten. Rf = 0.26 in Ethylacetat + 0.1% MeOH [α] : + 48.4 ° (c 1.0, CHCl20D 3) Lit. (Ramana2005) [α] 25 : + 62.1 ° (c 1.0, CHClD 3) Diasteromerenverhältnis 85 : 9 : 2 : 2 O O 3 4 1' OHOH 1'' 136 1H NMR, gHSQC, gHMBC (500.13 MHz, CDCl3): δ = 7.29-7.26 (m, 2H, 2 x Carom.-H), 7.18-7.16 (m, 3H, 3 x Carom.-H), 6.89 (ddd, 1H, 3J = 9.4, 4.7, 3.9 Hz, 4-H), 6.02 (ddd, 1H, 3J = 9.6 Hz, 4J = 1.6, 1.6 Hz, 3-H) 4.70-4.64 (m, 1H, 6-H), 4.15-4.10 (m, 1H, 2’-H), 3.90-3.85 (m, 1H, 4’-H), 2.62 (t, 2H, 3J = 7.6 Hz, 8’- H), 2.43-2.41 (m, 2H, 5-H), 2.02 (ddd, 1H, 2J = 15.0, 3J = 7.5, 7.5 Hz, 1’-Ha), 1.77 (ddd, 1H, 2J = 14.4, 3J = 5.4, 3.9 Hz, 1’-Hb), 1.67-1.31 (m, 8H, 3’-H, 5’-H, 6’-H, 7’-H). 13C NMR (125.77 MHz, CDCl3): δ = 164.1 (s, C-2), 145.3 (d, C-4), 142.4 (s, C- 1’’), 128.4 (d, C-2’’), 128.3 (d, C-4’’), 125.7 (d, C-3’’), 121.2 (d, C-3), 76.3 (d, C-6), 72.9 (d, C-4’’), 69.8 (d, C-2’), 42.8 (t, C-3’), 42.3 (t, C-1’), 38.1 (t, C-5’), 35.8 (t, C-8’), 31.3 (t, C-7’), 29.4 (t, C-5), 24.9 (t, C-6’). Die spektroskopischen Daten stimmen mit der Literatur überein.[90] 163 Experimenteller Teil LC-MS: (C18grav_split4pos): tR = 8.52 min, m/z 319.01 [M+H]+. HPLC: Säule Nucleodur ISIS C18, Gradient 20 % MeCN + 0.1 % TFA in H2O + 0.1 % TFA, 1 min, dann in 18 min auf 95 % MeCN. Detektion bei 212 nm. tR = 9.48 min. (R)-6-((2R,4R)-2,4-Dihydroxy-8-phenyloctyl)-5,6-dihydro-2H-pyran-2-on (150) Nach AAV 6 wurden 875 mg (0.263 mol) des aus 149 gewonnenen immobilisierten Acrylesters in 7 ml DCM mit 2 x 33.2 mg (0.053 mmol) des Katalysators 95 in 1.5 ml DCM umgesetzt. Nach Entfernen aller Lösungsmittelrückstände wurde ein braunes Harz erhalten, das zur Abspaltung nach AAV 7 in 6 ml THF gequollen und mit 200 μl Pyridin und 350 μl HF/Pyridin umgesetzt wurde. Nach Quenchen mit 4 ml TMSOMe, Filtration und Einengen wurden 55 mg eines grünlichen Öls erhalten, das säulenchromatographisch aufgereinigt wurde (1. Säule: KG, 3.5 g, 11 x 1 cm, PE/EE 2 : 1 (v/v) + 0.1 % MeOH auf EE + 0.1 % MeOH; 2. Säule: KG, 0.8 g, PE/EE 1 : 1 (v/v) + 0.1 % MeOH auf EE + 0.1 % MeOH). Es wurden 5.3 mg (0.017 mmol, 3 %) eines leicht bräunlichen viskosen Öls erhalten. Rf = 0.25 in Ethylacetat + 0.1% MeOH [α] : + 33.9 ° (c 0.59, CHCl20D 3) Diasteromerenverhältnis (LC-MS) 79 : 14 : 7 O O 3 4 1' OHOH 1'' 150 1H NMR, gCOSY, gHSQC (400.45 MHz, CDCl3): δ = 7.29-7.25 (m, 2H, 2 x Carom.-H), 7.20-7.16 (m, 3H, 3 x Carom.-H), 6.89 (ddd, 1H, 3J = 9.7, 5.4, 3.1 Hz, 4-H), 6.02 (ddd, 1H, 3J = 9.8 Hz, 4J = 2.3, 1.2 Hz, 3-H) 4.78-4.71 (m, 1H, 6-H), 164 Experimenteller Teil 4.26-4.20 (m, 1H, 2’-H), 3.92-3.87 (m, 1H, 4’-H), 2.62 (t, 2H, 3J = 7.7 Hz, 8’- H), 2.38-2.33 (m, 2H, 5-H), 1.86 (ddd, 1H, 2J = 14.4, 3J = 9.6, 2.5 Hz, 1’-Ha), 1.71 (ddd, 1H, 2J = 14.4, 3J = 10.1, 3.0 Hz, 1’-Hb), 1.69-1.33 (m, 8H, 3’-H, 5’- H, 6’-H, 7’-H). 13C NMR (100.71 MHz, CDCl3): δ = 164.4 (s, C-2), 145.3 (d, C-4), 142.4 (s, C- 1’’), 128.4, 128.3, 125.7 (3 x d, C-2’’, C-3’’, C-4’’), 121.3 (d, C-3), 74.7 (d, C-6), 73.0 (d, C-4’), 68.1 (d, C-2’), 43.2 (t, C-3’), 43.0 (t, C-1’), 38.2 (t, C-5’), 35.8 (t, C-8’), 31.3 (t, C-7’), 29.9 (t, C-5), 24.9 (t, C-6’). LC-MS (ISIS_C18_split3pos45): tR = 4.64 min, m/z 319.01 [M+H]+. MS (FAB) m/z 319.3 [M+H]+ HR-MS (FAB) ber. für C19H27O4 319.1909 [M+H]+, gef.319.1898. 165 Experimenteller Teil 5.4 Versuche zu Kapitel 3.1.3 AAV 10: Synthese der Diene an der festen Phase In einem Schlenk-Kolben wurde das Phosphonium-Salz (3 Äq.) in THF suspendiert und auf 0 °C abgekühlt. Langsam wurde eine Lösung von n-BuLi in Hexan (2.9 Äq.) zugegeben, bis sich eine klare rote Lösung gebildet hatte. In einem zweiten Kolben wurde das Aldehyd-Harz 170 in THF gequollen. Mit einer Transferkanüle wurde die Lösung des Ylids zum Harz gegeben. Es wurde 16 h bei Raumtemperatur geschüttelt. Daraufhin wurde das Harz filtriert und gewaschen (50 ml THF/H2O 3 : 1, 100 ml THF, 50 ml DMF, 30 ml MeOH und 100 ml DCM). Es wurde im Hochvakuum getrocknet. AAV 11: Hetero-Diels-Alder Reaktion an der festen Phase In einem Schlenk-Kolben wurden n mmol (R)-BINOL in 6n ml DCM gelöst, mit einer Lösung von 0.5 n mmol Titantetraisopropoxylat in 3n ml DCM versetzt und 1 h zum Rückfluss erhitzt. Danach wurde das Lösungsmittel im Hochvakuum entfernt (1 h). Das Ethylglyoxylat (50 % in Toluol) wurde 2-3 h bei 80 °C depolymerisiert und anschließend destillativ vom Toluol getrennt (Sdpkt. 50-55 °C, 50 mbar). Das immobilisierte Dien (n mmol) wurde in 12n ml DCM gequollen und auf - 30 °C abgekühlt, woraufhin der Katalysator, gelöst in 6n ml DCM, zugegeben wurde. In mehreren Portionen wurden nun über einen Zeitraum von 3 h insgesamt 10 – 20 Äq. jeweils frisch destilliertes Ethylglyoxylat zugegeben. Danach wurde das Kühlbad entfernt, und die Reaktionsmischung nahm Raumtemperatur an. Nach insgesamt 15 h Reaktionszeit wurde das Harz filtriert und gewaschen: 2 x DCM, 2 x DMF, 2 DMF/H2O 1 : 1, 2 x DMF, 1 x MeOH, 2 x DCM. Es wurde im Hochvakuum getrocknet. AAV 12: Hydrierung der immobilisierten Ethylester Der immobilisierte Ester wurde in THF gequollen (ca. 10 ml/g Harz) und auf 0 °C abgekühlt. Es wurden 4 Äq. einer 2M Lösung von LiBH4 in THF zugegeben und 16 h geschüttelt, wobei die Lösung Raumtemperatur annahm. Das Harz wurde filtriert und gewaschen (für 1 g Harz): 20 ml THF, 60 ml 166 Experimenteller Teil THF/H2O/NH4Cl ges. 40 : .30 : 5, 20 ml THF/H2O 1 : 1, 20 ml THF, 20 ml DMF, 100 ml DCM, 20 ml MeOH. Es wurde im Hochvakuum getrocknet. AAV 13: Abspaltung vom Wang-Harz unter gleichzeitiger Oxidation zum Lakton Zur Abspaltung wurde das Jones-Reagenz verwendet, welches wie folgt hergestellt wurde: 200 mg (2.0 mmol) CrO3 wurden in 0.5 ml H2O gelöst und auf 0 °C abgekühlt. Nach langsamer Zugabe von 0.168 ml H2SO4 konz. wurde das Volumen mit H2O auf 1 ml aufgefüllt. 