\chapter{Einleitung}
Die Naturwissenschaften, welche sich mit dem Leben befassen, haben in den letzten Jahrzehnten einen raschen Fortschritt erlebt. Seit der Entdeckung der DNS-Doppelhelixstruktur \cite{Watson1953} und der ersten Strukturbestimmung von Lysozym mittels Röntgenbeugung \cite{Phillips1966}, konnte der Brückenschlag von der klassischen Biologie zur Chemie und Physik geschlagen und Lebensprozesse bis auf das molekulare Niveau geklärt werden. Seitdem besteht ein zunehmendes Interesse, Vorgänge in der belebten Natur auf molekularem Niveau und die ihnen zugrunde liegenden physikalisch-chemischen Eigenschaften zu verstehen. In diesem Zuge wurden und werden spektroskopische Methoden auf biologische Systeme und Biomoleküle angewandt, um Informationen auf molekularer oder gar atomarer Ebene zu erhalten. Die Komplexität biologischer Systeme erschwert deren detaillierte Analysen, doch lassen sich z.B. mittels FT-IR- oder CD-Spektroskopie die Anteile von Sekundärstrukturen, mittels Röntgenbeugung und NMR-Spektroskopie sogar komplette dreidimensionale Strukturen von Proteinen ermitteln.

Eine besondere Beachtung muss hierbei das Medium Wasser erfahren: alle wichtigen Lebensvorgänge finden in diesem Lösungsmittel statt und viele Prozesse lassen sich erst begreifen, wenn man sie im Licht der Wechselwirkung zwischen Solvens und Solvendum betrachtet. Daher setzt ein tieferes Verständnis von Lebensprozessen auch eine Betrachtung der - bei biologischen Systemen zumeist  wässrigen - Umgebung der Moleküle voraus. Die Wechselwirkung von Wasser und Cosolventien mit polaren, apolaren und aromatischen Molekülgruppen ist ein wesentlicher Faktor, der zum Zustandekommen der nativen Faltung, aber auch Fehlfaltung und Aggregation, der Proteine beiträgt.

Diese Arbeit widmet sich der Untersuchung der Kältedenaturierung von Proteinen mittels NMR-Spektroskopie. Als Modellsysteme werden hierbei das globuläre Protein Lysozym aus Hühnereiweiß (HEL) und das elastin-mimetische Polypeptid GVG(VPGVG)$_\km{3}$ herangezogen. Lysozym ist ein weitverbreitetes, kommerziell in großen Mengen erhältliches Protein, dessen Kristall- und Lösungsstruktur bekannt ist, dessen NMR-Spektrum weitestgehend geklärt und zugeordnet ist \cite{Redfield1988} und welches sich daher sehr gut als Modellsystem eignet. Bei dem Octadekamer GVG(VPGVG)$_\km{3}$ handelt es sich um ein oktadekameres Polypeptid, welches einen temperaturabhängigen Konformationswechsel durchläuft. Aufgrund seiner einfachen Zusammensetzung eignet es sich sehr gut für detaillierte NMR-spektroskopische Untersuchungen, mit denen es möglich ist, Informationen auf atomar-molekularem Niveau zu erhalten.

Im Gegensatz zur Hitzdenaturierung, welche im Wesentlichen durch die Konfigurationsentropie $\Delta S_{\km{conf.}}$ getrieben wird, ist bei der Kältedenaturierung die Änderung der Hydratisierungsenthalpie $\Delta H_{\km{hydr.}}$ der treibende Motor. Eine Beobachtung dieser Entfaltungsform bei tiefen Temperaturen erlaubt daher einen Rückschluss auf Hydratisierungsphänomene. Die Hydratisierung von Proteinen wird weiterhin durch die Anwesenheit von Cosolventien beeinflusst, weshalb die Zugabe kosmo- bzw. chaotroper Zusätze ein weiteres Mittel darstellt, Einfluss auf die Hydratation zu nehmen. Dies ist inbesondere von Bedeutung, da Proteine in zellulärer Umgebung von einem kopmplexen Lösungsmittelgemisch umgeben sind. Im Speziellen sollen in dieser Arbeit die Kältedenaturierung von Lysozym und der Einfluss kosmotroper (Sorbitol) bzw. chaotroper (Harnstoff) Zusätze auf diese Art der Entfaltung untersucht werden. Wie bei den meisten Proteinen befindet sich die betreffende Übergangstemperatur des Lysozyms unterhalb des Gefrierpunktes von Wasser. Daher muss unter Hochdruckbedingungen, unter denen das Wasser bis ca. -20 °C nicht gefriert, gearbeitet werden. Als Methode wird die sog. Protonen-Austausch-NMR im Deuteriumoxid-Puffer,  d.h. die Beobachtung des Austauschverhaltens labiler Protonen gegen Deuteronen mittels $^\km{1}$H-NMR, verwendet. Hierbei werden strukturelle Informationen aus der Substitutionsgeschwindigkeit, mit der ein gegebenes Amidproton des Proteins durch ein Deuteron des Lösungsmittels ausgetauscht wird, gewonnen. Diese Methode bietet den Vorteil, dass die Inkubation der Proben unter den relativ harschen Tieftemperatur- und Hochdruckbedingungen räumlich und zeitlich von den NMR-Messungen getrennt ist: Zunächst erfolgt die Inkubation der Proben unter kältedenaturierenden Bedingungen, und erst danach, nach erfolgtem Protonen-Austausch, die NMR-Messung. Auf diese Art und Weise können strukturelle Informationen über einen stabilen, teilentfalteten Zustand erhalten und der Einfluss von Cosolventien bzw. Hydratationsphänomene auf diese Struktur untersucht werden.

Eine weitere Möglichkeit, das Phänomen der Kältedenaturierung zu untersuchen, bieten die sog. elastin-mimetischen Peptide, deren Sequenz einem repetitiven Motiv (hier: VPGVG) aus dem Protein Elastin nachempfunden ist, und die wie dieses Strukturprotein mit steigender Temperatur bei Temperaturen oberhalb des Gefrierpunktes einen konformellen Übergang zu einer gefalteten Struktur vollziehen. Umgekehrt vollziehen sie also, genau wie bei der Kältedenaturierung von Proteinen, eine Entfaltung mit sinkenden Temperaturen. Dabei sind diese mimetischen Peptide im Vergleich zu Proteinen sehr klein und einfach aufgebaut, was sie zu einem sehr guten physikalisch-chemischen Modellsystem macht, an dem auch NMR-Messmethoden eingesetzt werden können, welche an den wesentlich größeren und komplexeren natürlichen Proteinen nicht bzw. nicht ohne größeren Aufwand bewerkstelligt werden können. So soll die temperaturabhängige Konformationsänderung des elastin-mimetischen Octadekamers GVG(VPGVG)$_\km{3}$  mittels $^{\km{13}}$C-NMR verfolgt werden. Nicht nur die relativ einfache Zusammensetzung dieses Moleküls, sondern auch der Temperaturbereich des Übergangs im messtechnisch günstigen Bereich oberhalb von 0 °C ermöglichen hier eine sehr genaue Untersuchung. Insbesondere sollen hier auch die longitudinalen Relaxationsraten $T_\km{1}$ bestimmt werden, um Informationen über die Dynamik innerhalb des Moleküls zu erhalten. Mithilfe dieser Daten sollte es möglich sein, ein Bild des strukturellen Übergangs des Peptids auf molekularem Niveau zu gewinnen.


\chapter{Proteine}
\section{Strukturelemente}\label{strukturelemente}
Die Bezeichnung {\glqq Protein\grqq} wurde vom schwedischen Chemiker Jöns Jacob Berzelius geprägt und entstammt dem griechischen Wort {\glqq \emph{protos}\grqq}, was übersetzt {\glqq der Erste\grqq} bedeutet. Diese Namensgebung ist, obwohl schon vor über 150 Jahren getätigt, sehr treffend gewählt: Proteine sind an allen essentiellen Lebensprozessen beteiligt. In Form von Enzymen katalysieren sie Reaktionen, als Hämoglobin oder Albumin transportieren sie Stoffe, Keratin und Kollagen z.B. sind Bestandteile von Geweben, als Immunglobuline dienen sie der Immunabwehr, und in Form von z.B. Vasopressin oder Gonadotropin fungieren sie als Hormone, die Prozesse steuern und regulieren. Selbst wenn die Speicherung der Erbinformationen eine Hegemonie der Nukleinsäuren ist, so sind an der Realisierung und Weitergabe dieser Informationen Proteine, wie z.B. die DNA- oder RNA-Polymerase, beteiligt. Die Rolle der Proteine innerhalb der Chemie des Lebens kann daher kaum überschätzt werden.

Aus chemischer Sicht handelt es sich bei Proteine um lineare Heteropolymere, als deren Monomere die zwanzig sog. proteinogenen Aminosäuren fungieren. Die biologischen und physikalisch-chemischen Eigenschaften dieser Biopolymere werden hierbei allerdings nicht nur aus der Reihenfolge und Menge der einzelnen Aminosäuren bestimmt, sondern hängen stark davon ab, wie sich das Polymer faltet, d.h., welche dreidimensionale Struktur es einnimmt. Die Zusammenhänge und Faktoren, die die dreidimensionale Struktur von Proteinen bestimmen, sind daher ein Fokus in der derzeitigen Forschung.
\begin{figure}[t]
\begin{minipage}[t]{5cm}
\centerline{\fbox{\epsfysize=5.5cm\epsffile{/source/bilder_einleitung/dodeka_alpha_ribbon.eps}}}
\caption{\label{dodeka_alpha}Dodeka-Alanin in alphahelikaler Konformation.}
\end{minipage}%
\hfill
\begin{minipage}[t]{9cm}
\centerline{\fbox{\epsfysize=5.5cm\epsffile{/source/bilder_einleitung/beta_Rnase_ribbon.eps}}}
\caption{\label{rnase_beta}Ansicht des $\beta$-Falt\-blatt\-bereiches zwischen den Aminosäureresten 79 und 104 der bovinen Ribonuklease A (PDB ID 1XPT \cite{Sadasivan1998}).}
\end{minipage}
\end{figure}
Es wird hierbei zwischen der Primär-, Sekundär-, Tertiär- und Quartärstruktur unterschieden. Unter der Primärstruktur versteht man die Aminosäuresequenz eines Proteins, d.h. die Art und die Reihenfolge der Aminosäuren, die das Protein bilden. Man unterscheidet hier zwischen polaren, unpolaren und aromatischen Aminosäureresten. Eine besondere Rolle nehmen hier die Aminosäuren Cystein und Prolin ein: Erstere kann mit einem anderen Cystein eine sog. Disulfidbrücke ausbilden und so in die Peptidkette eine kovalente Verknüpfung einfügen. Letztere ist die einzige cyclische $\alpha$-Iminosäure unter den proteinogenen Aminosäuren und besitzt daher eine relativ starre Konformation. Sie wird sehr oft auch als {\glqq Helixbrecher\grqq} bezeichnet.

