\chapter{Ergebnisse}

\section{Hitze- und Kältedestabilisierung von HEL}
\subsection{DSC-, PPC- und $^\km{1}$H-NMR-Messungen der Hitzedenaturierung} \label{DSC}
Abb. \ref{heat_DSC} zeigt den Verlauf von $C_p$ mit der Temperatur $T$ für eine HEL-Lösung bei Hitzdenaturierung. Für die hier gewählten Bedingungen ergibt sich eine Übergangstemperatur $T_\km{m}$ von etwa 70~°C und eine Entfaltungsenthalpie $\Delta H_\km{cal}$ von 465 kJ/mol. Es ist ersichtlich, wie erwartet, dass die Wärmekapazität $C_p$ für den entfalteten Zustand höher ist, da das entfaltete Protein eine höhere ASA hat und demgemäß stärker hydratisiert ist. Die Differenz $\Delta C_{p}$ beträgt 6,2 kJ/(K$\cdot$mol). Das Signal ist symmetrisch, was auf einen Zweizustands-Übergang hindeutet. Dies wird durch den Vergleich von $\Delta H_\km{cal}$ und $\Delta H_\km{H}$ bestätigt:

\begin{equation}
\frac{\Delta H_\km{cal}}{\Delta H_\km{H}} = \frac{465}{470} \approx 0,99 \nonumber
\end{equation}
\vspace{0.3cm}

Aus mikrokalorimetrischer Sicht spricht also alles für einen Übergang ohne Intermediate, d.h. für eine hochkooperative Entfaltung im Rahmen eines Zweizustandmodells.

\begin{figure}[p,h]
\begin{center}
\begin{minipage}[h]{15.5cm}
\centerline{\fbox{\epsfysize=9cm\epsffile{/source/bilder_ergebnisse/heat_DSC.eps}}}
\caption{\label{heat_DSC} DSC-Kurve einer HEL-Lösung (5 mg/ml; 20 mM Citrat pD 3,4). Die Übergangstemperatur $T_\km{m}$ beträgt 70 °C und die durch Integration errechnete Enthalpieänderung $\Delta H_\km{cal}$ ist gleich 465 kJ/mol.}
\end{minipage}
\end{center}
\end{figure}

\begin{figure}[p,h]
\begin{center}
\begin{minipage}[h]{15.5cm}
\centerline{\fbox{\epsfysize=9cm\epsffile{/source/bilder_ergebnisse/heat_PPC.EPS}}}
\caption{\label{ppc} PPC-Kurve der Hitzedenaturierung von HEL.}
\end{minipage}
\end{center}
\end{figure}

\clearpage

In der PPC-Kurve (Abb. \ref{ppc}) fällt $\alpha$ im Bereich von 10 bis 50 °C stark ab, was man auf die Abnahme hydrophiler Hydratisierung des nativen Proteins sowie eine abnehmende Expansivität des {\it void}-Volumens des Proteins zurückführen kann \cite{Lin2002}. Die Entfaltung findet hier übereinstimmend mit den DSC-Daten bei etwa 70 °C statt mit netto leicht erhöhtem $\alpha$ im $D$-Zustand. Man berechnet ein $\Delta V / V $ von -1,1 $\cdot \km{10^{-3}}$. Am Profil der PPC-Kurve läßt sich ebenfalls kein Intermediat belegen. Im Rahmen der Genauigkeit ist nur ein Übergang sichtbar. Zunächst zeugt der Abfall von $\alpha$ von einer Abnahme der hydrophilen Hydratisierung, dann erfolgt eine abrupte Änderung von $\alpha$ im Bereich um 70 °C durch die Entfaltung des Proteins, bei dem sich die ASA stark erhöht und hydrophile als auch hydrophobe Aminosäurereste, welche zuvor im Inneren des Proteins verborgen waren, exponiert und hydratisiert werden.

\begin{figure}[h,t,p]
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\begin{minipage}[h]{15.5cm}
\centerline{\fbox{\epsfysize=9cm\epsffile{/source/bilder_ergebnisse/H15_1DNMR.eps}}}
\caption{\label{IH15} Relative Intensität des Histidin 15-Signals im $^\km{1}$H-1D-NMR-Spektrum im nativen ($N$) und entfaltenen Zustand ($D$) als Funktion der Temperatur.}
\end{minipage}
\end{center}
\end{figure}