500 mg (ca. 0.15 mmol) des Harzes wurden in 8 ml Aceton suspendiert und mit 10 Äq. Jones Reagenz (750 μl) versetzt. Es wurde 3 h bei Raumtemperatur geschüttelt und anschließend mit ca. 0.5 ml 2-Propoanol versetzt, um überschüssiges Reagenz zu reduzieren. Es wurde mit ges. NaHCO3-Lösung neutralisiert und filtriert. Der Rückstand wurde 3 x mit DCM gewaschen. Die Phasen des Filtrats wurden getrennt, und die wässrige Phase wurde 3 x mit DCM extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über MgSO4 getrocknet, filtriert und eingeengt. Natrium-3-oxoacrolein (169) In einem 2-Liter Kolben mit großem Magnetrührstab wurde 1,1,3,3- Tetramethoxypropan (100 g, 0.45 mmol) mit 1N HCl (37.5 ml) und H2O (50 ml) versetzt und 1.5 h heftig bei Raumtemperatur gerührt, wobei sich eine einzige gelbe Phase bildete. Die Lösung wurde im Eisbad abgekühlt und mit 5N NaOH auf pH 10 gebracht; dabei trat eine Rotfärbung auf. Durch langsame Zugabe von Aceton (insgesamt 1l) wurde das Reaktionsprodukt ausgefällt. Der Niederschlag wurde abfiltriert, mit Aceton gewaschen und über Nacht im Hochvakuum getrocknet, Der Rückstand wurde in 250 ml Methanol unter Rückfluss gelöst. Es wurde mit Aktivkohle versetzt und filtriert. Aus dem Filtrat wurde das Produkt durch Zugabe von Diethylether (800 ml) ausgefällt. Nach erneuter Filtration wurde der Rückstand 24 h bei 100 °C im Hochvakuum getrocknet. 167 Experimenteller Teil Auf diese Weise konnten 16.5 g (170 mmol, 39 %) eines leicht gelblichen Feststoffes gewonnen werden, der bei 4 °C unter Luftausschluss gelagert wurde. Schmp. 232-235 °C (Zers.) 1H NMR (400.45 MHz, D2O): δ = 8.70 (d, 2H, 3J = 10.1 Hz), 5.35 (t, 1H, 3J = 10.1 Hz). 13C NMR (100.71 MHz, D2O): δ = 193.0 (d), 109.7 (t). Die angegebenen Daten stimmen mit der Literatur überein.[143]. Immobilisiertes 3-Oxoacrolein (170) In einem 100 ml Schlenk-Kolben wurde unter Argon Bromo-Wang-Harz (5 g, 8.5 mmol) in 30 ml DMF gequollen. Nach Zugabe von 2.5 Äq. des Aldehyds 169 (1.95 g, 21.3 mmol) wurde 16 h bei Raumtemperatur geschüttelt. Daraufhin wurde das Harz filtriert und gewaschen (50 ml DMF, 100 ml DMF/H2O 3 : 1, 100 ml DMF, 30 ml MeOH und 30 ml DCM). Es wurde im Hochvakuum getrocknet. Um eine höhere Beladung zu erzielen, wurde ein zweiter Zyklus dieser Reaktion durchgeführt. Es wurde ein gelbliches Harz erhalten. Die Beladung des Aldehyds wurde mit der DNPH-Methode bestimmt. Es konnten Beladungen von 1.0 mmol/g (63 %, bezogen auf die theoretische Ladung des Harzes) erzielt werden. FT-IR ν~ [cm-1] = 3359 (w), 3147 (s), 2979 (s), 2688 (m), 1980 (m), 1925 (m), 1845 (m), 1783 (s), 1566 (w), 723 (w). Immobilisiertes 1,3-Butadien (156) Nach AAV 10 wurden 4.96 g (5.4 mmol) des immobilisierten Aldehyds 170 in 20 ml THF mit 6.42 g (18.0 mmol) Triphenylmethylphosphoniumbromid in 35 ml THF und 7.2 ml einer 2.5M Lösung von n-BuLi umgesetzt. 168 Experimenteller Teil Dabei wurde ein leicht gelbliches Harz erhalten. FT-IR ν~ [cm-1] = 3576 (w), 3147 (s), 2913 (s), 1948 (m), 1880 (m), 1805 (m), 1749 (m), 1648 (s), 1508 (w), 547 (w). Immobilisiertes 4-Methyl-1,3-butadien (160) Nach AAV 10 wurden 1.99 g (2 mmol) des immobilisierten Aldehyds 170 in 14 ml THF mit 2.36 g (6.4 mmol) Ethyltriphenylphosphoniumbromid in 10 ml THF und 2.7 ml einer 2.5M Lösung von n-BuLi umgesetzt. Dabei wurde ein leicht gelbliches Harz erhalten. FT-IR ν~ [cm-1] = 3439 (w), 3025 (s), 2926 (s), 1944 (m), 1879 (m), 1803 (m), 1713 (m), 1679 (s), 1515 (w), 540 (w). (R)-Ethyl 6-oxo-3,6-dihydro-2H-pyran-2-carboxylat (162) Nach AAV 11 wurden 496 mg (0.57 mmol) des immobilisierten Diens 156 mit 154 mg (0.58 mmol) (R)-BINOL, 82.4 mg (0.29 mmol) Titantetraisopropoxylat und 3 ml Ethylglyoxylat umgesetzt. Nach Aufarbeitung und Entfernung aller Lösungsmittelrückstände im Hochvakuum wurde ein rotes Harz erhalten. FT-IR ν~ [cm-1] = 3500 (br s), 3029 (s), 1947 (m), 1880 (m), 1765 (m), 1610 (s), 1501 (w), 854 (m). Zur Bestimmung des Enantiomerenüberschusses wurden nach AAV 13 50- 100 mg des Harzes umgesetzt. Dabei wurden 3-5 mg (0.018-0.030 mmol, 18- 30 %) eines gelb-braunen Öls erhalten. Das Rohprodukt wurde direkt mittels GC analysiert. Eine analysenreine Probe konnte durch säulenchromatographische Aufreinigung (KG, Cyclohexan/Diethylether 4 : 1) gewonnen werden. Dabei wurde 162 als farbloses Öl erhalten. 169 Experimenteller Teil Rf = 0.36 in Cyclohexan/Diethylether 3 : 1 (v/v). [α] : -6.3 ° (c 0.08, CHCl20D 3) (bestimmt für (S)-162, 87 %ee). O O O O 162 2 6 1' 1'' 1H NMR (400.45 MHz, CDCl3): δ = 6.81 (dddd, 1H, 3J = 9.9, 4.5, 3.7 Hz, 4J = 0.7 Hz, 4-H), 6.07 (ddd, 1H, 3J = 9.9, 2.15, 1.7 Hz, 3-H), 5.03 (t, 1H, 3J = 5.5 Hz, 6-H), 4.28 (dq, 1H, 2J = 3.6 Hz, 3J = 7.2 Hz, 1’’-Ha), 4.26 (dq, 1H, 2J = 3.6 Hz, 3J = 7.1 Hz, 1’’-Hb), 2.83 (dddd, 1H, 2J = 18.6 Hz, 3J = 6.0, 3.7, 2.2 Hz, 5-Ha), 2.76 (dddd, 1H, 2J = 18.6 Hz, 3J = 5.5, 4.7, 1.6 Hz, 5-Hb), 1.30 (t, 3H, 3J = 7.1 Hz, 2’’-H). 13C NMR (125.77 MHz, CDCl3): δ = 195.2 (s, C-1’), 169.0 (s, C-2). 142.5 (d, C-4), 122.0 (d, C-3), 74.3 (d, C-6), 62.3 (t, C-1’’), 26.4 (t, C-5), 14.1(q, C-2’’). GC-MS (DB_50_S): tR (syn) = 5.91 min, m/z (rel. Intens.) 