Auf der Ebene der Sekundärstruktur unterscheidet man die lokale räumliche Gerüststruktur ohne Berücksichtigung der Seitenketten, die die Polypeptidkette einnimmt. Am verbreitesten sind hier helikale Strukturen und Faltblattstrukturen. Helices unterscheiden sich hinsichtlich der Ganghöhe $n$, d.i. die Anzahl der Reste pro helicaler Windung, und der Lage der Wasserstoffbrückenbindungen, die die Helix stabilisieren. Abb. \ref{dodeka_alpha} zeigt die $\alpha$-helicale Konformation am Beispiel des Dodeka-Alanins, Abb. \ref{rnase_beta} ein Beispiel einer Faltblattstruktur aus der bovinen Ribonuklease A. Zur Unterscheidung von Helices in Proteinen wurde eine Bezeichnung der Art $n_m$ entwickelt, wobei $n$ die Anzahl der Reste pro Windung und $m$ die Anzahl der Atome ist -~einschließlich dem betreffenden Wasserstoffatom~-, die sich innerhalb des durch die Wasserstoffbrücke geschlossenen Ringes befinden.

\begin{figure}[t,h]
\begin{center}
\begin{minipage}[h]{15.5cm}
\centerline{\fbox{\epsfysize=5cm\epsffile{/source/bilder_einleitung/Proteine_Struktur_helix.eps}}}
\caption{\label{schema_helix} Schema der Wasserstoffbrücken für verschiedene Helices. Die gestrichelten Linien symbolisieren den jeweiligen Wassersoffbrückenkontakt zwischen dem Carbonylsauerstoff und dem Amidproton, {\glqq R\grqq} steht für die jeweilige Aminosäureseitenkette.}
\end{minipage}
\end{center}
\end{figure}

Abb. \ref{schema_helix} zeigt ein Schema dieses Systems. Die $\alpha$-Helix ist demnach eine $3.6_{\km{13}}$-Helix, welche etwas gestauchter als die $3_{\km{10}}$-Helix ist. $\alpha$-Helices finden sich sehr oft in Faser- und globulären Proteinen; in Lysozym sind sowohl $\alpha$- als auch $3_{\km{10}}$-Helices zu finden (siehe Kapitel \ref{lysozym}). Abb. \ref{schema_beta_faltblatt} zeigt das Schema eines antiparalellen $\beta$-Faltblattes. Dieses sekundäre Strukturmotiv ist ebenfalls in globulären Proteinen weit verbreitet. Helix- und Faltblattstrukturen stellen die repetitiven Motive innerhalb der Proteinstruktur dar, neben denen es noch die Knäuel- und Schleifenkonformationen gibt, die nicht-repetitiv sind und sich nicht so einfach und elegant beschreiben lassen. Das wohl wichtigste Strukurelement hier stellt wohl die sog. $\beta$-Schleife dar - so benannt, weil dieses Motiv sehr oft aufeinanderfolgende Stränge antiparalleler $\beta$-Faltblätter verbindet. An dieser Stelle soll hier nur auf die $\beta$-Schleife des Typs II eingegangen werden, da diese bei der Untersuchung des elastin-ähnlichen Polypeptids $\km{GVG(VPGVG)_\km{3}}$ eine wichtige Rolle spielt. Abb. \ref{beta_turn} zeigt ein Modell dieses sekundären Strukturelements. Das Vorkommen eines Prolins in Position 2 dieser Konformation ist sehr häufig, und da beim Typ II der Carbonylsauerstoff des Restes 2 der Seitenkette des Aminosäurerestes 3 sehr nahe kommt, findet sich in Position 3 hier meistens ein Glycin.

\begin{figure}[p,h,t]
\begin{center}
\begin{minipage}[h]{15.5cm}
\centerline{\fbox{\epsfysize=6cm\epsffile{/source/bilder_einleitung/Proteine_Struktur_beta.eps}}}
\caption{\label{schema_beta_faltblatt} Schema eines antiparalellen $\beta$-Faltblatts. Die beiden Stränge liegen sich hierbei gegenläufig gegenüber. Parallele Faltblätter, bei denen die gegenüberliegenden Ketten gleich ausgerichtet sind, existieren ebenfalls; hier sind die Wasserstoffbrücken im Vergleich zum antiparallelen Faltblatt allerdings etwas verzerrt.}
\end{minipage}
\end{center}
\end{figure}

\begin{figure}[p,h,t]
\begin{center}
\begin{minipage}[h]{15.5cm}
\centerline{\fbox{\epsfysize=6cm\epsffile{/source/bilder_einleitung/VPGV.eps}}}
\caption{\label{beta_turn} Modelldarstellung einer $\beta$-Schleife für die Reste V$_\km{1}$P$_\km{2}$G$_\km{3}$V$_\km{4}$. Dieses Motiv wird durch eine Wasserstoffbrücke zwischen dem Carbonylsauerstoff von V$_\km{1}$ und dem Amidproton von V$_4$ stabilisiert. Die Torsionswinkel der Reste 2 und 3 sind hierbei: $\Phi_\km{2} \approx -60°, \Psi_\km{2} \approx 120°, \Phi_\km{3} \approx 90°$ und $\Psi_\km{3} \approx 0°$. Die $\beta$-Schleife des Typs I unterscheidet sich von der hier dargestellten nur dadurch, dass die Peptidbindung zwischen Rest 2 und 3 um 180° gedreht ist.}
\end{minipage}
\end{center}
\end{figure}

Unter dem Begriff der Tertiärstruktur versteht man die gesamte Struktur eines Polypetids, welche durch die Orientierung der Sekundärstrukturelemente untereinander gebildet wird. Die einzelnen gefalteten Polypetidketten lagern sich in einzelnen Fällen zu Oligomere zusammen, was wiederum unter dem Begriff der Quartärstruktur zusammengefasst wird. Ein bekanntes Beispiel eines Proteins mit Quartätstruktur ist der Blutfarbstoff Hämoglobin, welches ein Tetramer aus identischen Untereinheiten ist.






\section{Thermodynamische Beschreibung der Proteinfaltung}\label{proteine_thermo}
Nach Hawley \cite{Hawley1971} kann das Faltungsverhalten von Proteinen mit einem Zweizustandsmodell beschrieben werden, das zwischen einem gefalteten $N$ und einem entfalteten Zustand $D$ unterscheidet:


\begin{equation}
\Delta G_{unf.} = G_\km{D} - G_\km{N} \label{formel_1}
\end{equation}


Gemäß dem Zusammenhang


\begin{equation}
\km{d}(\Delta G_{\km{unf.}}) = - \Delta S dT + \Delta V dp \label{formel_2}
\end{equation}


kann durch Integration und Taylorreihenentwicklung nach $T$ und $p$ folgender Ausdruck für $\Delta G_\km{unf.}(p,T)$ gewonnen werden:


\begin{eqnarray}
\Delta G_\km{unf.} & = & \frac{\Delta\beta}{2}(p-p_\km{0})^2  + \Delta\alpha(p-p_\km{0})(T-T_\km{0})- \nonumber \\ && \Delta C_\km{p}[T(\km{ln}{\frac{T}{T_\km{0}}}-1) + T_\km{0}] +  \Delta V_\km{0}(p-p_0) - \nonumber \\ && \Delta S_\km{0}(T-T_0) + \Delta G_\km{0} \label{dG1}
\end{eqnarray}


wobei die einzelnen Parameter wie folgt definiert sind:


\begin{eqnarray}
&&\Delta S  =  S_\km{D} - S_\km{N}  =  - (\frac{\partial \Delta G}{\partial T})_\km{p} \nonumber \\ && \Delta V = V_\km{D} - V_\km{N} = (\frac{\partial G}{\partial p})_\km{T} \nonumber \\ && \Delta G_\km{0} = \Delta G(p_\km{0}, T_\km{0}) \nonumber \\ &&  \Delta S_\km{0} = \Delta S(p_\km{0}, T_\km{0}) \nonumber \\ && \Delta V_\km{0} = \Delta V(p_\km{0}, T_\km{0}) \nonumber \\ && \Delta \beta = (\frac{\partial \Delta V}{\partial p})_T \nonumber \\ && \Delta C_p = T (\frac{\partial \Delta S}{\partial T})_p \nonumber \\ && \Delta \alpha = (\frac{\partial \Delta V}{\partial T})_p = -(\frac{\partial \Delta S}{\partial p})_T \nonumber
\end{eqnarray}

Hierbei ist $\alpha$ der thermische Ausdehnungsfaktor $\alpha = (\frac{\partial V}{\partial T})_\km{p}$, $\beta$ der isotherme Kompressibilitätsfaktor $\beta = (\frac{\partial V}{\partial p})_\km{T}$ und $C_\km{p}$ die Wärmekapazität $C_p = T (\frac{\partial S}{\partial T})_p$.

Für die reine Temperaturabhängigkeit der Gibbs-Entfaltungsenergie läßt sich $\Delta G_{unf.}$ in Form der modifizierten Gibbs-Helmholtz-Gleichung mit $T_m$ als der mittleren Temperatur des Denaturierungsübergangs wie folgt formulieren:


\begin{equation}
\Delta G_{\km{unf.}} = \Delta H_\km{m}(\frac{T_\km{m} - T}{T_\km{m}} - \Delta C_p(T_\km{m} - T(1-\km{ln}(\frac{T}{T_\km{m}}))))
\end{equation}
\vspace{0.1cm}

Empirisch konnte dabei auf Basis von Daten kleiner, globulärer Proteine näherungsweise folgende Zusammenhang zwischen der Anzahl der Aminosäurereste {\it N} und den Größen $\Delta C_p$, $\Delta H(T=333~\km{K})$ sowie $\Delta S(T=333~\km{K})$ gefunden werden \cite{Robertson1997, Rees2001}:


\begin{eqnarray}
\Delta C_p &\approx& 0,058 N \frac{\km{kJ}}{\km{mol Rest K}} \\ \nonumber \\ \Delta H(T=333 \km{K}) &\approx& 2,92 N \frac{\km{kJ}}{\km{mol Rest}} \\ \nonumber \\ \Delta S(T=333 \km{K}) &\approx& 0,088 N \frac{\km{kJ}}{\km{mol Rest K}}
\end{eqnarray}
\vspace{0.1cm}

Insbesondere konnte gezeigt werden, dass $\Delta C_p$ mit der Änderung der {\it accessible surface area} ASA und damit mit dem Grad der Hydratisierung korreliert.

\begin{figure}[t]
\begin{center}
\begin{minipage}[h]{15.5cm}
\centerline{\fbox{\epsfysize=4.0cm\epsffile{/source/bilder_einleitung/3D_Dia_chymo_ribo.eps}}}
\caption{\label{3D_dia_chymo_ribo}$\Delta G_{\km{unf.}}$ als Funktion der Temperatur und des Drucks berechnet nach Formel \ref{dG1} für das Protein Chymotrypsinogen (rechts) und Ribonuklease (links) \cite{Hawley1971}. Die dunkelblau markierte Fläche zeigt den Bereich an, in dem $\Delta G_{\km{unf.}}$ größer als Null ist. \label{chymo_rib_dia}}
\end{minipage}
\end{center}
\end{figure}

Mit Formel \ref{dG1} läßt sich der Temperatur- und Druckbereich berechnen, in dem die Gibbs-Energie der Entfaltung positiv ist, d.h. der Bereich, in dem das Protein den nativen, gefalteten Zustand einnimmt. Abb. \ref{chymo_rib_dia} zeigt die Gibbs-Energie der Entfaltung als Funktion des Drucks $p$ und der Temperatur $T$, wie sie sich für die Proteine Chymotrypsinogen und Ribonuklease gemäß \cite{Hawley1971} berechnen läßt. Es ist ersichtlich, dass es bei gegebenen Druck zwei Temperaturen gibt, bei denen die Bedingung $\Delta G_{\km{unf.}} = 0$ erfüllt ist, und dass mit zunehmenden Druck $\Delta G_{\km{unf.}}$ stetig abnimmt. Dementsprechend lassen sich drei Methoden der Denaturierung unterscheiden: die Hitzedenaturierung bei hohen Temperaturen, die Kältedenaturierung bei niedrigen Temperaturen und die Druckdenaturierung bei hohen Drücken.