Die Bestimmung der Hitzdenaturierung mittels $^\km{1}$H-NMR bestätigen im Wesentlichen die Ergebnisse der mikrokalorimetrischen Messungen. Abb. \ref{IH15} zeigt die relative Intensität des Histidin 15 im nativen und im denaturierten Zustand bei unterschiedlichen Temperaturen. Aus diesen Daten wurde $\Delta G_\km{unf.}$ berechnet und gegen die jeweilige Temperatur aufgetragen, wie es Abb \ref{dGheat} zu entnehmen ist. Auch hier ergibt sich das Bild eines kooperativen Überganges mit zwei Zuständen. Die hier ermittelte Entfaltungsenthalpie $\Delta H_\km{unf.}$ von 410 kJ $\km{mol^{-1}}$ deckt sich zwar nicht mit der mittels DSC ermittelten, doch beträgt die Abweichung nur ca. 13 \%, was angesichts der unterschiedlichen verwendeteten Methoden als zufriedenstellend zu bezeichnen ist. Die Übergangstemperatur $T_\km{m}$ von etwa 70 °C stimmt mit der über DSC bestimmten Temperatur der Entfaltung überein.

\begin{figure}[h,t,p]
\begin{center}
\begin{minipage}[h]{15.5cm}
\centerline{\fbox{\epsfysize=7cm\epsffile{/source/bilder_ergebnisse/Heat_1HNMRdG.eps}}}
\caption{\label{dGheat} $\Delta G_\km{unf.}$ als Funktion der Temperatur (5~\% HEL; 20 mM Citrat pD 3,4). Durch die Werte wurde mittels linearer Regression eine Ausgleichsgerade gelegt, aus deren Achsenabschnitt und Steigung $\Delta H_\km{unf.}$ und $\Delta S_\km{unf.}$ berechnet wurden.}
\end{minipage}
\end{center}
\end{figure}

\subsection{{\it P}-Faktoren der Hitzdenaturierung} \label{HitzeP}

Abb. \ref{heatkin} zeigt die relative Intensität einiger C$_\alpha$-Amid-Kreuzkorrelationssignale als Funktion der Exponierzeit der Probe unter hitzedenaturierenden Bedingungen. Die Abnahme der Intensität kann in drei Phasen unterteilt werden: Zuerst findet sich eine langsame, annähernd lineare Änderung, welche man als Äquilibrierphase, in der die Probe die Wärme des Hitzebades aufnimmt, interpretieren kann. Es folgt eine im Rahmen der Genauigkeit logarithmische Abnahme, auf der eine abschließende zweite, wesentlich schnellere folgt. Diese beiden letzten kinetischen Komponenten repräsentieren strukturelle Änderungen im HEL-Molekül, wobei der langsameren Komponente ein höherer Grad an Struktur als der schnelleren entspricht. In der Tat errechnen sich für die erste kinetische Komponente eine größere Anzahl von $P$-Faktoren, welche größer als 5 sind (siehe Abb. \ref{heat_P}), während für die letzte, abschließende kinetische Komponente alle $P$-Faktoren kleiner als 1 sind. Das Vorkommen von Werten unterhalb von 1 liegt wohl darin begründet, dass im Experiment die Probe nach der Hitzeexponierung in einem Eisbad gekühlt wurden, was keine sofortige Abkühlung auf tiefere Temperaturen gewährleistete, sondern wenige Sekunden in Anspruch nahm, in denen ein weiterer Austausch erfolgte. Die Rate dieser zusätzlichen Protonensubstitution ist dabei von der Austauschrate des einzelnen Amids abhängig - je schneller, desto größer die Abweichung - und läßt sich schwer quantifizieren. Insgesamt führt dies jedoch zu etwas überhöhten $k_\km{obs.}$-Werten, was wiederum in zu niedrigen $P$-Faktoren resultiert. Es lässt sich für die letzte Phase des Austausches unter hitzedenaturierenden Bedingungen zusammenfassend sagen, dass die $P$-Faktoren sehr niedrig sind und auf eine Konformation deuten, die der Zufallsknäuel-Konformation entspricht und dementsprechend mit der vollständig entfaltete Form $D$ identifiziert werden kann.

\begin{figure}[t]
\begin{center}
\begin{minipage}[h]{15.5cm}
\centerline{\fbox{\epsfysize=7cm\epsffile{/source/bilder_ergebnisse/Heat_kinetik.eps}}}
\caption{\label{heatkin} Auftragung der relativen Intensität der C$_\alpha$-Amid-Korrelations-Signale gegen die Verweilzeit unter hitzedenaturierenden Bedingungen (5~\% HEL; 20 mM Citrat pD 3,4; 80 °C). Der Rest Cystein 64 ist über eine Disulfidbrücke mit dem Cystein 80 verknüpft (S-S), das Asparagin 44 befindet sich in dem dreifaltigen $\beta$-Faltblatt ($\beta$), Leucin 84 befindet sich in einer $3_\km{10}$-Helix ($3_\km{10}$) und Arginin 114 in einer $\alpha$-Helix ($\alpha$).}
\end{minipage}
\end{center}
\end{figure}