170(1) [M]+, 141(9), 97(100), 69(34), 41(46). GC (Lipodex E, 100 °C (1 min), dann 25 °C/min auf 200 °C (7 min)): tR (R -162): 6.62 min. tR (S -162): 6.45 min. (2R,3S)-Ethyl 3-methyl-6-oxo-3,6-dihydro-2H-pyran-2-carboxylat (163) Nach AAV 11 wurden 3.00 g (3.3 mmol) des immobilisierten Diens 160 mit 154 mg (0.58 mmol) (R)-BINOL, 82.4 mg (0.29 mmol) Titantetraisopropoxylat und 3 ml Ethylglyoxylat umgesetzt. Nach Aufarbeitung und Entfernung aller Lösungsmittelrückstände im Hochvakuum wurde ein rotes Harz erhalten. Zur Bestimmung des Enantiomerenüberschusses wurden nach AAV 13 50- 100 mg des Harzes umgesetzt. Dabei wurden 1.5-3 mg (0.008-0.016 mmol, 170 Experimenteller Teil 10-20 %) eines gelb-braunen Öls erhalten. Das Rohprodukt wurde direkt mittels GC analysiert. Rf = 0.23 in Cyclohexan/Ethylacetat 7 : 3 (v/v). [α] : +88.0 ° (c 0.5, CHCl20D 3). O O O O 162 2 6 1' 1'' 1''' 1H NMR, gHSQC gHMBC (500.13 MHz, CDCl3): δ = 6.87 (dd, 1H, 3J = 9.7, 5.4 Hz, 4-H), 6.01 (dd, 1H, 3J = 9.7 Hz, 4J = 1.2 Hz, 3-H), 4.99 (d, 1H, 3J = 4.4 Hz, 6-H), 4.31 (q, 1H, 3J = 7.2 Hz, 1’’’-Ha), 4.30 (q, 1H, 3J = 7.1 Hz, 1’’’-Hb), 2.99-2.92 (m, 1H, 5-H), 1.33 (t, 3H, 3J = 7.1 Hz, 2’’’-H), 1.12 (d, 3H, 3J = 7.2 Hz, 1’-H). 13C NMR (125.77 MHz, CDCl3): δ = 167.3 (s, C-2), 149.2 (d, C-4), 120.3 (d, C-3), 77.7 (d, C-6), 61.9 (t, C-1’’’), 31.1 (d, C-5), 14.2 (q, C-2’’’), 13.1 (q, C-1’). GC (Lipodex E, 100 °C (1 min), dann 25 °C/min auf 175 °C (0 min), dann 2.5 °C/min auf 200 °C (5 min)): tR (R,R-162): 7.34 min. tR (S,S-162): 7.41 min. (R)-(+)-5,5',6,6',7,7',8,8'-Octahydro-1,1'-bi-2-naphthol (R)-168 In einem Autoklaven wurden 507 mg (1.77 mmol) (R)-BINOL in 15 ml EtOH gelöst und mit dem Palladium-Katalysator (10% Palladium auf Aktivkohle, 50% H2O, 264 mg, ca. 13.2 mg Pd, 0.124 mmol) versetzt. Unter 55 atm H2 wurde 2 h bei 70 °C gerührt. Anschließend wurde über Celite abfiltriert, der Rückstand mit DCM gewaschen und eingeengt. Es wurde blitzchromatographisch aufgereinigt (KG, 28 g, 22 x 2.5 cm, DCM). Auf diese 171 Experimenteller Teil Weise konnten 453.6 mg (1.54 mmol, 87%) eines weißen Feststoffen gewonnen werden. Rf = 0.25 in DCM Schmp. 162-163 °C [α] : + 48 ° (c 1.07 CHCl20D 3), Lit.-Wert[[114] [α] : 52.8 ° (c 1.1 CHCl25D 3). OH OH 1 5 168 1H NMR (400.45 MHz, CDCl3): δ = 7.07 (d, 2H, 3J = 8.3 Hz, 4-H), 6.83 (d, 2H, 3J = 8.3 Hz, 3-H), 4.58 (br s, 2H, O-H), 2.75 (t, 4-H, 3J = 6.3 Hz, 5-H, 8-H), 2.29 (dt, 2H, 2J = 17.2 Hz, 3J = 6.1 Hz), 2.16 8 (dt, 2H, 2J = 17.2 Hz, 3J = 6.4 Hz), 1.77-1.64 (m, 4H). 13C NMR, DEPT (100.70 MHz, CDCl3): δ = 151.4 (s), 137.1 (s), 131.0 (d), 130.1 (s), 118.8 (s), 113.0 (d), 29.2 (t), 27.1 (t), 23.0 (t), 22.9 (t). Die analytischen Daten stimmen mit der Literatur überein.[113] (3aR,3a'R,8aS,8a'S)-2,2'-(Propan-2,2-diyl)bis(8,8a-dihydro-3aH- indeno[1,2-d]oxazol) (169) In einem 20 ml Schlenk-Kolben wurden 501.0 mg (3.36 mmol) (1R,2S)-1- Amino-2-indanol in 8 ml DCM gelöst und mit 1.36 g (13.4 mmol) Triethylamin versetzt. Nach Abkühlen auf 0 °C wurde eine Lösung von 280.5 mg (1.66 mmol) Dimethylmalonylchlorid in 1 ml DCM mittels Spritze langsam zugegeben, wobei eine Trübung der Lösung auftrat. Es wurde 2 h bei 0 °C gerührt, dann 2 h bei RT, bis eine DC-Kontrolle [Ethylacetat/Cyclohexan 4 : 1, Rf(171) = 0.23] vollständigen Umsatz anzeigte. Es wurde mit 5 ml 1M Salzsäure gequencht, die Phasen wurden getrennt. Die wässrige Phase wurde mit 3 x 6 ml DCM extrahiert, anschließend wurden die vereinigten 172 Experimenteller Teil organischen Phasen mit ges. NaHCO3-Lösung und ges. NaCl-Lösung gewaschen, über MgSO4 getrocknet und eingeengt. Es wurde am Hochvakuum getrocknet (14 h) und unter Argon gestellt. Unter Argon wurde ein Wasserabscheider angebaut, und es wurde mit 5 ml (4.8 g, 16.9 mmol) Titantetraisopropoxylat versetzt. Es wurde zunächst 2 h bei 100 °C, dann 4 h bei 140 °C gerührt, wobei die Lösung gelinde siedete. Dann wurde abgekühlt, wobei die Lösung stockte. Es wurden 3.0 g (25 mmol) 3-Dimethylamino-1,2- propandiol zugegeben. Nach 45 min wurden je 6 ml EE und H2O zugegeben. Die Phasen wurden getrennt, und es wurde mit 3 x 1 ml EE extrahiert, die vereinigten organischen Phasen über MgSO4 getrocknet und eingeengt. Es wurden 1.18 g eines festen Schaums erhalten, der blitzchromatographisch aufgereinigt wurde (KG, 24 x 6 cm, EE/Cyclohexan 1 : 1 (v/v) + 0.1 % NEt3 auf EE, dann auf EE/MeOH 1 : 4). Es konnten 494.3 mg (1.38 mmol, 83 %) eines weißen Feststoffes isoliert werden. Rf = 0.21 in Cyclohexan/Ethylacetat 4 : 1 (v/v) [α] : + 50.8 ° (c 1.54, CHCl20D 3) Schmp. 179-181 °C O N N O 169 1 1' 2' 3 5 9 4a 1H NMR, (400.45 MHz, CDCl3): δ = 7.51-7.49 (m, 2H, Carom.-H), 7.27-7.21 (m, 6H, Carom.-H), 5.52 (d, 2H, 3J = 7.9 Hz, 4-H), 5.25 (ddd, 2H, 3J = 7.9, 7.1, 1.9 Hz, 10-H), 3.30 (dd, 2H, 2J = 17.9 Hz, 3J = 7.1 Hz, 9-Hcis), 2.95 (dd, 2H, 2J = 17.9 Hz, 3J = 1.1 Hz, 9-Htrans), 1.42 (s, 6H, 2’-H). 13C NMR (100.70 MHz, CDCl3): δ = 169.1 (s, C-2), 141.8 (s, C-4a oder C-8a), 139.7 (s, C-4a oder C-8a), 128.3 (d, Carom.), 127.3 (d, Carom.), 125.6 (d, Carom.), 125.0 (d, Carom.), 83.2 (d, C-4 oder C-10), 76.5 (d, C-4 oder C-10), 39.6 (t, C- 9), 38.5 (s, C-1’), 23.9 (q, C-2’). Die Werte stimmen mit der Literatur[144] überein. MALDI-TOF: m/z = 359.7 [M+H]+ 173 Experimenteller Teil (2R,6S)-Ethyl 6-methoxy-3,6-dihydro-2H-pyran-2-carboxylat (153) Der Katalysator 172 wurde durch Rühren von 55.2 mg (0.241 mmol) des Ligandens 170 mit 86.4 mg (0.239 mmol) Kupfer(II)triflat in 4.5 ml THF (1 h) und anschließendes Entfernen des Lösungsmittels im Hochvakuum hergestellt. In einem Schlenk-Kolben wurden 23.2 mg (0.035 mmol) des Katalysators 172 mit 109 mg aktivierten Molsieb 3Å in 2 ml THF suspendiert und 1 h gerührt. Die türkis-grüne Lösung wurde mittels Transferkanüle in einen zweiten 10 ml Schlenk-Kolben überführt. Es wurden weitere 2 ml THF zugegeben und auf 0 C abgekühlt. Dann wurden 435.8 mg (4.27 mmol) destilliertes Ethylglyoxylat und 76 mg (0.903 mmol) 1-Methoxy-1,3-butadien zugegeben. Nach 3 h wurde de Lösung durch Kieselgel filtriert und mit Cyclohexan/Diethylether filtriert. Es wurden 104.7 mg (62 %) eines farblosen Öls erhalten, das ohne weitere Aufreinigung weiter umgesetzt wurde.Analysenreine Substanz konnte nach einer zweiten blitzchromatographischen Aufreinigung (Alox neutral, Brockmann-Stufe IV, 5 g, 8 x 1 cm, PE/Et2O 8 : 2 (v/v) + 0.1 % NEt3) erhalten werden. Rf = 0.23 in PE/EE 4 : 1 (v/v). [α] : + 53 ° (c 1.33 CHCl20D 3) bestimmt für ent-153, Lit.