Abb. \ref{p_T_schema} zeigt schematisch diesen Zusammenhang zwischen Entfaltung und Druck sowie Temperatur. Bei hohen Temperaturen führt die hohe Differenz der Konfigurationsentropien $\Delta S_{\km{conf.}}$ zwischen gefalteten und ungefalteten Protein zur Denaturierung, während bei sehr hohen Drücken das negative Übergangsvolumen $\Delta V_\km{0}$ den nativen Zustands destabilisiert. Bei niedrigen Temperaturen kommt es zu einer Zunahme der Hydratisierung und damit zu einer Abnahme der entsprechenden Enthalpieänderung $\Delta H_{\km{hydr.}}$, die zu einem entfalteten, hochgradig hydratisierten Zustand führt. Diese Zunahme an Hydratisierung ist begleitet von einem Übergang zu einer höheren Wärmekapazität $C_p$. Diese Änderungen wurden für Proteine bei den Übergängen bei sowohl tiefer als auch hoher Temperatur gefunden \cite{Kunugi2002, Privalov1990}.

\begin{figure}[t,h]
\begin{center}
\begin{minipage}[h]{15.5cm}
\centerline{\fbox{\epsfysize=7cm\epsffile{/source/bilder_einleitung/p_T_schema.eps}}}
\caption{\label{p_T_schema}Schema des $p$,$T$-Zustandsdiagramms von monomeren Proteinen.}
\end{minipage}
\end{center}
\end{figure}

Neben den bisher behandelteten Denaturierungsformen, die durch die thermodynamischen Parameter Druck und Temperatur eingeleitet werden, können Proteine auch durch chemische Zusätze, wie z.B. Harnstoff oder Guanidinhydrochlorid, entfaltet werden. Hierbei binden diese Agentien preferentiell ans Protein, anstatt in Lösung vollständig solvatisiert vorzuliegen, und destabilisieren durch diese Interaktion den nativen Zustand des Proteins. Allerdings gibt es auch Cosolventien, welche die Stabilität der Biomoleküle erhöhen, indem sie vornehmlich nicht an die Oberfläche des Proteins binden, sondern sich hauptsächlich ungebunden und stark hydratisiert in Lösung aufhalten (vgl. Kap. \ref{cosolv}).

Die native Struktur eines Proteins ist damit das Ergebnis einer Summe verschiedener Einflüsse, auf dessen Gleichgewichtslage die einzelnen Denaturierungsfaktoren einwirken können. Daher soll in den folgenden Kapiteln auf die einzelnen stabilisierenden und destabilisierenden Faktoren näher eingegangen werden.


\section{Faltung}\label{proteinfaltung}

Unter physiologischen Bedingungen falten sich Proteine spontan in die native Konformation, indem sie einen selbst organisierten Faltungsprozess (engl. {\glqq {\it self assembly}\grqq}) durchführen. Dabei ist davon auszugehen, dass der Verlauf nicht zufällig vonstatten geht, sondern durch bestimmte treibende Kräfte gesteuert wird, da in der Zeit, die Proteine üblicherweise zur Faltung brauchen, unmöglich alle möglichen Konformationen eingenommen werden können \cite{Levinthal1969, Richards1991}.

In dem Diffusions-Kollisions-Modell von Karplus und Weaver \cite{Karplus1976} wird davon ausgegangen, dass sich lokale Strukturen schnell ausbilden, aber auch sehr schnell wieder zerfallen. Treten so entstandene Mikrodomänen allerdings in Wechselwirkung miteinander, können sich stabilisierte Strukturen höherer Ordnung bilden, die von Dauer sind. So wird stufenweise das gefaltete Protein aus lokalen Mikrodomänen zusammengesetzt, was die anzunehmende Faltungszeit drastisch herabsetzt.

Ein weiteres Modell schlägt als Erklärung den sog. hydrophoben Kollaps vor, der auf dem hydrophoben Effekt basiert und bei dem die treibende Kraft der Faltung das Zusammenlagern hydrophober Reste ist, die hierdurch ihre wasserexponierte Fläche verkleinern \cite{Dill1985, Dill1989, Alonso1991}. Nachdem das Protein auf nahezu native Dichte kollabiert ist, bilden sich Sekundär- und Tertiärstruktur.


Diese Ansätze wurden mit Hilfe von {\it lattice}-Modellen weiterentwickelt, wobei der Parameter $Q$ als Maß für den Fortschritt der Faltung dient und wobei mittels computergestützter Monte Carlo Rechnungen erste Faltungsszenarien entworfen werden konnten \cite{Abkevich1994, Fersht1995, Fersht1997}. $Q$ ist dabei der Anteil der bereits geknüpften nicht-kovalenten Kontakte innerhalb des Proteins, d.h. $Q$ ist gleich Null für das vollständig entfaltete und gleich Eins für das kompakte, native Protein. Mit derlei Modellen konnten Energielandschaften der freien Energie F als Funktion des Anteils geknüpfter nativer Kontakte Q sowohl für Modellproteine als auch für globuläre Proteine wie z.B. Lysozym berechnet werden \cite{Dobson1999, Dinner2000}. Es ist jedoch bis heute nicht möglich, aus der Aminosäuresequenz die 3D-Struktur eines Proteins zu berechnen, obwohl erwiesen ist, dass es bei einer gegebenen Umgebung die Aminosäuresequenz ist, welche die native dreidimensionale Struktur bestimmt \cite{Afinsen1973}.

Experimentell konnte für die viele Proteine nachgewiesen werden, dass der Faltungsprozess über (mindestens) ein Intermediat verläuft, welches {\it Molten Globule} genannt wird \cite{Ptitsyn1994}. Hier liegt das Protein im Wesentlichen schon sehr kompakt mit gefalteter Sekundärstruktur vor. Lysozym aus Hundemilch besitzt z.B. einen außerordentlich stabilen {\it Molten Globule}-Zustand, der nahezu diskret über DSC-Messungen beobachtbar ist \cite{Koshiba2000}.

\begin{figure}[h]
\begin{center}
\begin{minipage}[h]{15.5cm}
\centerline{\fbox{\epsfysize=17cm\epsffile{/source/bilder_einleitung/F_Qa_Qb.eps}}}
\caption{\label{F_Qa_Qb} Die freie Energie F von Lysozym als Funktion des Faltungsfortschritts $Q_{\km{\alpha}}$ in der $\alpha$-Domäne und $Q_{\km{\beta}}$ in der $\beta$-Domäne. Die gelbe Trajektorie zeigt den direkten Faltungsweg an, während die rote Trajektorie den Verlauf über ein Intermediat mit gefalteter $\alpha$-, jedoch unstrukturierter $\beta$-Domäne nimmt \cite{Dinner2000}.}
\end{minipage}
\end{center}
\end{figure}

\clearpage{}


\section{Stabilität}
Unter physiologischen Bedingungen weisen Proteine eine nur geringe Stabilisierung von etwa 0,4 kJ mol$^{-1}$ pro Rest auf, so dass ein Protein mit hundert Resten eine Stabilisierungsernergie von nur 40 kJ mol$^{-1}$ besitzt - das Äquivalent einer Stabilisierung durch etwa zwei Wasserstoffbrücken. Wie schon unter Abschnitt \ref{proteine_thermo} angedeutet, ist die Stabilisierungsenergie $\Delta G_\km{unf.}$ das Ergebnis einer Anzahl verschiedener Faktoren. Hierbei lassen sich der Einfluss von Salzbrücken, Wasserstoffbrücken, Dipol-Dipol-Wechselwirkungen und hydrophoben Kräften unterscheiden.

Salzbrücken sind ionische Wechselwirkungen zwischen geladenen Resten, wie z.B. der $\gamma$-Car\-box\-yl\-gruppe des Glutamins und der $\epsilon$-Aminogruppe des Lysins. Der Anteil dieser Wechselwirkungen an der Stabilität von Proteinen wird als eher niedrig eingeschätzt und i. d. R. vernachlässigt. Wasserstoffbrücken hingegen spielen eine sehr wichtige Rolle bei der Stabilisierung und der Struktur von Proteinen. Hierbei handelt es sich um vorwiegend elektrostatische Wechselwirkungen zwischen einem partiell positiv geladenem Wasserstoff einer Donorgruppe und einem partiell negativ geladenem Akzeptoratom (zumeist Sauerstoff oder Stickstoff). Der Abstand zwischen den beiden Atomen beträgt ca. 0,3 nm und trägt zur Stabilisierungsenergie mit 12 bis 30 kJ mol$^{-1}$ pro Wasserstoffbrücke bei.

Unter Dipol-Dipol-Wechselwirkungen werden verschiedene attraktive Kräfte zwischen elektrisch neutralen Molekülgruppen zusammengefasst. Diese sog. van-der-Waals-Kräfte bestehen zwischen z.B. permanenten Dipolen oder Dipolen und induzierten Dipolen. Diese Wechselwirkungen sind schwächer als die der Salz- oder Wasserstoffbrücken, aber aufgrund der hohen Häufigkeit dieser van-der-Waals-Wechselwirkungen spielen sie eine große Rolle für die Proteinstabilisierung.

Als sog. hydrophoben Effekt bezeichnet man das Phänomen, dass unpolare Substanzen die Kontaktfläche zu Wasser minimieren und es so z.B. bei amphiphilen Molekülen wie Fettsäuren zur Ausbildung von Doppelmembranen kommt. Betrachtet man die Gibbs-Energie des Transfers einer unpolaren Komponente von einem unpolaren Lösungsmittel zu Wasser, so findet sich oft, dass dieser Transfer enthalpisch günstig, entropisch jedoch ungünstig ist \cite{Muller1990}. So ist die Exponierung hydrophober Reste an der Oberfläche von Proteinen thermodynamisch ungünstig (vgl. \ref{proteinfaltung}, 'hydrophober Kollaps'), da die Hydratisierung unpolarer Oberflächen mit einer Verminderung der Entropie verbunden ist. Man nimmt an, dass dies an der clathratartigen Struktur liegt, die Wassermoleküle bei der Hydratisierung dieser Reste  einnehmen.

All diese Einflüsse haben eine eigene Temperatur- und Druckabhängigkeit, die letztendlich zu einem Entfaltungsverhalten, wie in Abschnitt \ref{proteine_thermo} beschrieben, führt. Anhand von Modellabschätzungen konnte gezeigt werden, dass die Enthalpie der Entfaltung für die Wasserstoffbrücken größer als Null ist und sie mit Änderung der Temperatur annähernd konstant bleibt. Die Enthalpieänderung der van-der-Waals-Wechselwirkungen ist ebenfalls größer Null -~sie stabilisiert also die Faltung~-, mit zunehmender Temperatur nimmt sie jedoch ab. Die Enthalpieänderungen $\Delta H_{\km{hydr.}}$ der polaren, aromatischen als auch der aliphatischen (= hydrophoben) Gruppen sind kleiner als Null, stabilisieren also die denaturierte Spezies. Die Hydratationsenthalpie polarer Gruppen sinkt dabei jedoch mit steigender Temperatur, d.h. sie wird noch negativer, während die Hydratisierungsenthalpie aromatischer Gruppen gegen Null konvergiert und diejeniger aliphatischer Gruppen ansteigt und bei höheren Temperaturen sogar größer als Null ist \cite{Makhatadze1993}. Unter Einbezug der jeweiligen Entropieänderungen bei der Entfaltung bedeutet dies für die entsprechenden Gibbs-Entfaltungsenergien, dass der Anteil der polaren Hydratisierung den nativen Zustand destabilisiert (d.h. $\Delta G_{\km{unf.}}$(polar) < 0), die Hydratisierung aromatischer Gruppen schwach destabilisierend ist, während die Hydratisierung unpolarer Gruppen jedoch stabilisierend auf den nativen Zustand unter Standardbedingungen wirkt (siehe Abb. \ref{privalov_dH_dG}). Mit abnehmender Temperatur erniedrigt sich die Gibbs-Entfaltungsenergie für die Hydratation polarer Reste und führt so zur Kältedenaturierung, während mit zunehmender Temperatur der Term $-T\Delta S_{\km{conf.}}$ überwiegt und die Hitzdenaturierung eintritt.