-Wert[107] [α] : +45.0 ° (c 1.0 CHCl 25 D 3). Diastereomerenverhältnis syn/anti 8.7 : 1 (bestimmt durch GC-MS) O O O O 2 6 1' 1'' 153 1''' 1H NMR, gCOSY, gHSQC gHMBC (400.45 MHz, CDCl3): δ = 6.06-6.00 (m, 1H, 4-H), 5.69 (ddd, 1H, 3J = 10.4, 4.0, 2.0 Hz, 3-H), 5.04 (br s, 1H, 2-H), 4.38 (dd, 1H, 3J = 6.6, 5.2 Hz, 6-H), 4.29-4.17 (m, 2H, 1’’-H), 3.51 (s, 3H, 1’’’-H), 174 Experimenteller Teil 2.54-2.46 (m, 1H, 5-Ha), 2.37-2.29 (m, 1H, 5-Hb), 1.31 (t, 3H, 3J = 7.2 Hz, 2’’- H). 13C NMR (125.77 MHz, CDCl3): δ = 171.1 (s, C-1’), 127.4 (d, C-4), 126.2 (d, C-3), 97.2 (d, C-2), 69.6 (d, C-6), 61.1 (t, C-1’’), 55.6 (q, C-1’’’), 26.1 (t, C- 5),14.1 (q, C-2’’). Die Daten stimmten mit den Literaturwerten überein.[107] GC-MS (DB_50_S): tR (syn) = 5.42 min, m/z (rel. Intens.) 185(12) [M-H]+, 155(23), 140(26), 127(18), 113(100), 97(10), 81(100), 71(63), 55(50). tR (anti) = 5.34 min, m/z (rel. Intens.) 185(3) [M-H]+, 155(19), 140(10), 127(18), 113(83), 97(7), 81(100), 71(33), 55(33). (2S,6R)-6-(Hydroxymethyl)-5,6-dihydro-2H-pyran-2-ol (176) Gemäß AAV 12 wurden 1.14 g (0.57 mmol) des immobilisierten Esters 162 mit 1.2 ml LiBH4-Lösung (2M in THF, 2.4 mmol) umgesetzt. Es wurde ein rot- oranges Harz erhalten. FT-IR ν~ [cm-1] = 3600-2800 (br s), 1947 (m), 1880 (m), 1803 (m), 1743 (m), 1590 (m), 1457 (w), 860 (w). (2R,6S)-6-Hydroxy-3,6-dihydro-2H-pyran-2-carbaldehyde (166) 1.83 g (0.58 mmol) des immobilisierten Alkohols 176 wurden in 50 ml THF gequollen und mit 50 ml DMSO versetzt. Es wurden 660 mg (2.36 mmol) IBX zugegeben, danach wurde 21 h bei Raumtemperatur geschüttelt. Das Harz wurde filtriert und gewaschen: 200 ml THF/DMSO 3 : 1, 100 ml THF/H2O 3 : 1, 100 ml THF, 40 ml MeOH, 150 ml CH2Cl2. Nach Trocknen im Hochvakuum wurde erneut in je 30 ml THF und DMSO gequollen, mit 346 mg (1.23 mmol) IBX versetzt und 16 h bei Raumtemperatur geschüttelt. Nach Aufarbeitung wie oben beschrieben konnte mit der DNPH-Methode die Beladung des Aldehyds zu cB = 0.65 mmol g-1 bestimmt werden. 175 Experimenteller Teil FT-IR ν~ [cm-1] = 3500-2800 (br s), 1949 (m), 1883 (m), 1803 (w), 1735 (s), 1587 (w), 1510 (w). (R)-(6-Oxo-3,6-dihydro-2H-pyran-2-yl)methyl acetate (177) Gemäß AAV 12 wurden 215 mg des Esters 157 zum Alkohol reduziert. Dann wurde unter Argon in 5 ml DCM gequollen und mit 38 μl (41 mg, 0.40 mmol) Essigsäureanhydrid, 56 μl (41 mg, 0.41 mmol) Triethylamin und 3 mg DMAP versetzt. Es wurde 16 h bei Raumtemperatur geschüttelt, dann wurde das Harz filtriert und gewaschen: 50 ml DCM, 20 ml DMF, 30 ml DMF/H2O 1 : 1, 20 ml DMF, 50 ml DCM, 50 ml Ethylacetat, 30 ml MeOH. Nach 3 h trocknen im Hochvakuum wurde gemäß AAV 13 vom Harz abgespalten. O O O 177 2 6 1' 1'' O Rf = 0.31 in PE/EE 2 : 1 (v/v). [α] : +9.5 ° (c 0.6, CHCl20D 3). Enantiomerenverhältnis (bestimmt über GC): 87.5 : 12.5 1H NMR, gHSQC (400.45 MHz, CDCl3): δ = 6.90 (ddd, 1H, 3J = 9.8, 2.6, 1.1 Hz, 4-H), 6.06 (ddd, 1H, 3J = 9.8, 2.6, 1.1 Hz, 3-H), 4.68 (ddd, 1H, 3J = 11.4, 9.7, 4.4 Hz, 6-H), 4.29 (dd, 2H, 2J = 1.8 Hz,3J = 4.8 Hz, 1’-H), 2.48 (ddt, 1H, 2J = 18.4 Hz, 3J = 11.5, 2.7 Hz, 5-Ha), 2.39 (dddd, 1H, 2J = 18.4 Hz, 3J = 11.5, 5.7, 4.5, 1.1 Hz, 5-Hb), 2.11 (s, 3H, 2’’-H). 13C NMR (100.70 MHz, CDCl3): δ = 170.6 (s, C-1’’), 163 (s, C-2), 144.3 (d, C- 4), 121.4 (d, C-3), 75.1 (d, C-6), 64.6 (t, C-1’), 25.8 (t, C-5), 20.7 (q, C-2’’). GC (Lipodex E, 100 °C (1 min), dann 25 °C/min auf 175 °C (0 min), dann 2.5 °C/min auf 200 °C (5 min)): tR (R-177): 6.32 min. tR (S-177): 6.24 min. 176 Experimenteller Teil (R,E)-6-(4-Nitrostyryl)-5,6-dihydro-2H-pyran-2-on (179) Gemäß AAV 10 wurden 103 mg des Aldehyd-Harzes 186 in 4 ml THF mit 313 mg (0.654 mmol) 4-Nitrobenzylphosphoniumbromid und 0.3 ml (0.75 mmol) einer 2.5M Lösung von n-Butyllithium in Hexan umgesetzt. Nach Aufarbeitung und Abspaltung wurden 3.7 mg eines bräunlichen Öls erhalten, in welchem das Produkt 179 als Mischung mit BINOL vorlag. O O 179 NO2 3 4 1' 2' 1H NMR, (400.45 MHz, CDCl3): δ = 8.23 (d, 2H, 3J = 8.8 Hz, Carom.-H), 7.47 (d, 2H, 3J = 8.5 Hz, Carom.-H), 6.88 (ddd, 1H, 3J = 9.8, 5.5, 3.0 Hz, 4.-H), 6.81 (d, 1H, 3J = 11.8 Hz, 2’-H), 6.03 (br d, 1H, 3J = 9.9 Hz, 3-H), 6.02 (dd, 1H 3J = 11.6, 9.4 Hz, 1’-H), 5.19 (dt, 1H, 3J = 9.9, 9.8, 4.5 Hz, 6-H), 2.59-2.42 (m, 2H, 5-H). GC-MS (DB_100_S): tR = 6.10 min, m/z (rel. Intens.) 245(12) [M]+, 217(6) [M- CO]+, 152(23), 128(16), 77(30), 68(100). 1,3-Dithian-2-carbaldehyd (174) In einem 250 ml Schlenk-Kolben wurden 5.00 g (41.55 mmol) 1,3-Dithian in 80 ml THF gelöst und auf -60 °C abgekühlt. Dann wurden 20 ml (50 mmol) einer 2.5M Lösung von n-BuLi in Hexan mittels Spritze über einen Zeitraum von 30 min zugegeben. Es wurde weitere 90 min bei -60 °C gerührt. Unterdessen wurde in einem zweiten Kolben eine Lösung von 12.15 g (166.2 mmol) DMF in 40 ml THF auf -30 °C abgekühlt, und das lithiierte Dithian wurde mit einer Transferkanüle zugegeben. Die Lösung nahm über Nacht Raumtemperatur an. Der Ansatz wurde auf 100 ml Eiswasser geschüttet. Nach Phasentrennung wurde die organische Phase mit 3 x 80 ml Pentan extrahiert. Die wässrige Phase wurde mit 35 ml 3M Salzsäure auf 177 Experimenteller Teil pH = 2 gebracht und 3 h bei RT gerührt. Dabei fiel ein Niederschlag aus. Es wurde mit 5 x 30 ml Diethylether extrahiert und die organischen Phasen wurden mit Wasser und NaCl ges. gewaschen. Nach Trocknen über Magnesiumsulfat und Einengen wurden 5.38 g (36.3 mmol, 87 %) eines gelblichen Öls erhalten, das sich als 1:1-Mischung aus Monomer und Dimer von 174 herausstellte. Vor Anwendung wurde die Verbindung deswegen bei 1-2 mbar destilliert. O H S S 174 1' 2 1H NMR (400.45 MHz, CDCl3): δ = 9.44 (d, 1H, 3J = 1.1 Hz, 1’-H), 2.94 (br s, 1H, 2-H), 2.94 (ddd, 2H, 2J = 14.6 Hz, 3J = 12.3, 2.7 Hz, 4-Hax., 6-Hax.), 2.49 (ddd, 2H, 2J = 14.5 Hz, 3J = 4.9, 3.0 Hz, 4-Heq., 6-Heq.), 2.06-1.98 (m, 1H, 5-Heq.), 1.96-1.85 (m, 1H, 5-Hax.). 