\begin{figure}[t,h]
\begin{center}
\begin{minipage}[h]{15.5cm}
\centerline{\fbox{\epsfysize=6cm\epsffile{/source/bilder_einleitung/privalov.eps}}}
\caption{\label{privalov_dH_dG} Hydratisierungsenthalpien $\Delta H_{\km{unf.}}$(hydr.) der Entfaltung für polare, unpolare und für alle Aminosäurereste von Lysozym (links), sowie die Gibbs-Energie-Beiträge einzelner Wechselwirkungen in Myoglobin (rechts) (wobei $\Delta G(\km{vdW})$ die Gibbs-Energie-Änderung der van-der-Waals-Wechselwirkungen, $\Delta G(\km{hydr., HB})$ die Gibbs-Energie-Änderung der Wasserstoffbrücken, $\Delta G(\km{unpolar})$ die Gibbs-Energie-Änderung der hydrophoben Hydratisierung und $-T \Delta S_{\km{conf.}}$ der Term der Konfigurationsentropie ist. $\Delta G_\km{unf.}(\km{exp.})$ ist die gesamte Gibbs-Entfaltungsenergie.). Grafiken modifiziert nach \cite{Privalov1993, Makhatadze1993}.}
\end{minipage}
\end{center}
\end{figure}


\section{Der Einfluss von Cosolventien} \label{cosolv}
Es ist seit langem bekannt, das chemische Zusätze die native Struktur von Proteinen stabilsieren bzw. destabilisieren können. In der Natur liegen Proteine so gut wie nie in ideal verdünnten, wässrigen Lösungen vor, sondern befinden sich in der Regel in Lösungen mit einer großen Anzahl von anderen Komponenten. So ist das Cytoplasma der Zelle eine komplexe Mischung aus Wasser, Proteinen, Nukleinsäuren, (Poly-)Sacchariden, Lipiden und einer Vielzahl kleinerer organischer und anorganischer Bestandteile. Eine erschöpfende physikalisch-chemische Behandlung von Proteinen {\it in vivo} müsste also den Einfluss anderer Cosolventien explizit mit einbeziehen. Für vereinfachte Modelle der Proteinstabilität reicht es jedoch, sich eine ternäre Lösung aus Protein $Pr$, Wasser $H_\km{2}O$ und Ligand $L$ vorzustellen, zumal der Effekt der Destabilisierung als auch der Stabilisierung einheitlich über das Verhalten des hydratisierenden Wassers beschrieben werden kann.

Stellt man sich das Gleichgewicht zwischen vollkommen hydratisiertem Protein $Pr$ und Protein, welches einen Liganden $L$ gebunden hat, vor, so ist das Anbinden eines Liganden an einem Bindungsort eine Austauschreaktion mit Wassern \cite{Timasheff2002}:

\begin{equation}
Pr \cdot n H_\km{2}O + \km{L} \leftrightharpoons P \cdot L + n H_\km{2}O
\end{equation}

Demgemäß läßt sich die Gleichgewichtskonstante des Austausches $K_\km{ex.}$ wie folgt formulieren \cite{Timasheff1993}:

\begin{equation}
K_\km{ex.} = \frac{[Pr\cdot L][H_\km{2}O]^{n}}{[Pr \cdot nH_\km{2}O][L]}
\end{equation}
\vspace{1mm}

Betrachtet man die Bindung an gleichartige, nicht aufeinander einwirkende Bindungsplätze, so läßt sich die mittlere Anzahl gebundener Liganden $\nu_L$ als Funktion von $[L]$ formulieren \cite{Timasheff2002} \cite{Schellmann1987}:

\begin{equation}
\nu_L = \frac{[(K_{\km{ex.}} - [H_2O]^\km{-1})[L]}{1 + K_{\km{ex.}}[L]}
\end{equation}
\vspace{1mm}

Da $[H_\km{2}O] = const. = 55,56$ M, ergibt sich für $K_{\km{ex.}} > 0,018$ eine normale Adsorptionskurve die sich asymptotisch mit steigendem $[L]$ dem Wert 1 nähert. In diesem Fall spricht man von preferentieller Bindung, d.h., die Bindung des Liganden ist günstiger als die von Wasser. Ist $K_{\km{ex.}}$ kleiner als 0,018, so wird $\nu_{L}$ kleiner als Null und der Ligand wird vornehmlich abgestoßen bzw. Wasser wird vornehmlich an dem Bindungsplatz gebunden; man spricht dann von preferentieller Exklusion (engl. {\it preferential exclusion}) bzw. preferentieller Hydratisierung \cite{Timasheff1993}. In der Praxis sind die freien Bindungsenergien von Wasser $\Delta G_{\km{H_2O}}$ und der verwendeten Liganden $\Delta G_{L}$ nur gering unterschiedlich, sodass hohe Konzentrationen (0,2 M - 10 M) an Ligand eingesetzt werden müssen, um einen Effekt zu erzielen, weshalb von den Liganden $L$ auch als Cosolvens gesprochen wird.

Die preferentielle Bindung von Wasser bzw. der preferentielle Auschluss von Liganden an der Oberfläche eines Proteins hat wiederum einen Einfluss auf die Stabilität des Biomoleküls, da dieses in einem Gleichgewicht zwischen gefalteter und ungefalteter Form vorliegt, auf das die Bindung bzw. preferentielle Nichtbindung von Liganden Einfluss nehmen kann. Im vorliegenden Fall für die Entfaltung von Proteinen, muss also die Änderung der freien Entfaltungsenergie $ \Delta \Delta G_{\km{unf.}}$ bei Transfer von Wasser $H_2O$ in das Cosolvens-System $L$ beachtet werden. Definiert man daher die \emph{freie Transferenergie} $\Delta \mu_{Pr, \km{trans.}}$ des Proteins als Differenz des chemischen Potentials im Cosolvens-System und im rein wässrigen Medium, so gilt \cite{Timasheff1993}:

\begin{eqnarray}
\Delta \mu_{\km{Pr, trans.}} &=& \mu_{\km{Pr, L}} - \mu_{\km{Pr, H_2O}} \nonumber \\ &=& \mu^0_{\km{Pr, L}}(p, T) - \mu^0_{\km{Pr, H_2O}}(p, T) \nonumber \\ && +\ \km{R}T \km{ln}(\frac{a_{\km{Pr, L}}}{a_{\km{Pr, H_2O}}})
\end{eqnarray}

Wobei $\mu^0_\km{Pr, i}(p, T)$ die Standardpotentiale von $Pr$ im System $i$ und $a_{\km{Pr}, i}$ die entsprechenden Aktivitäten sind. Hieraus lässt sich die Änderung der freien Entfaltungsenergie bei Zugabe von Cosolventien wie folgt formulieren \cite{Tanford1964}:

\begin{eqnarray}
\Delta \Delta G_{\km{unf.}} &=& \Delta G_{\km{unf., L}} - \Delta G_{\km{unf., H_2O}} \nonumber \\  &=& \Delta \mu^\km{D}_{\km{Pr, trans.}} - \Delta \mu^\km{N}_{\km{Pr, trans.}} \nonumber
\end{eqnarray}

Letzte Formel sagt also aus, dass der Einfluss des Cosolvens auf die freie Energie der Entfaltung gleich der Differenz der freien Transferenergien von denaturierter und nativer Spezies ist. Hier wird deutlich, wie Colsoventien das Gleichgewicht zwischen nativer und denaturierter Konformation beeinflussen können: Agenzien, welche stark ans Protein binden, werden die offene, entfaltete Struktur stabilisieren und dementsprechend das Gleichgewicht in diese Richtung verschieben, während Stoffe, welche vornehmlich von der Oberfläche und damit von der Wechselwirkung mit Proteinen abgestoßen werden, den umgekehrten Effekt haben.

Neben der freien Transferenergie ist es sinnvoll, zwei weitere Größen zu definieren, die die Interaktion von Cosolvens und Protein beschreiben. Der \emph{preferentielle Wechselwirkungsparameter}

\begin{equation}
\left ( \frac{\partial \mu_{\km{Pr}}}{\partial [L]} \right) _{T, p, \km{[Pr]}} = \left (\frac{\partial \mu_{\km{L}}}{\partial [Pr]} \right )_{T, p, \km{[L]}}
\end{equation}

beschreibt den Gradienten der Transferenergie mit Änderung der Cosolvens-Konzentration \cite{Timasheff1993}. Entsprechend ergibt eine Integration über $[L]$ die Änderung der Transferenergie des Proteins mit steigender Ligandenkonzentration:

\begin{equation}
\Delta \mu_{\km{Pr, trans.}} = \int_\km{0}^{\km{[L]}} (\frac{\partial \mu_{\km{Pr}}}{\partial [L]})_{T, p, \km{[Pr]}} \km{d}[L]
\end{equation}
\\
Der \emph{preferentielle Bindungsparameter} beschreibt die Menge an $[L]$ die zugegeben bzw. entnommen werden müsste, um das thermodynamische Gleichgewicht des Lösungsmittelsystems nach Zugabe von $Pr$ wiederherzustellen:

\begin{equation}
\left (\frac{\partial [L]}{\partial [Pr]} \right)_{T,p, \km{\mu_L}} = - \frac{ (\frac{\partial \mu_{Pr}}{\partial [L]})_{T, p, \km{[Pr]}}} {(\frac{\partial \mu_{\km{L}}}{\partial [L]})_{T, p,\km{ [Pr]}}}
\end{equation}

\begin{figure}[h,t]
\begin{center}
\begin{minipage}[h]{15.5cm}
\centerline{\fbox{\epsfysize=4cm\epsffile{/source/bilder_einleitung/stabilisation.eps}}}
\caption{\label{stabilisierung} Schema der Proteinstabilisierung durch Cosolventien. Die Ausschlusszone im entfalteten Zustand ist größer als im nativen. Da die Bindung der Cosolventien thermodynamisch ungünstig ist, wird das Gleichgewicht in Richtung nativer Zustand verschoben.}
\end{minipage}
\end{center}
\end{figure}

\begin{figure}[h,t]
\begin{center}
\begin{minipage}[h]{15.5cm}
\centerline{\fbox{\epsfysize=4.3cm\epsffile{/source/bilder_einleitung/pic_prefbinding.eps}}}
\caption{\label{destabilisierung} Schema der Proteindestabilisierung durch Cosolventien. Da die Bindung der Cosolventien thermodynamisch günstig ist, wird der entfaltete Zustand, der mehr Bindungsfläche bietet, stabilisiert.}
\end{minipage}
\end{center}
\end{figure}

Hier lassen sich nun der stabilisierende und der destabilisierende Fall unterscheiden: Cosolventien, welche vornehmlich von der Oberfläche des Proteins ausgeschlossen werden ($(\frac{\partial [L]}{\partial  [Pr]})_{T, p,\km{\mu_{H_2O}}}~<~0;$ $(\frac{\partial \mu_{\km{Pr}}}{\partial [L]})_{T, p, \km{[Pr]}}~>~0$), stabilisieren die native Konformation, da sie bevorzugt mit dem Wasser wechselwirken. Eine Proteinentfaltung, welche sogar noch mehr unpolare Oberfläche dem Wasser exponieren würde, ist in diesem Falle energetisch sehr ungünstig (siehe Abb. \ref{stabilisierung}). Binden die Cosolventien jedoch bevorzugt ans Protein (($(\frac{\partial [L]}{\partial  [Pr]})_{T, p, \km{\mu_{H_2O}}}~>~0 $; $(\frac{\partial \mu_{\km{Pr}}}{\partial [L]})_{T, p, \km{ [Pr]}} < 0$), wird die entfaltete, mehr Oberfläche exponierende Konformation stabilisiert (siehe Abb. \ref{destabilisierung}).