13C NMR (100.70 MHz, CDCl3): δ = 188.2 (d, C-1’), 47.4 (d, C-2), 25.2 (t, C-4, C-6), 24.7 (t, C-5). Die gemessenen Daten stimmen mit den Lit.-Daten überein.[145] GC-MS (DB_50_S): tR = 5.33 min; m/z(rel Int.) 148(11) [M]+, 119(100), 75(9), 45(28). 178 Experimenteller Teil 5.5 Versuche zu Kapitel 3.2 AAV14: Beladung des Wang-Harzes Das Harz (n g)wurde 20 min in DCM vorgequollen. In 5n ml DMF/DCM 1 : 1 wurden 10 Äq. Fmoc-Glycin (bezogen auf die theoretische Beladung des Harzes) und 0.2 Äq. DMAP gelöst und mit 5 Äq. DIC versetzt. Diese Lösung wurde zum Harz gegeben, und es wurde über Nacht geschüttelt. AAV 15: Abspaltung der N-terminalen Fmoc-Schutzgruppe am Harz Das Harz wurde 5 x mit DCM/DMF 1 : 1 und 2 x mit DMF gespült. Dann wurde 2 x 20 min mit DMF/Piperidin 4 : 1 versetzt. Anschließend wurde zunächst 2 x mit DMF, dann 5 x mit DCM/DMF 1 : 1 gespült. AAV 16: Peptidkupplung Für n g Harz wurden in 5 n ml DMF/DCM 1 . 1 4 Äq. (bezogen auf die Beladung des Harzes) der gewünschten Fmoc-Aminosäure gelöst und mit 3.6 Äq. HBTU und 4 Äq. HOBt·H2O versetzt. Unmittelbar vor Zugabe zum Harz wurden 8 Äq. DIPEA zugegeben. Die Reaktionszeit betrug jeweils 1.5 AAV 17: Abspaltung vom Wang-Harz mit TFA Zur Abspaltung wurde ein Cocktail aus 1890 μl TFA, 50 μl H2O, 50 μl EDT und 20 μl TES („Reagenz K“) hergestellt und zum Harz gegeben. Nach 3 h Reaktionszeit bei Raumtemperatur wurde die TFA-Lösung auf Eppendorf- Gefäße verteilt. Das Peptid wurde durch Zugabe von je 700 μl eiskaltem Diethylether präzipitiert. Nach Zentrifugation wurde der Überstand verworfen und das Pellet mit 500 μl Diethylether gewaschen. Das Harz wurde erneut 2 mal mit 2 ml TFA gewaschen. Aus den Waschfraktionen wurde erneut mit Diethylether das Produkt gefällt. 179 Experimenteller Teil In der Peptidsynthese verwendete Aminosäuren Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc- Arg(Pbf)-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc- Ser(Bn)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-(4-I-Phr)-OH. L-Lysyl-L-threonyl-L-seryl-L-isoleucyl-L-methionyl-L-histidyl-L-arginyl-L- tyrosyl-L-valyl-L-asparagyl-glycin (191) Gemäß der AAV 14-17 wurde das Peptid auf 169.0 mg Wang-Harz (theoretische Beladung: 0.98 mmol/g) synthetisiert. Nach Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe von Lysin wurde das Harz gewaschen (2 x DMF, 2 X DCM, 2 x MeOH) und im Hochvakuum getrocknet. Von den resultierenden 413.3 mg des Harzes wurden 205.0 mg zur Abspaltung nach AAV 17 eingesetzt. Es wurden insgesamt 124 mg (0.09 mmol, 57 % bezogen auf die theoretische Beladung des Harzes) eines weißen Feststoffes gewonnen. [α] : -41.6 ° (c 1.9, H20D 2O) Schmp. 173-175 °C (Zers.) H2N H N N H NH2 O O O H N N H H N N H H N N H H N N H OH O O O O O O O O HO OH S N NH HN NH2HN OH H2N O 191 1H NMR, gCOSY, gHSQC, gHMBC (599.84 MHz, D2O): δ = 8.61 (br s, 1H, Carom. His), 7.15 (d, 2H, 3J = 8.5 Hz, Carom.-H Tyr), 6.83 (d, 2H, 3J = 8.5 Hz, Carom.-H Tyr), 4.76-4.70 (m, 1H, Cα-H Asn), 4.65-4.62 (m, 2H, Cα-H Arg, Cα- H), 4.51 (t, 1H, 3J = 5.9 Hz, Cα-H Ser), 4.44 (d, 1H, 3J = 5.6 Hz, Cα-H Thr), 4.41 (dd, 1H, 3J = 8.6, 5.9 Hz, Cα-H), 4.35 (dd, 1H, 3J = 9.4, 5.2 Hz, Cα-H 180 Experimenteller Teil Leu), 4.29 (dd, 1H, 3J = 8.0, 6.4 Hz, Cα-H), 4.20-4.15 (m, 1H, Cβ-H Thr), 4.14 (t, 1H, 3J = 6.6 Hz, Cα-H Met), 4.10 (d, 1H, 3J = 7.5 Hz, Cα-H Val), 4.00-3.99 (m, 2H, Cα-H Gly), 3.89-3.83 (m, 2H, Cβ-H Ser), 3.19-2.92 (m, 7H, Cβ-H His, Cβ-H Tyr, Cδ-H Arg, Cε-H Lys), 2.87-2.81, 2.75-2.71 (2 x m, 2H, Cβ-H Asn), 2.59-2.54, 2.51-2.46 (2 x m, 2H, Cγ-H Met), 2.09 (s, 3H, Cδ-H Met), 2.06-1.90 (m, 5H), 1.73-1.47 (m, 11H), 1.24 (d, 3H, 3J = 7.5 Hz, Cγ-H Thr), 0.94-0.87 (m, 12 H, Cγ-H Val, Cδ-H Leu). LC-MS (C18grav_split4pos): tR = 6.01 min. ESI-MS: ber. für C56H93N18O16S [M+H]+: 11305.6738 gef. 1305.70. MALDI TOF (DHB): m/z 1305.71 L-(4-Iodphenylalanyl)-L-lysyl-L-threonyl-L-seryl-L-isoleucyl-L-methionyl- L-histidyl-L-arginyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-asparagyl-glycin (192) Das harzgebundene, vollständig geschützte Peptid 191 (206 mg Harz, ca. 0.09 mmol) wurde gemäß AAV 16 mit Fmoc-para-Iod-phenylalanin (Fmoc-I- Phe) umgesetzt. Nach Abspaltung der terminalen Fmoc-Gruppe wurde das Harz gewaschen (2 x DMF, 2 X DCM, 2 x MeOH) und im Hochvakuum getrocknet. Nach AAV 17 wurde vom Wang-Harz abgespalten. Es wurden 91 mg (0.06 mmol, 66%) eines weißen Feststoffes erhalten. [α] : +30.0 ° (c 1.33, H20D 2O) Schmp. 187-189 °C (Zers.) 181 Experimenteller Teil N H H N N H NH2 O O O H N N H H N N H H N N H H N N H OH O O O O O O O O HO OH S N NH HN NH2HN OH H2N O H2N O I 192 1H NMR, gCOSY, gHSQC, gHMBC (599.84 MHz, D2O): δ = 8.62 (br s, 1H, Carom.-H His), 7.75 (d, 2H, 3J = 8.2 Hz, Carom.-H I-Phe), 7.17 (s, 1H, Carom.-H His), 7.15 (d, 2H, 3J = 8.3 Hz, Carom.-H Tyr), 7.05 (d, 2H, 3J = 8.2 Hz, Carom.-H I-Phe), 6.83 (d, 2H, 3J = 8.5 Hz, Carom.