\section{Lysozym}\label{lysozym}
Lysozym ist ein globuläres Protein, welches in Zellen und Sekreten von Vertebraten vorkommt und die Hydrolyse der glycosidischen $\beta (1 \rightarrow 4)$-Bindung zwischen Acetylmuraminsäure und N-Acetylglucosamin im bakteriellen Mureinskelett katalysiert. Es trägt dementsprechend zur Bakterienabwehr bzw. zur Beseitigung bakterieller Überreste bei. Die Sequenz besteht aus 129 Aminosäurereste, welche über vier Disulfidbrücken vernetzt sind (C6-C127, C30-C115, C64-C80 und C76-C94) und eine molare Masse von 14.3 kD besitzt. Strukturell besteht es aus zwei Domänen, die $\alpha$- und $\beta$-Domäne genannt werden. Erstere besteht im Wesentlichen aus den 4 zentralen $\alpha$-Helices A, B, C und D, einer $3_{\km{10}}$-Helix und zwei Schleifen. Die $\beta$-Domäne wird im Wesentlichen durch ein dreibändiges $\beta$-Faltblatt, eine $3_{\km{10}}$-Helix und eine lange Schleifenregion gebildet \cite{Miranker1991}. Lysozym ist ein sehr kompaktes Molekül, welches eine nahezu ellipsoide Form mit Abmessungen von ca. 3 $\times$ 3 $\times$ 4.5 nm einnimmt. Seine herausragende strukturelle Eigenschaft ist eine lange Spalte entlang des Ellipsoids, welche das Substrat bindet. Das dreibändige $\beta$-Faltblatt ist Bestandteil dieser Furche.

\begin{figure}[h]
\begin{center}
\begin{minipage}[h]{15.5cm}
\centerline{\fbox{\epsfysize=7cm\epsffile{/source/bilder_einleitung/lysozym.eps}}}
\caption{\label{3Dlysozym} Schematische 3D-Struktur von Lysozym mit Sicht durch die katalytische Furche. Oberhalb dieser ist die $\alpha$-Domäne mit den Helices zu sehen, unterhalb die $\beta$-Domäne mit dem $\beta$-Faltblatt und der $3_{\km{10}}$-Helix (PDB ID 1HEL \cite{Wilson1992}).}
\end{minipage}
\end{center}
\end{figure}


Abb. \ref{3Dlysozym} zeigt eine Ansicht entlang der katalytischen Furche von Lysozym aus Hühnereiweiß. Diese Furche teilt das Protein in seine zwei Domänen: im oberen Teil des Bildes ist die $\alpha$-Domäne mit den vier Haupthelices und der $3_{\km{10}}$-Helix, unterhalb der Substratbindungsspalte ist das $\beta$-Faltblatt und eine weitere $3_{\km{10}}$-Helix sichtbar.

Die Beschreibung von Faltungs- bzw. Denaturierungsintermediaten von HEL ist teilweise etwas uneinheitlich, da verschiedene Methoden angewandt werden können, diese Intermediate herzustellen und zu beschreiben. Während für das Molekül Lactalbumin - welches 40 \% Homolgie mit Lysozym aufweist, jedoch eine andere Funktion hat - seit langem ein stabiles Intermediat beschrieben ist, wird für HEL zumeist nur von einem kinetisch akkumulierten Intermediat berichtet \cite{Kuwajima1985, Sugai1994, Dobson1994, deLaureto2002}. Es finden sich aber auch Charakterisierungen von thermisch und chemisch induzierten, stabilen Intermediaten \cite{Ahmad1983, vanStokkum1995,Bhattacharjya1997, Hirai1999, Arai1999}. Einigkeit scheint darin zu bestehen, dass es die $\alpha$-Domäne ist, welche zuerst bei der Faltung entsteht und welche am stabilsten ist \cite{Dobson1994_1, Matagne2000}.


\section{Elastin und elastin-mimetische Polypeptide}
Elastin ist ein Strukturprotein, welches Fasern in Blutgefäßen, Lungen und Haut Elastizität verleiht, etwa 30 \% des Trockengewichts von Arterien ausmacht und dementsprechend eine wichtige Rolle in den Blutgefäßen sowie bei der Entwicklung von Gefäßkrankheiten spielt \cite{Vyavahare1999, DArmiento2003, Krettek2003}. Es ist ein hochmolekulares, hochgradig quervernetztes Polymer, welches im Wesentlichen aus kleinen, apolaren Aminosäuren wie Glycin, Alanin und Valin besteht; desweiteren findet sich Prolin \cite{Foster1973}. Die Eigenheit, welche Elastin und elastin-ähnliche Polymere für die Proteinforschung so interessant macht, ist, dass diese mit steigender Temperatur einen Konformationswechsel von ungeordneter zu geordneter Konformation durchlaufen \cite{Urry1985}. Dieses Phänomen wird als inverser Temperaturübergang (ITT, engl.: {\it inverse temperature transition}) bezeichnet und ist insofern erstaunlich, als überlicherweise Systeme mit steigender Temperatur aufgrund von $\Delta S_{\km{conf.}} > 0$ zu ungeordneteren Zuständen übergehen. Der ITT bietet so eine Möglichkeit, temperaturabhängig die Proteinfaltung zu untersuchen \cite{Urry1997}.

\begin{figure}[t,h]
\begin{center}
\begin{minipage}[h]{15.5cm}
\centerline{\fbox{\epsfysize=8cm\epsffile{/source/bilder_einleitung/18mer_stick.eps}}}
\caption{\label{urrybeta} Dreidimensionale Darstellung von $\km{GVG(VPGVG)_3}$ in der linksgängigen $\beta$-Schleifenkonfiguration. Die Wasserstoffbrücken zwischen den Valinen sind als grüne, unterbrochene Striche markiert. Die zugrundeliegende PDB-Datei wurde von Dr. Dietmar Paschek (Physikalische Chemie, Universität Dortmund) zur Verfügung gestellt. }
\end{minipage}
\end{center}
\end{figure}

Es konnte gezeigt werden, dass für dieses ungewöhnliche Verhalten eine pentamere repetitive Untereinheit von Aminosäureresten verantwortlich ist, und dass dieser Konformationswechsel ein Übergang von ungeordneter Konformation zu einer Typ II-$\beta$-Helix Struktur ist (vgl. Kapitel \ref{strukturelemente}, Abb. \ref{beta_turn}) \cite{Urry1989, Reiersen1998}. An einem Oktamer wurde festgestellt, dass bei sehr hohen Temperaturen ($\geq$ 100~°C) ein weiterer Übergang stattfindet, was andeutet, dass es sich bei dem ITT wahrscheinlich um einen Kälterenaturierungsübergang bei ungewöhnlich hoher Temperatur handelt \cite{Nicolini2004}. Molekular dynamische Simulationen konnten den ITT reproduzieren und durch starke Peptid-Wasser-Wechselwirkungen bei niedrigen, aber starken Peptid-Peptid-Wechselwirkungen bei hohen Temperaturen erklären \cite{Rousseau2004}. Kleine, elastin-mimetische Peptide können also als Modelle für Elastin und für die Untersuchung von Hydratisierung bei der Proteinfaltung dienen und bringen dabei den Vorteil mit, kleine und damit gut charakterisierbare Systeme zu sein.

Abb. \ref{urrybeta} zeigt eine dreidimensionale Darstellung des in dieser Arbeit untersuchten Polypeptids $\km{GVG(VPGVG)_3}$, wenn sich alle pentameren Untereinheiten in der $\beta$-Schleifenkonfiguration befinden. Dieses Molekül besitzt drei dieser pentameren Einheiten und kann dementsprechend drei $\beta$-Schleifen des Typs II ausbilden.



\clearpage
\newpage

\chapter{Methoden}

\section{NMR: Grundlagen}\label{NMR_1}
Verglichen mit anderen Spektroskopiemethoden wie FT-IR, UV/VIS oder CD bietet die NMR-Spektroskopie eine weit größere Anzahl von Experimenten mit einer dementsprechend breiteren Palette von Informationen, die erhalten werden können. Dies liegt einerseits daran, dass verschiedene Kerne angeregt und detektiert werden können, andererseits kann diese Anregung gemäß bestimmter Pulsfolgen geschehen, bei denen Anregungspulse und Relaxationsintervalle so gewählt werden können, dass eine bestimmte Information erhalten werden kann.

Grundlage eines jeden NMR-Experiments ist eine Probe, die sich in einem statischen Magnetfeld $\vec{B}_0$ befindet. Kerne mit einer Kernspinquantenzahl $I = 1/2$ wie z.B. $^1\km{H}$ oder $^{13}\km{C}$ können zwei mögliche Orientierungen einnehmen: in Richtung oder in Gegenrichtung des Feldes $\vec{B_0}$. Da der $\alpha$-Zustand, bei dem die Spins in Richtung des Feldes weisen, im thermodynamischen Gleichgewicht etwas höher populiert ist als der $\beta$-Zustand, besteht eine makroskopische Magnetisierung $\vec{M}_0$ in $z$-Richtung d.h. in Richtung des Feldes $\vec{B}_0$ (vgl. Abb. \ref{M0}).




\begin{figure}[h,p,t]
\begin{center}
\begin{minipage}[h]{15.5cm}
\centerline{\fbox{\epsfysize=8cm\epsffile{/source/bilder_einleitung/M0.eps}}}
\caption{\label{M0} Vektormodell für ein Ensemble von Spins mit der Kernspinquantenzahl $I = 1/2$ im thermodynamischen Gleichgewicht. Es bestehen zwei Ausrichtungsmöglichkeiten, eine in Richtung des angelegten Magnetfeldes $\vec{B}_0$ ($m = +1/2$) und eine entgegen $\vec{B}_0$ ($m = -1/2$). Da die Anzahl der Kerne im $\alpha$-Zustand ($N_{\alpha}$) größer ist als im $\beta$-Zustand, resultiert hieraus eine makroskopische Magnetisierung $\vec{M}_0$.}
\end{minipage}
\end{center}
\end{figure}

\begin{figure}[h,p,t]
\begin{center}
\begin{minipage}[h]{15.5cm}
\centerline{\fbox{\epsfysize=5cm\epsffile{/source/bilder_einleitung/pulses.eps}}}
\caption{\label{pulses} Betrachtung der Auslenkung der makroskopischen Magnetisierung $\vec{M}$ im rotierenden Koordinatensystem $x$'-$y$'-$z$. Durch einen Puls $\vec{B}_1$, welcher senkrecht zu $\vec{B}_0$ angelegt wird, kann die Magnetisierung $\vec{M}$ in die $y$'-$z$-Ebene ausgelenkt werden. Der Auslenkungswinkel $\theta$ ist eine Funktion der Pulsstärke von $\vec{B}_1$ und der Pulsdauer $\tau_\km{P}$. Bei konstanter Pulstärke kann $\tau_\km{P}$ so gewählt werden, dass $\vec{M}$ z.B. um 90 oder 180° ausgelenkt wird.}
\end{minipage}
\end{center}
\end{figure}

Durch einen Störpuls $\vec{B}_1$ kann das System aus seiner Gleichgewichtslage ausgelenkt werden. Dadurch kann das Besetzungsverhältnis zwischen $N_\alpha$ und $N_\beta$ verändert werden, was eine Änderung der Magnetisierung entlang der $z$-Achse, also in longitudinaler Richtung, bewirkt. Weiterhin führt der Puls zu einer Kohärenz zwischen den Spins, welche im Gleichgewicht zufällig auf der Oberfläche eines Kegelmantels verteilt sind. Dies bewirkt eine transversale Magnetisierung in der $x$-$y$-Ebene. Wechselt man von einem unbewegten in ein um die $z$-Achse rotierendes Koordinatensystem $x$'-$y$'-$z$, so wird durch ein Puls aus $x$'-Richtung die makroskopische Magnetisierung in die $y$'-$z$-Ebene gedreht. Bei konstanter Pulsstärke kann durch Variierung der Pulslängen $\vec{M}$ um definierte Winkel ausgelenkt werden (vgl. Abb. \ref{pulses}).