-H Tyr), 4.74 (t, 1H, 3J = 5.4 Hz, Cα-H Asn), 4.66-4.63 (m, 2H, Cα-H Tyr, Cα-H), 4.48 (t, 1H, 3J = 5.4 Hz, Cα-H Ser), 4.44 (dd, 1H, 3J = 7.9, 6.4 Hz, Cα-H), 4.41 (dd, 1H, 3J = 8.7, 5.8 Hz, Cα-H), 4.36 (d, 1H, 3J = 4.7 Hz, Cα-H Thr), 4.34-4.31 (m, 1H, Cα-H), 4.28 (t, 1H, 3J = 7.2 Hz, Cα-H I-Phe), 4.25 (dd, 1H, 3J = 6.4 5.0 Hz, Cβ-H Thr), 4.10 (t, 3J = 7.0 Hz, Cα-H Val), 4.02-4.01 (m, 2H, Cα-H Gly), 3.92 (dd, 1H, 2J = 11.5 Hz, 3J = 5.5 Hz, Cβ-Ha Ser), 3.86 (dd, 1H, 2J = 11.5 Hz, 3J = 5.3 Hz, Cβ-Hb Ser), 3.31-3.05 (m, 7H, Cβ-H I-Phe, Cβ-H His, Cβ-Ha Tyr, Cδ-H Arg), 2.99 (t, 2H, 3J = 7.5 Hz, Cε-H Lys), 2.97-2.92 (m, 1H, Cβ-Hb Tyr), 2.88-2.81, 2.76-2.72 (2 x m, 2H, Cβ-H Asn), 2.600-2.56, 2.52-2.47 (2 x m, 2H, Cγ-H Met), 2.10 (s, 3H, Cδ-H Met), 2.05-1.96 (m, 3H, Cβ-H Val, Cβ-H Met), 1.84-1.33 (m, 15H), 1.28 (d, 3H, 3J = 6.4 Hz, Cγ-H Thr), 0.94-0.88 (m, 12H, Cγ-H Val, Cδ-H Leu). LC-MS (C18grav_split4pos): tR = 5.31 min. ESI-MS: ber. für C65H101N19O17SI [M+H]+: 1578.6388 gef. 1578.62. d-Desthiobiotin-propargylamid (194) In einem Schlenk-Kolben wurden 97.22 mg (0.45 mmol) d-Desthiobiotin in 4.5 ml DMF gelöst und mit 176 mg (1.36 mmol) DIPEA, 345.7 mg (0.91 mmol) 182 Experimenteller Teil HBTU und 100 mg (1.81 mmol) Propargylamin versetzt. Es wurde 16 h bei RT gerührt und anschließend das Lösungsmittel am Hochvakuum entfernt. Der Rückstand wurde in DCM aufgenommen und mit 3 x 5 ml ges. NH4Cl-Lösung extrahiert. Die wässrige Phase wurde mit DCM rückextrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über MgSO4 getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt (166 mg) wurde blitzchromatographisch aufgereinigt (KG, 25 x 1 cm, DCM/MeOH 95 : 5 (v/v) + 0.1 % Net3), woraufhin ein bräunliches Öl erhalten wurde, das in Ethylacetat umkristallisiert wurde. Es wurden 55.0 mg (0.22 mmol, 48 %) farbloser kristalliner Plättchen gewonnen. HN NH N H O O 194 1 2 4'5'1''' 1'' Rf = 0.08 in Aceton/Dichlormethan 7 : 3. Schmp. 109-110 °C [α] : +18.6 ° (c 0.73, CHCl20D 3) 1H NMR, gCOSY, gHSQC, gHMBC (400.45 MHz, CDCl3): δ = 6.32 (br s, 1H, 1-NH), 5.66 (br s, 1H, 1’-H oder 3’-H), 4.79 (br s, 1H, 1’-H oder 3’-H), 4.05 (d, 1H, 2J = 5.3 Hz, 1’’’-Ha), 4.04 (d, 1H, 2J = 5.3 Hz, 1’’’-Hb), 3.84 (dq, 3J = 7.0, 6.5 Hz, 5’-H), 3.73-3.68 (m, 1H, 4’-H), 2.23-2.16 (m, 2H, 2-H), 1.71-1.64 (m, 2H, 3-H), 1.50-1.25 (m, 6H, 4-H, 5-H, 6-H), 1.12 (d, 3H, 3J = 6.5 Hz, 1’’-H). 13C NMR (100.70 MHz, CDCl3): δ = 172.6 (s, C-1), 163.7 (s, C-2’), 80.0 (s, C- 2’’’), 71.3 (d, C-3’’’), 56.0 (d, C-4’), 51.4 (d, C-5’), 35.6 (t, C-2), 29.4 (d, C-6), 29.0 (t, C-1’’’), 28.4 (t, C-4), 25.7 (t, C-5), 25.0 (t, C-3), 15.8 (q, C-1’’). LC-MS (C18grav_split4pos): tR = 7.01 min, m/z 252.2 [M+H]+. MS (FAB) m/z 252.1 [M+H]+ HR-MS (FAB) ber. für C13H22N3O2 252.1712 [M+H]+, gef. 252.1734. 183 Experimenteller Teil d-Desthiobiotin-(4-ethinylphenyl)amid (195) In einem Schlenk-Kolben wurden 50.8 mg (0.23 mmol) d-Desthiobiotin in 3 ml DMF gelöst und mit 54.2 mg (0.28 mmol) EDC-Hydrochlorid und 36.4 mg (0.30 mmol) DMAP versetzt und 20 min bei Raumtemperatur gerührt. Sodann wurden 61.6 mg (0.526 mg) 4-Ethinylanilin zugegeben, und es wurde 5 h bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Hochvakuum entfernt, der Rückstand wurde mit 5 ml DCM aufgenommen und mit ges. NH4Cl- Lösung gewaschen. Die wässrige Phase wurde 4 x mit DCM extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über MgSO4 getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt (133 mg) wurde auf Celite aufgezogen und säulenchromatographisch gereinigt (KG, 10 g, 9 x 2 cm, DCM/ MeOH 95 : 5). Es wurden 61.6 mg (0.197 mmol, 83 %) eines weißen Feststoffes erhalten. HN NH N H O O 1 2 4'5'1''' 1'' 195 1'''' Schmp. 176-177 °C Rf = 0.42 in DCM/MeOH 9 : 1. [α] : +4.7 ° (c 1.03, H20D 2O/MeCN 1 : 1) 1H NMR, gCOSY, gHSQC, gHMBC (400.45 MHz, CDCl3): δ = 7.84 (br s, 1H, 1-NH), 7.53-7.50 (m, 2H, Carom.-H), 7.44-7.42 (m, 2H, Carom.-H), 3.91 (dq, 3J = 7.8, 6.5 Hz, 5’-H), 3.78-3.72 (m, 1H, 4’-H), 3.03 (s, 1H, 2’’’’-H), 2.37 (t, 2H, 3J = 7.3, 2-H), 1.78-1.71 (m, 2H, 3-H), 1.54-1.26 (m, 6H, 4-H, 5-H, 6-H), 1.14 (d, 3H, 3J = 6.5 Hz, 1’’-H). 13C NMR (100.70 MHz, CDCl3): δ = 174.7 (s, C-1), 164.2 (s, C-2’), 138.6 (s, C-1’’’), 132.9 (s, C-2’’’ oder C-3’’’), 119.3 (s, C-2’’’ oder C-3’’’), 117.6 (s, C-4’’’), 83.4 (s, C-1’’’’), 56.4 (d, C-4’), 51.8 (d, C-5’), 36.9 (t, C-2), 29.3 (d, C-6), 28.5 (t, C-4), 25.7 (t, C-5), 25.0 (t, C-3), 15.6 (q, C-1’’). LC-MS (C18grav_split4pos): tR = 8.39 min, m/z 314.17 [M+H]+. 184 Experimenteller Teil MS (FAB) m/z 314.3 [M+H]+ HR-MS (FAB) ber. für C18H24N3O2 314.1869 [M+H]+, gef. 314.1892. Sonogashira-Reaktion am Peptid 192 In einem typischen Experiment wurden 1 mg (0.63 μmmol) des Peptids 192 in 300 μl Na2HPO4-Puffer (50-100 mM, pH 7.5) gelöst und mit 1.5 Äq. des jeweiligen Acetylens versetzt. Zu dieser Lösung wurde zunächst die jeweilige Menge einer 1 mM Lösung von Kupfer(I)iodid in MeCN gegeben, woraufhin sich eine klare Lösung bildete. Die Reaktion wurde durch Zugabe der jeweiligen Menge einer 2 mM Lösung von Tetrakis- (triphenylphosphinotrisulfonsäure)palladium in H2O gestartet. Es wurde 16 h unter Argon bei Raumtemperatur gerührt. Zur Bestimmung des Umsatzes wurde die Reaktionslösung mit LC-MS untersucht (Säule C18 Nautilus, Gradient H2O/MeCN 100 : 0, 2 min, dann auf 100 % MeCN in 25 min). Die Produkte wurden nicht isoliert, Ausbeuten wurden keine bestimmt. Peptid + Phenylacetylen 196a LC-MS (ESI): ber. für C73H106N19O17S 1552.773 [M+H]+ gef. 1552.7 MALDI-TOF: ber. für C73H106N19O17S 1552.773 [M+H]+ gef. 1552.831 Peptid + Anilinderivat 196c LC-MS (ESI): ber. für C83H123N22O19S 1763.905 [M+H]+ gef. 1764.7 MALDI-TOF: ber. für C83H123N22O19S 1763.905 [M+H]+ gef. 1764.359 185 Experimenteller Teil Fmoc-γ-(4-iodbenzoyl)-(L)-lysin 197 para-Iodbenzoesäure (355.1 mg, 1.43 mmol) wurde unter Argon in 7 ml trockenem DMF gelöst und mit HOSu (165.4 mg, 1.44 mmol) und DCC (306.5 mg, 1.49 mmol) versetzt. Nach 20 min zeigte eine Trübung die vollständige Aktivierung der Säure an. Daraufhin wurden (L)-Fmoc-Lysin (350.9 mg, 0.95 mmol) und DIPEA (484 μl, 370 mg, 2.9 mmol) zugegeben und bei Raumtemperatur gerührt. Nach 36 h wurde das Lösungsmittel am Vakuum entfernt, und das Rohprodukt wurde blitzchromatographisch gereinigt (1. Säule KG, 24 g, 17.5 x 2.5 cm, DCM + 1 % HCOOH auf DCM/MeOH 98 : 2 (v/v)+ 1 % HCOOH, 2. Säule KG, 20 x 2.5 cm, DCM/tert.