Nach dem Abschalten des Anregungspulses, kehrt das System wieder in das thermodynamische Gleichgewicht zurück. Dies kann über zwei Wege geschehen: Durch Spin-Spin-Wechselwirkungen, welche rein entropisch sind und keinen Energieumsatz leisten, kann die transversale Magnetisierung mit einer charakteristischen Relaxationszeit $T_2$ wieder ins Gleichgewicht zurückkehren.  Spin-Gitter-Wechselwirkungen, d.h. Interaktionen des Spins mit der Umgebung, ermöglichen die longitudinale Relaxation mit der Relaxationszeit $T_1$.
Betrachtet man die Situation in einem mit der Larmorfrequenz $\omega_0 = \gamma B_0$ rotierenden Koordinatensystem unmittelbar nach Abschalten des Pulses , so wird jede Spinsorte mit einer charakteristischen relativen Frequenz $\Omega$ beginnen, um die z-Achse zu präzedieren. Im ruhenden System kann dies durch eine Spule als zeitabhängiges Signal, den sog. FID (engl.: {\it free induction decay}), gemessen werden.

\begin{figure}[h,t]
\begin{center}
\begin{minipage}[h]{15.5cm}
\centerline{\fbox{\epsfysize=4.5cm\epsffile{/source/bilder_einleitung/spin_evolution.eps}}}
\caption{\label{spin_evolution} Nach Applikation eines $90°_\km{x}$-Pulses wird die Magnetisierung im rotierenden Koordinatensystem in die $y$'-$z$-Ebene ausgelenkt. Betrachtet man nur eine Sorte Spins, so wird die Magnetisierung nach Abschalten des Pulses um die $z$-Achse mit der Frequenz $\Omega$ präzedieren. Dies kann von einem phasenempfindlichen Detektor als zwei Komponenten $I_y cos(\Omega t)$ und $I_x sin(\Omega t)$ detektiert werden. (Ansicht aus Richtung der +$z$-Achse; $\Omega$ ist die relative Rotationsfrequenz $\omega - \omega_0$).}
\end{minipage}
\end{center}
\end{figure}

Das Gesamtsignal $S(t)$, das gemessen wird, ist die Summe dieser Beiträge aller Spinsorten $i$ multipliziert mit den jeweiligen Amplituden $a_\km{i}$ sowie dem Zerfallsterm $\km{e}^{-t / T_{\km{2,} i}}$:

\begin{eqnarray}
S(t) &=& \sum_\km{i} a_\km{i} (\km{cos}(\Omega_{i} t) + i \km{sin}(\Omega_{i} t) \km{e}^{-t / T_{\km{2}, i}} \nonumber \\ &=& \km{e}^{i \Omega_{i} t} \km{e}^{-t / T_{\km{2}, i}}
\end{eqnarray}

Durch Fouriertransformation von $S(t)$ kann das Frequenzspektrum $S(\omega)$ erhalten werden:

\begin{equation}
S(\omega) = \int_{-\infty}^{\infty} S(t) cos(\omega t) dt
\end{equation}



\subsection{2D-Spektren}
Bei 2D-NMR-Spektren wird die Intensität eines Signals als Funktion zweier Frequenzen gemessen, d.h. bei der Messung müssen zwei Zeitdomänen detektiert werden, mit denen über eine Fourier-Transformation die Frequenzen erhalten werden können. Dies wird durch eine Erweiterung der Pulsfrequenz erreicht: Es wird eine variable Evolutionszeit $t_\km{1}$ eingeführt, in der die Spins untereinander wechselwirken können. Das grundlegende 2D-Experiment besteht demnach aus Präparationsphase, Evolutionsphase, Mischphase und Detektionsphase. In der Präparationsphase werden die Spins nach erfolgter thermischer Relaxation durch einen oder mehrere Puls(-e) angeregt. In der folgenden Evolutionsphase können sich die Spins durch Wechselwirkung mit dem statischen Magnetfeld $B_\km{0}$ oder untereinander entwickeln. Die Mischzeit ist so beschaffen, dass die gewünschte Korrelation in der Detektionsphase in Form von transversaler Magnetisierung vorliegt. Ein 2D-Experiment ist also eine Abfolge von 1D-Experimenten, in denen $t_\km{1}$ inkrementiert wird, aus denen man ein Array von FIDs erhält, die durch Fourier-Transformation nach $t_\km{2}$ und $t_\km{1}$ das 2D-Spektrum ergeben. Im Folgenden sollen die Pulsfolgen der 2D-NMR-Methoden besprochen werden, welche in dieser Arbeit eingesetzt werden.

\begin{figure}[h]
\begin{center}
\begin{minipage}[h]{15.5cm}
\centerline{\fbox{\epsfysize=7cm\epsffile{/source/bilder_einleitung/COSY_NOESY_puls.eps}}}
\caption{\label{COSY_NOESY_puls} Pulssequenzen der homonuklearen COSY- (A) und NOESY (B)-Methode.}
\end{minipage}
\end{center}
\end{figure}

Die homonukleare 2D-COSY-Methode erlaubt die Bestimmung skalarer Kopplungen zwischen den Protonen einer Probe. Betrachtet man z.B. zwei skalar koppelnde Kerne A und X, so werden nach Applikation eines 90°-Pulses (Abb. \ref{COSY_NOESY_puls}) die makroskopischen Magnetisierungsvektoren $\vec{M}_\km{A}$ und $\vec{M}_\km{X}$ in die $x$-$y$-Ebene gedreht. Da die beiden Spezies jedoch skalar miteinander koppeln, werden die entsprechenden Vektoren in der $x$-$y$-Ebene mit den vier Frequenzen $\omega_\km{A} \pm$ $J$(A,X)/2 und $\omega_\km{X} \pm$ $J$(A,X)/2 rotieren. Durch diese Unterschiede werden die vier Vektoren sich in der $x$-$y$-Ebene auffächern. Der zweite 90°-Puls dreht die $y$-Komponenten in die +$z$- bzw- -$z$-Richtung. Wieviel Magnetisierung dabei transferiert wird, hängt von $t_\km{1}$ ab. Die verbliebene Magnetisierung der $x$-Komponente, welche ebenfalls von $t_\km{1}$, $\omega_\km{A}$, $\omega_\km{B}$ und J(A,X) abhängt, kann als FID detektiert werden.

Um räumliche Nähe zwischen zwei Protonen nachzuweisen und zu quantifizieren, wird die homonukleare 2D-NOESY-Methode verwendet. Wie oben bereits angedeutet, verläuft die Relaxation eines Spins in $z$-Richtung über Wechselwirkungen mit seiner Umgebung. Um diesen Anteil herauszufiltern, wird zunächst die makroskopische Magnetisierung mit einem 90°-Puls in die $x$-$y$-Ebene ausgelenkt (Abb. \ref{COSY_NOESY_puls} B). Innerhalb der Evolutionszeit $t_\km{1}$ können die Spins wechselwirken. Durch einen 90°-Puls werden die Spins in die -$z$-Richtung gedreht und können während der sog. Mischzeit $d$2 Magnetisierung mit der Umgebung austauschen. Ein letzter 90°-Puls dreht die verbliebenen Spins zurück in die $x$-$y$-Ebene, wo sie als FID gemessen werden können.

\begin{figure}[h]
\begin{center}
\begin{minipage}[h]{15.5cm}
\centerline{\fbox{\epsfysize=5.5cm\epsffile{/source/bilder_einleitung/HSQC_puls.eps}}}
\caption{\label{HSQC_puls} Grundlegende Pulssequenz der HSQC-Methode.}
\end{minipage}
\end{center}
\end{figure}

Neben homonuklearen sind aber auch heteronukleare Wechselwirkungen detektierbar. Derlei Spektren sind insbesondere bei der Zuordnung von Signalen von großem Wert. Eine grundlegende Methode ist hier das sog. HSQC-Experiment, welches auf der INEPT-Sequenz basiert (siehe Abb. \ref{HSQC_puls}). Hiermit ist es möglich, skalare Konnektivitäten zwischen Wasserstoff- und Kohlenstoffatomen nachzuweisen, mit der HMBC-Pulssequenz können sogar Konnektivitäten über mehrere Bindungen hinweg bestimmt werden. Durch einen 90°-Puls wird die Magnetisierung der Wasserstoffe $\vec{M_\km{H}}$ in die $x$-$y$-Ebene ausgelenkt. Falls jedoch eine Kopplung mit $^\km{13}$C-Kernen im $\alpha$- bzw. $\beta$-Zustand besteht, werden aber zwei Magnetisierungen $\vec{M}_\km{H}^\km{C_\alpha}$ und $\vec{M}_\km{H}^\km{C_\beta}$ vorhanden sein, deren Frequenzen um $J(\km{C, H})$ voneinander abweichen. Nach einer Pause von $d2 = 1 / (4 J(\km{C, H}))$ wird die Phasendifferenz zwischen diesen beiden Vektoren 90° sein und ein 180°-Puls wird auf beiden Kanälen appliziert. Dies lenkt die Magnetisierung der Kohlenstoffkerne in die $-z$-Richtung aus, d.h. $^\km{13}$C-Kerne im $\alpha$-Zustand wechseln zum $\beta$-Zustand und umgekehrt. Dementsprechend wird $\vec{M}_\km{H}^\km{C_\alpha}$ zu $\vec{M}_\km{H}^\km{C_\beta}$ und $\vec{M}_\km{H}^\km{C_\beta}$ zu $\vec{M}_\km{H}^\km{C_\alpha}$. Nach einer weiteren Pause von $d2 = 1 / (4 J(\km{C, H}))$ beträgt die Phasendifferenz zwischen beiden Vektoren 180° und ein 90°-Puls rotiert $\vec{M}_\km{H}^\km{C_\alpha}$ in die $+z$- und $\vec{M}_\km{H}^\km{C_\beta}$ in die $-z$-Richtung. Die Magnetisierungen der Kohlenstoffkerne $\vec{M}_\km{C}^\km{H_\alpha}$ und $\vec{M}_\km{C}^\km{H_\beta}$ liegen ebenfalls um 180° phasenverschoben vor, allerdings in der transversalen Ebene. Nun können sich $\vec{M}_\km{C}$-Vektoren während einer variierenden Zeit $t_1$ entwickeln, während ein 180°-Puls dafür sorgt, dass die beiden Vektoren $\vec{M}_\km{H}^\km{C_\alpha}$ und $\vec{M}_\km{H}^\km{C_\beta}$ am Ende von $t_1$ antiparallel vorliegen. Ein 90°-Puls lenkt die $\vec{M}_\km{C}$-Vektoren in $z$-Richtung aus und invertiert so die Populationen $N_\alpha$ und $N_\beta$ der Kohlenstoffkerne, was dazu führt, dass die Magnetisierungen $\vec{M}_\km{H}^\km{C_\alpha}$ und $\vec{M}_\km{H}^\km{C_\alpha}$ wechseln. Ähnlich wie oben die Polarisation von den Wasserstoffen zu den Kohlenstoffen übertragen wurde, wird nun in einer umgekehrten INEPT-Operation die Polarisation auf die Wasserstoffe übertragen. Nun liegen die zwei $\vec{M}_\km{H}$-Vektoren in Antiphase vor und sind durch die $^\km{13}$C-Resonanzen moduliert. Nach einer Dauer von $2 \cdot d2$ liegen $\vec{M}_\km{H}^\km{C_\alpha}$ und $\vec{M}_\km{H}^\km{C_\beta}$ refokussiert vor und können als FID gemessen werden (der abschließende 180°-Puls dient nur zur Signalverbesserung).