-butylalkohol (v/v) 98 : 2 + 1 % HCOOH auf DCM/tert.-butylalkohol (v/v) 95 : 5 + 1 % HCOOH). Auf diese Weise konnten 205.7 mg (0.34 mmol, 36 %) eines weißen Feststoffes gewonnen werden. Rf = 0.33 in DCM/tert.-butylalkohol 95 : 5 (v/v). Schmp. 132-134 °C. [α] : +1.1 ° (c 1.5, MeOH). 20D H N COOH HN O O O I 197 1 6 1' 10'' 9'' 1'' 1''' 1'''' 1H NMR, gCOSY (400.45 MHz, MeOD): δ = 7.78-7.75 (m, 4H, Fmoc-H), 7.66- 7.62 (m, 2H, 2’-H oder 3’-H), 7.55 (d, 2H, 3J = 7.5 Hz, Fmoc-H), 7.39-7.35 (m, 2H, Fmoc-H), 7.29-7.25 (m, 2H, 2’-H oder 3’-H), 4.50 (d, 2H, 3J = 7.0 Hz, 10’’- H), 4.38 (d, 1H, 3J = 6.9 Hz, 9’’-H), 4.38-4.32 (m, 1H, 2-H), 3.58-3.54 (m, 2H, 6-H), 2.13-2.04 (m, 1H, 3-Ha), 1.77-1.69 (m, 1H, 3-Hb), 1.68-1.43 (m, 4H, 4-H, 5-H). 186 Experimenteller Teil 13C NMR (100.71 MHz, MeOD): δ = 176.0 (s, C-1), 169.4 (s, C-1’’’), 158.7 (s, C-1’’’’), 142.6 (s, C-4a’’), 138.8 (d, C-3’), 135.3 (s, C-1’), 130.0 (d, C-2’), 128.8 (d, C-2’’), 128.2 (d, C-4’’), 121.0 (d, C-1’’),99.0 (s, C-4’), 68.0 (t, C-10’’), 55.2 (d, C-2), 40.8 (t, C-6), 32.5 (t, C-3 oder C-5), 30.0 (t, C-3 oder C-5), 24.4 (t, C- 4). MS (FAB) m/z 599.1 [M+H]+ HR-MS (FAB) ber. für C28H28N2O5I 599.1043 [M+H]+, gef. 599.1100. Maleinimidocaproyl-L-seryl-N(ε)-(4-iodbenzoyl)-L-lysyl-L-seryl-glycin (188) Das Peptid 188 wurde auf Wang-Harz synthetisiert. Dazu wurden 68.3 mg (0.082 mmol) Wang-Harz (Beladung 1.2 mmol/g) nach AAV 14 mit Fmoc- Gly-OH beladen, und die folgenden Fmoc-Abspaltungen und Peptid- Kupplungen wurden nach AAV 15 und AAV 16 mit den Aminosäuren Fmoc- Ser(Otert.-Bu)-OH und 197 durchgeführt. Abweichend vom Standard-Protokoll wurde die Reaktionszeit für 6-Maleimidocaproylsäure auf 3 h verdoppelt. Vor der Abspaltung wurde das Harz mit 2 x DMF, 7 x DCM und 2 x MeOH gewaschen und am Hochvakuum getrocknet. Die Abspaltung vom Harz (136.4 mg) nach AAV 17 wurde mit einer Lösung aus 50 μl H2O und 50 μl TES in 1900 μl TFA durchgeführt. Das Peptid wurde mit Diethylether präzipitiert. Auf diese Weise wurden 60.7 mg (0.076 mmol, 93 %) eines weißen Feststoffes gewonnen. Schmp. 173-175 °C (Zers.) 187 Experimenteller Teil N N H H N N H H N OH O O O OH O HN O OH O O I O 188 1H NMR, gCOSY, TOCSY (400.45 MHz, d6-DMSO): δ = 8.47 (t, 1H, 3J = 5.5 Hz, Nε-H Los), 7.99 (d, 1H, 3J = 7.9 Hz, Nα-H Lys), 7.96 (d, 1H, 3J = 6.0 Hz, N-H Gly), 7.88 (d, 1H, 3J = 7.7 Hz, N-H Ser), 7.86 (d, 1H, 3J = 7.0 Hz, N-H Ser), 7.83 (d, 2H, 3J = 8.5 Hz, Carom.-H), 7.61 (d, 2H, 3J = 8.5 Hz, Carom.-H), 6.99 (s, 2H, MIC-H), 4.35-4.24 (m, 3H, Cα-H Lys, 2 x Cα-H Ser), 3.75 (d, 2H, 3J = 5.7 Hz, Cα-H Gly), 3.59-3.51 (m, 4H, Cβ-H Ser), 3.37 (t, 2H, 3J = 7.1 Hz, Cε-H MIC), 3.23-3.19 (m, 2H, Cε-H Lys), 2.11 (t, 3J = 7.4 Hz, Cα-H MIC), 1.79-1.70 (m, 1H, Cβ-Ha Lys), 1.61-1.48 (m, 11H, Cβ- Hb Lys, Cγ-H Lys, Cδ-H Lys Cβ-H MIC, Cγ-H MIC, Cδ-H MIC). LC-MS (C18grav_split4pos): tR = 7.91 min. ESI-MS: ber. für C31H42N6O11 [M+H]+: 801.1956. gef. 801.04. Maleinimidocaproyl-L-seryl-N(ε)-(4-(4-((4-(6-((4R,5S)-5-methyl-2- oxoimidazolidin-4-yl)hexanamido)phenyl)ethinyl)benzamidyl))-L-lysyl-L- seryl-glycin (198) In einem 10 ml Schlenk-Rohr wurde das Peptid 188 (8.1 mg, 10 μmol) vorgelegt und mit einer Lösung von 5 mg (16 μmol, 1.6 Äq.) des Acetylens 195 in H2O (1 ml) versetzt. Nach Zugabe von Phosphatpuffer (pH 7.5, 250 μl), CuI (50mM in Acetonitril, 20 μl, 1μmol) und Pd(TPPTS)4 (10 mM in H2O, 188 Experimenteller Teil 100 μl, 1 μmol) wurde 30 min bei Raumtemperatur gerührt, woraufhin die Lösung eine leichte Trübung annahm. Zur Aufreinigung des Reaktionsproduktes wurde zunächst mit 700 μl H2O verdünnt und dann durch eine C18-Kartusche eluiert (H2O/Acetonitril 55/45). Die so erhaltenen Fraktionen wurden am Vakuum eingeengt und über Nacht lyophilisiert. Mittels präparativer HPLC (C18-Säule), konnten 8.5 mg (8.6 μmol, 85 %) des Produktes 198 als gelblicher Film isoliert werden. N N H H N N H H N OH O O O OH O HN O OH O O HN NH N H O O O 198 1H NMR, gCOSY, TOCSY (400.45 MHz, d6-DMSO): δ = 10.07 (s, 1H, N-H), 8.59 (t, 1H, 3J = 5.6 Hz, Nε-H Lys), 8.05 (d, 1H, 3J = 7.9 Hz, Nα-H Lys), 7.95- 7.87 (m, 3H, 3 x N-H), 7.88 (d, 2H, 3J = 8.6 Hz, Carom.-H), 7.73-7.69 (m, 2H, 2 x N-H), 7.62 (d, 2H, 3J = 7.6 Hz, Carom.-H), 7.58 (d, 2H, 3J = 8.6 Hz, Carom.-H), 7.50 (d, 2H, 3J = 8.6 Hz, Carom.-H), 6.98 (s, 2H, MIC-H), 4.35 (dd, 3J = 13.4, 5.8 Hz, 1 x Cα-H Ser), 4.31-4.22 (m, 1H, 1 x Cα-H Ser), 4.14 (dd, 3J = 5.7, 3.2 Hz, Cα-H Lys), 3.67-3.20 (m, 12H, Cε-H MIC, Cα-H Gly, Cβ-H Ser, Cε-H Lys, 4’-H, 5’-H), 2.32 (t, 2H, 3J = 6.9 Hz, 2-H), 2.11 (t, 2H, 3J = 7.4 Hz, Cα-H MIC), 1.81-1.72 (m, 1H, Cβ-Ha Lys), 1.65-1.17 (m, 19H), 0.96 (d, 3H, 3J = 6.5 Hz, 1’’-H). LC-MS (C18grav_split4pos): tR = 7.42 min. ESI-MS: ber. für C49H64N9O13 [M+H]+: 986.4624. gef. 986.4. 