\subsection{Das NMR-Spektrum von Proteinen}
Prinzipiell ist die NMR-Spektroskopie in der Lage, jeden Atomkern mit einer Kernspinquantenzahl ungleich Null bzw. im Falle der $^1$H-NMR jedes Proton in einem Protein zu detektieren. Da diese jedoch sehr komplexe, große Moleküle sind, limitieren diese Randbedingungen durch Überlagerungen von Signalen die Informationen, die man einem NMR-Spektrum entnehmen kann.
Die Peptidbindung und die Natur der Aminosäurenseitenketten bestimmen im Wesentlichen das Aussehen eines Protein-Spektrums: Abb. \ref{HEL_COSY} zeigt das Konturdiagramm eines 2D-COSY-Spektrums von HEL. Die Bereiche, in denen typischerweise bestimmte skalare Kopplungen vorzufinden sind, sind mit Rechtecken markiert. Diese Verteilung ist nicht nur für Proteine, sondern auch für Polypeptide wie GVG(VPGVG)$_\km{3}$, gültig.

\begin{figure}[h]
\begin{center}
\begin{minipage}[h]{15.5cm}
\centerline{\fbox{\epsfysize=13cm\epsffile{/source/bilder_einleitung/HEL_COSY_com.eps}}}
\caption{\label{HEL_COSY} 2D-COSY-Spektrum von HEL. Rechtecke markieren die Bereiche, in denen die angegebenen Kopplungen typischerweise zu finden sind.}
\end{minipage}
\end{center}
\end{figure}

Im Tiefeldbereich liegen hauptsächlich die Kreuzkorrelationssignale aliphatischer Protonen unpolarer Seitenketten. Mit ansteigendem Feld finden sich zunehmend die Signale entschirmter Protonen und im Bereich 3-6 ppm, wo sich auch das Signal der Wasserprotonen befindet, liegen zumeist die Signale der entschirmten $\alpha$-Protonen. Im Hochfeldbereich befinden sich die Signale aromatischer Protonen im  Bereich um 7 ppm und die Signale der Amidprotonen im selbigen Bereich und höher. Daher sind die Kreuzkorrelationssignale der Amid- und $\alpha$-Protonen in dem Bereich zu finden, der im 2D-Spektrum durch die Frequenzbereiche von 3-6 ppm und 6-10 ppm definiert ist. Diese sind von speziellem Interesse, da sie es sind, welche die Protonenaustausch-$^1$H-NMR ermöglichen: der Austausch von Amidprotonen durch Deuteronen macht sich im oben genannten Bereich durch eine Abnahme der Signalintensität bemerkbar.




\section{Protonen-Austausch $^1$H-NMR}
Die Protonen-Austausch-$^1$H-NMR ermöglicht auf relativ einfache Weise, Strukturänderungen in Proteinen nachzuweisen. Grundlegendes Prinzip ist, dass das gewünschte Protein in Deuteriumoxid-Puffer gelöst und den zu untersuchenden Bedingungen (z.B. Hitze, Chemikalien) ausgesetzt wird. Labile Protonen, welche an der Oberfläche des Proteins dem Deuteriumoxid ausgesetzt und auch nicht über Wasserstoffbrücken stabilisiert sind, werden sehr schnell durch Deuteronen ersetzt, während Protonen, welche sich im Innern bzw. in strukturierten Bereichen des Proteins befinden oder durch Wasserstoffbrücken stabilisiert sind, wesentlich langsamer austauschen. Die Austauschrate $k_\km{obs.}$ eines Amidprotons enthält also Informationen über den Grad an nativer Struktur in seiner Umgebung. Um diese quantitativ abzuschätzen, muss die Austauschrate $k_\km{rc}$ desselben Amidprotons in der Zufallsknäuelkonformation bekannt sein; d.h. für dasselbe Amidproton muss die Austauschrate als Funktion des pHs, der Temperatur und der flankierenden Seitenreste berechenbar sein.
Zunächst einmal wird die Gesamtaustauschrate $k_\km{ex}$ die Summe der einzelnen Austauschraten $k_\km{A}$, $k_\km{B}$ und $k_\km{W}$ der am Austausch beteiligten Katalysatoren sein, hier der Säure A (D$^\km{+}$), der Base B (OD$^\km{-}$) und dem wasservermittelten Austausch W (D$_\km{2}$O) \cite{Bai1993}:

\begin{eqnarray}
k_\km{ex} &=& k_\km{A} 10^\km{-pD} + k_\km{B} 10^\km{pD - pK_\km{D}} + k_\km{W} \nonumber \\ &=& k_\km{S"aure} + k_\km{Base} + k_\km{Wasser}
\end{eqnarray}

wobei $K_\km{D}$ die Dissoziationskonstante von D$_\km{2}$O ist. Der Einfluss benachbarte Seitenketten wird durch empirisch ermittelte Werte $A_\km{L}$, $A_\km{R}$, $B_\km{L}$ und $B_\km{R}$ berücksichtigt, wobei die Indices R und L andeuten, dass der Rest in Richtung des Amino-Terminus bzw. des Carboxyl-Terminus des betrachteten Amids liegt und $A_{i}$ und $B_{i}$ für die flankierenden Aminosäurereste spezifische Konstanten sind. Die zu erwartende Austauschrate eines Amidprotons in einer Zufallsknäuel-Umgebung ergibt sich damit zu:

\begin{equation}
k_\km{rc} = k_\km{A, ref}(A_\km{L} \times A_\km{R})[\km{D^+}] + k_\km{B, ref}(B_\km{L} \times B_\km{R})[\km{OD^-}] + k_\km{W, ref}(B_\km{L} \times B_\km{R})
\end{equation}

Wobei $k_{i, \km{ref}}$ eine empirisch ermittelte Austausch-Referenzkonstante einer Referenzsubstanz ist (hier: Poly-D/L-Alanin). So können dann die einzelnen Austauschraten, z.B. $k_\km{S"aure}$, berechnet werden:

\begin{equation}
\km{log} (k_{S"aure}) = \km{log} (k_\km{A, ref}) + \km{log} (A_\km{L}) + \km{log} (A_\km{R}) - pD
\end{equation}

Der Einfluss von Temperatur und Druck kann bei bekannter Aktivierungsenergie und bekannten Aktivierungssvolumen berücksichtigt werden \cite{Nash1997}:


\begin{equation}
k_i(T) = k_i(293\km{K}) \km{e}^{-\frac{E_{\km{a,}i}}{R}(\frac{1}{T}-\frac{1}{293})}
\end{equation}

\begin{equation}
k_i(p) = k_i(p_\km{0}) \km{e}^{-\frac{\Delta V^{\km{\neq}}_{i}}{R T}(p - p_\km{0})}
\end{equation}

Mit bekanntem $k_\km{rc}$ und gemessenem $k_\km{obs}$ kann der sog. Schutzfaktor $P$, d.h. der Grad der Abschirmung eines gegebenen Amidprotons verglichen mit demselben Proton in einer Zufallsknäuel-Umgebung, berechnet werden:
\begin{equation}
P = \frac{k_\km{rc}}{k_\km{obs}} \label{P}
\end{equation}


Das bedeutet, je größer $P$, desto strukturierter ist die Umgebung des betreffenden Amid-Protons; Werte um 1 deuten an, dass die Umgebung des Protons einer Zufalls-Knäuel-Konformation gleicht. Für den Schutz gegen Austausch sind hauptsächlich Wasserstoffbrücken und im geringeren Maße auch das {\glqq Verborgensein\grqq} des Amidprotons im Innern des Proteins verantwortlich \cite{Englander1984}. Abb. \ref{P_determination} zeigt ein Schema des Ablaufs eines typischen Protonen-Austausch-Experiments: zunächst wird die Probe den denaturierenden Bedingungen ausgesetzt (Abb. \ref{P_determination} A); in der nativen Form ist der Austausch für die meisten Protonen vernachlässigbar klein, in ungefalteter oder teilweise entfalteter Form wird er aber signifikant. Nach einer definierten Zeit {\it t} wird die Probe entnommen und das Protein faltet sich zurück in die native Form, in der der Austausch vernachlässigbar langsam ist. Nun kann diese Probe im Gefrierschrank aufbewahrt und zu einer beliebigen Zeit das 2D-COSY-Spektrum gemessen werden (Abb. \ref{P_determination} B). Die C-$\alpha$-Amid-Kreuzkorrelationssignale können integriert und gegen die jeweilige Expositionsszeit unter den denaturierenden Bedingungen aufgetragen werden. Es ergibt sich ein logarithmischer Abfall. Je länger die Probe (teil-)entfaltet war, desto mehr Protonen wurden ausgetauscht. Durch die Punkte kann ein logarithmischer Fit der Form

\begin{equation}
I_i(t) =  I_{\km{back,}i} + I_{\km{0,}i} \cdot \km{e}^{-k_{\km{obs,} i} \cdot t} \label{fit}
\end{equation}
gelegt werden (Abb. \ref{P_determination} C), der die gemessene Austauschrate $k_\km{obs}$ des Restes $i$ ergibt (wobei $I(t)$ die Intensität des Kreuzkorrelationssignals zur Zeit t, $I_\km{0}$ die Intensität zur Zeit $t = 0$ und $I_\km{back}$ die zeitunabhängige Hintergrundintensität ist). Die berechnete Austauschrate $k_\km{rc}$ wird durch die gemessene Austauschrate dividiert und ergibt damit den Schutzfaktor $P$ (Abb. \ref{P_determination} D). Der Schutzfaktor kann gegen die Sequenz eines Proteins aufgetragen werden und erlaubt damit eine Übersicht über die strukturierten (hohes $P$) und unstrukturierten Bereiche (niedriges $P$) eines Proteins unter den untersuchten Bedingungen. Im Rahmen des einfachsten Modells interpretiert, korreliert ein Schutzfaktor von 5 mit einer Besetzung von 80 \% mit der Population, welche vollen Schutz bietet; Amidprotonen im nativer Umgebung hingegen können Schutzfaktoren von größer als 10$^\km{6}$ aufweisen \cite{Buck1994}.

\begin{figure}[p,h,t]
\begin{center}
\begin{minipage}[h]{15.5cm}
\centerline{\fbox{\epsfysize=14.5cm\epsffile{/source/bilder_einleitung/P_Schema.eps}}}
\caption{\label{P_determination} Prozess der Schutzfaktorenbestimmung: die Probe wird unter denaturierenden Bedingungen inkubiert (z.B. $\Delta p$: Druckänderung oder $\Delta T$: Temperaturänderung) (A) und das 2D-COSY-Spektrum bestimmt (B). Integration der Amid-C$\alpha$-Korrelations-Signale, deren Werte gegen die Inkubationszeit $t$ aufgetragen werden, liefern einen annähernd logarithmischen Verlauf (C), aus dessen logarithmischer Anpassung die beobachtete Austauschrate $k_\km{obs}$ berechnet werden kann. Zusammen mit $k_\km{rc}$ ergibt sich der Schutzfaktor $P$ (D).}
\end{minipage}
\end{center}
\end{figure}

\clearpage
\newpage


\section{$^{13}$C-T$_1$-Relaxationszeiten}
Wie im Kapitel \ref{NMR_1} bereits erwähnt, ist die longitudinale Relaxation auf Spin-Gitter-Wechselwirkungen zurückzuführen. Die Relaxationszeit $T_\km{1}$ enthält jedoch nicht nur Informationen über die Umgebung eines Spins, sondern auch über die Dynamik, der der Spin unterliegt. Betrachtet man den einfachsten Fall, dass ein $^\km{13}$C-Kern mit einem $^\km{1}$H-Kern dipolar magnetisch koppelt, so ergeben sich die in Abb. \ref{13C_1H} dargestellten Zustände:

\begin{figure}[h]
\begin{center}
\begin{minipage}[h]{15.5cm}
\centerline{\fbox{\epsfysize=6cm\epsffile{/source/bilder_einleitung/T1_13C_1H.eps}}}
\caption{\label{13C_1H} Energieschema der Kopplung eines $^\km{13}$C-Kerns mit einem $^\km{1}$H-Kern. Im Grundniveau zeigen beide Spins in Richtung von $\vec{B_\km{0}}$ ($\alpha \alpha$), im energetisch ungünstigsten Fall zeigen beide in Gegenrichtung ($\beta \beta$). Die möglichen Übergänge zwischen den einzelnen Zuständen sind durch $W_\km{0}$, $W_\km{2}$, $W_\km{1C}$ und $W_\km{1H}$ gekennzeichnet.}
\end{minipage}
\end{center}
\end{figure}


Änderungen der Besetzungsniveaus $N_i$ werden durch folgende Differentialgleichungen beschrieben:

\begin{eqnarray}
\frac{\km{d} N_\km{1}}{\km{d} t} &=& -(W_\km{1H} + W_\km{1C} + W_\km{2})N_\km{1} + W_\km{1C} N_\km{2} + W_\km{1H} N_\km{3} + W_\km{2} N_\km{4} \\ \nonumber \\ \frac{\km{d} N_\km{2}}{\km{d} t} &=& W_\km{1C} N_\km{1} - (W_\km{0} + W_\km{1C} + W_\km{1H})N_\km{2} + W_\km{0} N_\km{3} + W_\km{1H} N_\km{4} \\ \nonumber \\ \frac{\km{d} N_\km{3}}{\km{d} t} &=& W_\km{1H} N_\km{1} + W_\km{0} N_\km{2} - (W_\km{0} + W_\km{1C} + W_\km{1H})N_\km{3} + W_\km{1C} N_\km{4} \\ \nonumber \\ \frac{\km{d} N_\km{4}}{\km{d} t} &=& W_\km{2} N_\km{1} + W_\km{1H} N_\km{2} + W_\km{1C} N_\km{3} - (W_\km{2} + W_\km{1H} + W_\km{1C})N_\km{4}
\end{eqnarray}

Durch Definition der Besetzungszahlen für die $^\km{1}$H- und $^\km{13}$C-Kernniveaus

\begin{eqnarray}
n_\km{C} &=& N_\km{1} - N_\km{2} + N_\km{3} - N_\km{4} \\  n_\km{H} &=& N_\km{1} + N_\km{2} - N_\km{3} - N_\km{4}
\end{eqnarray}

und den Übergangswahrscheinlichkeiten $\rho_\km{H}$, $\rho_\km{C}$ und $\sigma$

\begin{eqnarray}
\rho_\km{H} &=& W_\km{2} + 2W_\km{1H} + W_\km{0} \\ \rho_\km{C} &=& W_\km{2} + 2W_\km{1C} + W_\km{0} \label{rhoC} \\ \sigma &=& W_\km{2} - W_\km{0}
\end{eqnarray}

lassen sich die Änderung der Besetzungszahlen für $^\km{1}$H und $^\km{13}$C separat darstellen:

\begin{eqnarray}
\frac{\km{d} n_\km{H}}{\km{d} t} &=& -\rho_\km{H}(n_\km{H} - n^\km{0}_\km{H}) - \sigma(n_\km{C} - n^\km{0}_\km{C}) \\ \frac{\km{d} n_\km{C}}{\km{d} t} &=& -\rho_\km{C}(n_\km{C} - n^\km{0}_\km{C}) - \sigma(n_\km{H} - n^\km{0}_\km{H})
\end{eqnarray}

\noindent wobei $n^\km{0}_\km{H}$ und $n^\km{0}_\km{C}$ die jeweilgen Besetzungszahlen im thermodynamischen Gleichgewicht sind.  Werden bei der Messung die Protonen entkoppelt, so wird $n_\km{H}$ zu Null und die zeitliche Änderung von $n_\km{C}$ ist nur noch eine Funktion des ersten Terms $\rho_\km{C}$. Der reziproke Wert von $\rho_\km{C}$ bestimmt die longitudinale Relaxationszeit $T_\km{1}$:

\begin{equation}
\frac{1}{\rho_\km{C}} = T_\km{1}
\end{equation}

Mit Hilfe der Störungstheorie können auch die Übergangswahrscheinlichkeiten $W_{i}$ berechnet werden \cite{Kalinowski1984}:

\begin{eqnarray}
W_\km{0}~ &=& \frac{1}{10}K^\km{2}\frac{\tau_\km{c}}{1+(\omega_\km{H} - \omega_\km{C})^\km{2}\tau_\km{c}^\km{2}} \label{W1} \\ \nonumber \\
W_\km{1C} &=& \frac{3}{20}K^\km{2}\frac{\tau_\km{c}}{1+\omega_\km{C}^\km{2}\tau_\km{c}^\km{2}} \\ \nonumber \\
W_\km{1H} &=& \frac{3}{20}K^\km{2}\frac{\tau_\km{c}}{1+\omega_\km{H}^\km{2}\tau_\km{c}^\km{2}} 
\end{eqnarray}
\begin{eqnarray}
W_\km{2} &=& \frac{3}{5}K^\km{2}\frac{\tau_\km{c}}{1+(\omega_\km{H} + \omega_\km{C})^\km{2}\tau_\km{c}^\km{2}} \label{W4} \\ \nonumber \\ \km{mit} \hspace{1cm} K &=& \frac{\gamma_\km{H} \gamma_\km{C}\hbar}{r^\km{3}}
\end{eqnarray}
wobei $\gamma_\km{C}$ und $\gamma_\km{H}$ die gyromagnetischen Verhältnisse von Kohlenstoff bzw. Wasserstoff und $r$ der Abstand zwischen den beiden Kernen ist. $\tau_\km{c}$ ist die Rotationskorrelationszeit, welche als die Zeit definiert ist, die ein Teilchen benötigt, um sich um einen Radian zu drehen. Aus den Gleichungen \ref{W1} bis \ref{W4} und \ref{rhoC} lässt sich für reine dipolare Relaxation unter $^\km{1}$H-Entkopplung im {\it extreme narrowing limit} folgende Relation für $T_\km{1}$ finden:

\begin{equation}
\frac{1}{T_\km{1}} = \left(\frac{4 \pi}{\mu_\km{0}}\right)^2 \frac{n \gamma_\km{H}^\km{2} \gamma_\km{C}^\km{2} \hbar^\km{2}}{r^\km{6}} \tau_\km{c} \label{tauest}
\end{equation}
wobei $n$ die Anzahl der an dem Kohlenstoffatom gebundenen Wasserstoffe und $\mu_\km{0}$ die Permeabilitätskonstante im Vakuum ist. Diese Formel stellt eine gute Näherung für die dipolare Relaxation zwischen direkt verbundenen Kohlenstoff- und Wasserstoffkernen dar, für nicht direkt verbundene Kerne ist sie nur eine grobe Näherung.

\begin{figure}[h,t,p]
\begin{center}
\begin{minipage}[h]{15.5cm}
\centerline{\fbox{\epsfysize=6cm\epsffile{/source/bilder_einleitung/inversion_recovery.eps}}}
\caption{\label{inversion_recovery} Pulsschema des {\it inversion recovery}-Experiments zur Bestimmung der longitudinalen Relaxationszeit $T_\km{1}$ der $^\km{13}$C-Kerne unter Breitbandentkopplung der Protonen.}
\end{minipage}
\end{center}
\end{figure}

\begin{figure}[h,t,p]
\begin{center}
\begin{minipage}[h]{15.5cm}
\centerline{\fbox{\epsfysize=5cm\epsffile{/source/bilder_einleitung/Mz_t.eps}}}
\caption{\label{Mz_t} Zeitlicher Verlauf der Magnetisierung in $z$-Richtung nach Applikation von $p$1.}
\end{minipage}
\end{center}
\end{figure}

$T_\km{1}$ ist also invers proportional zur Rotationskorrelationszeit $\tau_\km{c}$ und damit ein direktes Maß für die Beweglichkeit eines Kerns bzw. seiner direkten Umgebung. Aufgrund der inversen Proportionalität zu $\tau_\km{c}$ ist $T_\km{1}$ proportional zur Rate der Drehbewegung der Teilchen, sodass für $T_\km{1}$ die Arrhenius-Gleichung gilt \cite{Cheetham1996}:

\begin{equation}
\km{ln} (T_\km{1}) = \left( - \frac{E_\km{a}}{\km{R}} \right) \frac{1}{T} + \km{ln} A \label{T1Arrhenius}
\end{equation}

Experimentell wird $T_\km{1}$ über die sog. {\it inversion recovery}-Pulssequenz bestimmt. Abb. \ref{inversion_recovery} zeigt die Pulssequenz dieser Methode: nach einer Wartezeit $d$1, die mindestens 5 $\times T_\km{1}$ betragen sollte, damit die $z$-Magnetisierung wieder in das thermodynamische Gleichgewicht relaxieren kann, wird ein 180°-Puls auf die $^\km{13}$C-Spins appliziert; die $^\km{1}$H-Kerne werden während der ganzen Messung entkoppelt. In der Pause $d$2 können die Spins aus der $-z$-Richtung in die $+z$-Richtung relaxieren. Ein 90°-Puls kippt die verbliebenen Spins in die $x$-$y$-Ebene, wo sie als FID registriert werden. Das Intervall $d$2 wird inkrementiert, so dass man 1D-Spektren als Funktion dieser Intervalldauer erhält: direkt nach Applikation des Pulses $p$1 - d.h. bei kleinen $d$2-Werten - wird die Magnetisierung in $-z$-Richtung liegen und mit wachsendem $d$2 wird sie zurück zur $+z$-Richtung, ins thermodynamische Gleichgewicht, relaxieren (vgl. Abb. \ref{Mz_t}). Die Höhe der Signale im Spektrum kann ausgemessen und gegen die Zeit $t$ aufgetragen werden. Durch eine Anpassung  gemäß der Formel

\begin{equation}
M_\km{z}(t) = M_\km{0}(1 - 2 \km{e}^{-\frac{t}{T_\km{1}}}) \label{T1fit}
\end{equation}
kann dann $T_\km{1}$ bestimmt werden (wobei $M_\km{0}$ die Gleichgewichtsmagnetisierung ist).


\section{DSC und PPC}
DSC ({eng.: \it differential scanning calorimetry}) und PPC (engl.: {\it pressure pertubation calorimetry}) sind zwei mikrokalorimetrische Verfahren, um die Wärmekapazität bzw. den thermischen Ausdehnungskoeffizienten $\alpha$ eines Biomoleküls in Abhängigkeit der Temperatur $T$ zu bestimmen. Bei der DSC wird eine Probe und eine Referenzprobe langsam im Quasigleichgewicht erhitzt und durch Abgleich mit der Referenzprobe der reversible Nettowärmefluss $\Delta Q_\km{rev.}$ in Abhängigkeit der Temperatur $T$ bestimmt \cite{Plotnikov1997}.

Das Integral des DSC-Signals ergibt die kalorimetrische Enthalpie $\Delta H_\km{cal}$ des Übergangs \cite{Heerklotz2002}:

\begin{equation}
\Delta H_\km{cal} = \int_{T < T_\km{m}}^\km{T > T_\km{m}} C_\km{p} \km{d} T
\end{equation}

Hierbei ist $T_\km{m}$ die mittlere Temperatur des Übergangs. Neben der kalorimetrischen Enthalpie $\Delta H_\km{cal}$ kann eine effektive, sog. van't-Hoff-Enthalpie $\Delta H_\km{H}$ auf Basis eines Zwei-Zustands-Modells berechnet werden. Bei $T_\km{m}$ gilt \cite{Privalov1979}:

\begin{equation}
\Delta H_\km{H} = 4 R T^2 \frac{\Delta C_\km{p, m}(T)}{Q_\km{m}}
\end{equation}
wobei $\Delta C_p$ die Differenz der Wärmekapazitäten nach und vor dem Übergang ist. Übereinstimmende $\Delta H_\km{H}$- und $\Delta H_\km{cal}$-Werte deuten auf einen hochkooperativen Zwei-Zustands-Übergang hin.

Bei der PPC wird $\Delta Q_\km{rev.}$ gemessen, welche nach einem Drucksprung $\Delta p$ umgesetzt wird. Dies erlaubt nicht nur die Berechnung von $\alpha$, sondern hierdurch auch die Bestimmung der relativen Volumenänderung $\Delta V / V$ \cite{Ravindra2003}:

\begin{eqnarray}
\alpha &=& \frac{\Delta Q_\km{rev.}}{T V \Delta p} \\ \nonumber \\
\frac{\Delta V}{V} &=& \int_{T < T_\km{m}}^\km{T > T_\km{m}} \alpha_{  } d T
\end{eqnarray}

Auf diese Art und Weise kann die relative Volumenänderung $\Delta V / V$ bei der Entfaltung eines Proteins sehr genau bestimmt werden. $\alpha$ von Proteinen oder Peptiden stellt auch ein Maß für die Unterscheidung zwischen hydrophiler sowie hydrophober Hydratisierung dar: während $\alpha$ für hydrophile Seitenketten in wäßriger Lösung mit steigender Temperatur sinkt, nimmt $\alpha$ für hydrophobe Seitenketten zu \cite{Lin2002}.

\clearpage
\newpage