189 Experimenteller Teil Ligation von MIC-Peptiden an 1-181N-Ras Die Peptide 188 oder 198 wurden als Lösungen in Wasser/Acetonitril (20- 40 mM, max. 10 % Acetonitril) eingesetzt. Das N-Ras-Protein lag als 25- 50 mg/ml Lösung in einem Puffer (50 mM TRIS pH 7.0, 0.1 mM MgCl2, 1 M NaCl, 2 M GDP) vor. In einem typischen Ansatz wurden 5- 10 mg (~0.4 μmol) Protein und 1.5-2 Äq. des jeweiligen Peptids eingesetzt. Bei Auftreten eines Niederschlags wurde dieser mit bis zu 2 vol% Trition X-100 gelöst. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde zentrifugiert (1 min 13000 rpm), um ausgefallenes Protein und Peptid zu beseitigen. Das Rohprodukt der Ligation wurde auf eine Niederdruck-DEAE- Gelfiltrationssäule (FPLC-System) aufgetragen und mit 20 mM TRIS/HCl pH 7.4, 5 mM MgCl2 in einem linearen Gradienten eluiert. Die so erhaltenen Protein-Fraktionen wurden schließlich auf eine Konzentration von 20-40 g/l gebracht. Sonogashira-Reaktion an Ypt7Δ7Cys-iodo oder 1-181N-Ras-MIC-iodo In einem typischen Experiment wurden 0.15-0.2 μmol (ca. 3-4 mg) des jeweiligen Proteins, gelöst in H2O (YPT7) oder TRIS-Puffer pH 7.6) mit 20 Äq. des Acetylens 195 (ca. 1.1 mg, 3.5 μmol) versetzt. Zu dieser Lösung wurden 30-90 μl Na2HPO4-Puffer pH 7.5 pipettiert. Anschließend wurden 10 Äq. (ca. 87 μl) einer 10 mM Lösung von Pd(TPPTS)4 in H2O und 10 Äq. (18 μl) einer 50 mM Lösung von Kupfer(I)iodid in MeCN gegeben. Es wurde mit Argon überschichtet und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Aufreinigung des Proteins 200 an Streptactin-Beads Zur Detektion der Desthiobiotin-markierten Proteine wurden 100 μl der Streptactin-Beads (IBA GmbH, Göttingen) 5 min abzentrifugiert und 3 x in Puffer W (100 mM Tris/HCl pH 7.6, 1 mM EDTA, 2 mM DTT) gewaschen. Das Pellet wurde in 50 μl Puffer resuspendiert und mit 10 μl der Proteinlösung versetzt. Es wurde über Nacht bei 4 C inkubiert. Dann wurde zentrifugiert, und 190 Experimenteller Teil das Pellet mit 100 μl Puffer W aufgenommen. Diese Waschprozedur wurde dreimal durchgeführt. Zur Elution der gebundenen Anteile wurde das abzentrifugierte Pellet mit Puffer R (Puffer W mit 1 mM 2-(4-Hydroxyphenylazo)benzoesäure) aufgenommen. Dieser Schritt wurde dreimal durchgeführt. Die auf diese Weise erhaltenen Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE und Western-Blot analysiert. 191 Experimenteller Teil 192 6 Literaturverzeichnis [1.] D. J. Newman, G. M. Cragg, K. M. Snader, J. Nat. Prod. 2003, 66, 1022-1037. [2.] F. E. Koehn, G. T. Carter, Nature Rev. Drug Discovery 2005, 4, 206- 220. [3.] M. Feher, J. M. Schmidt, Journal of Chemical Information and Computer Sciences 2003, 43, 218-227. [4.] R. Breinbauer, I. R. Vetter, H. Waldmann, Angew. Chem. Int. Ed. 2002, 41, 2879-2890. [5.] A. G. Murzin, S. E. 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Allen, die zum Erfolg dieser Projekte beigetragen haben, sei ebenfalls gedankt: Anja Watzke, Thomas Durek, Christine Nowak, Dr. Ana B. García, Dr. Jayant D. Umayre. Ein herzlicher Dank gilt allen Mitarbeitern am Max-Planck-Institut für Molekulare Physiologie und an der Universität Dortmund, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben. Hervorzuheben sind hier Dr. Petra Janning für Hilfe in allen analytischen Fragestellungen, Sandra Hippler und Christiane Heitbrink für die Aufnahme von Massenspektren sowie Heike Rimpel für die Durchführung der Phosphatase-Assays. Dr. N. Jakubowski und I. Feldmann am ISAS Dortmund sei für die LA-ICP-MS Messungen gedankt. Allen Mitarbeitern in der Abteilung Chemische Biologie am Max-Planck- Institut Dortmund möchte ich für die freundschaftlich-kollegiale Arbeits- atmosphäre danken. Dies gilt insbesondere für meine Laborkolleginnen Elke Simon, Stefanie Schlummer, Svenja Röttger, Karoline Obstoj, Tanja Knoth und Dr. Ester Vaz Araujo. Im großen Kommen und Gehen waren mir besonders Matthias Riedrich, Catherine Katzka, Nicola Bisek, Olaf Köhler, Sebastian Koch und Lars Arve wichtige Freunde, denen ich für bleibende Erinnerungen an gemeinsame Unternehmungen in Dortmund dankbar bin. Für das zügige Korrigieren dieser Arbeit geht ein herzlicher Dank an Matthias Riedrich, Nicola Bisek und Lars Arve. Ich danke ganz besonders meinen Eltern für die fortwährende Unterstützung während all der Jahre der Promotion und des Studiums. Schließlich danke ich von ganzem Herzen Verena für ihre unendliche Geduld und liebevolle Unterstützung während der Anfertigung dieser Arbeit. 202 Anhang Lebenslauf Persönliche Daten Name Torben Leßmann Geburtsdatum und -ort 28. April 1976 in Hamburg Familienstand ledig Schulbildung 08/1982-07/1992 Albert-Schweitzer-Schule, Hamburg 08/1992-07/1995 Albert-Schweitzer-Gymnasium, Hamburg 21.06.1995 Abitur Zivildienst 08/1995-09/1996 Winterhuder Werkstätten für Behinderte, Hamburg Universitätsausbildung 10/1996-09/1998 Grundstudium Chemie, Eberhard Karls Universität Tübingen 10/1998-09/2002 Hauptstudium Chemie, Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg 10/1999-03/2000 Erasmus-Semester, Universitá degli studi di Padova, Italien 12/2001-8/2002 Diplomarbeit im Arbeitskreis von Prof. Dr. G. Helmchen: Versuche zur Synthese neuer chiraler Liganden mit Phosphinit- oder Phosphonit-Donor- Zentren. 19.08.2002 Diplom in Chemie 12/2002-12/2006 Promotion im Arbeitskreis von Prof. Dr. H. Waldmann am Max-Planck-Institut für Molekulare Physiologie, Dortmund: Stereoselektive Synthese von α,β-ungesättigten δ-Laktonen an der festen Phase und Protein-Modifikationen durch Palladium- Katalyse. Dortmund, Dezember 2006. 203 Anhang Eidestattliche Erklärung Hiermit versichere ich an Eides statt, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig und nur mit den angegebenen Hilfsmitteln angefertigt habe. Dortmund, 13.12.2006 Torben Leßmann 204