Der mittleren kinetischen Komponente entspricht offensichtlich ein Intermediat, welches noch ein Rest an nativer Struktur besitzt: Hoher Schutz gegen Protonenaustausch findet sich bei bzw. nahe den disulfidverbrückten Cysteinen 64 und 94, aber auch entlang dem $\beta$-Faltblatt finden sich nennenswert hohe $P$-Faktoren um 7. Im Gegensatz zu den DSC- und PPC-Messungen, welche kein Intermediat bei der Hitzedenaturierung aufzeigten, lässt sich über die Protonen-Austausch-NMR auf ein Intermediat schließen. Da letztere Experimente kinetisch durchgeführt wurden, d.h. nicht im thermodynamischen Gleichgewicht, könnte eine Erklärung für diesen Befund sein, dass das Intermediat nicht thermodynamisch stabil, sondern transient und so für die mikrokalorimetrische Methode {\glqq unsichtbar\grqq} ist.


\begin{figure}[p,h,t]
\begin{center}
\begin{minipage}[h,t,p]{15.5cm}
\centerline{\fbox{\epsfysize=9cm\epsffile{/source/bilder_ergebnisse/Heat_ohne_P.eps}}}
\caption{\label{heat_P} Auftragung der $P$-Faktoren gegen die Sequenz von HEL, welche auf Basis des $k_\km{obs.}$ der intermediären Phase berechnet wurden. Unterhalb der Sequenznummern befinden sich Pfeile, welche die Bereiche der einzelnen Sekundärstrukturelemente markieren: A, B, C und D markieren die Bereiche der vier Haupt-$\alpha$-Helices, $\beta$ das $\beta$-Faltblatt, $\km{3_{10}}$ die $\km{3_{10}}$-Helices und {\glqq loop\grqq} Bereiche mit Schleifenmotiven. Die Doppelpfeile im oberen Teils des Diagramms zeigen die Verknüpfung der Sequenzen über Disulfidbrücken (S-S) an.}
\end{minipage}
\end{center}
\end{figure}

\begin{figure}[p,h,t]
\begin{center}
\begin{minipage}[p]{15.5cm}
\centerline{\fbox{\epsfysize=6cm\epsffile{/source/bilder_ergebnisse/Heat_sorb_kinetik.eps}}}
\caption{\label{heatsorbkin} Änderung der relativen C$_\alpha$-Amid-Kreuzsignalintensität von HEL gegen die Zeit unter hitzedenaturierenden Bedingungen bei Anwesenheit von Sorbitol für die Aminosäurereste Cystein~64 und Asparagin~44 (5~\% HEL; 20 mM Citrat pD 3,4; 500 mM Sorbitol; 80 °C).}
\end{minipage}
\end{center}
\end{figure}
\clearpage
\newpage

Die Protonenaustausch-Experimente wurden bei Anwesenheit von 500 mM Sorbitol wiederholt, Abb. \ref{heatsorbkin} zeigt das Voranschreiten des Protonenaustausches mit der Verweilzeit im Hitzebad. Der Zusatz von Sorbitol verschlechterte die Spektrenqualität, weshalb die Werte mehr streuen als in Abb. \ref{heatkin} und weshalb der Übersicht halber nur Daten von zwei Aminosäureresten dargestellt sind. Auch konnten weniger COSY-Kreuzkorrelationssignale aufgelöst werden, so dass insgesamt weniger $P$-Faktoren berechnet werden konnten. Verglichen mit dem Verlauf des Austausches ohne Sorbitol konnte hier nur für einzelne Amidprotonen nach der Äquilibrierungsphase zwei distinkte Abnahmen mit annähernd logarithmischen Verlauf gefunden werden, die meisten Kurven fallen, ähnlich wie es in Abb. \ref{heatsorbkin} die Werte des Asparagin 44 beschreiben, gemäß einer einzelnen logarithmischen Kinetik ab. Die abschließende, schnelle kinetische Phase, welche oben als die endgültige Entfaltung von HEL interpretiert wurde, fehlt bzw. ist nicht auflösbar. Dies ist wahrscheinlich auf die niedrigere Spektrenqualität zurückzuführen, weshalb für die Daten jeweils nur ein $k_\km{obs.}$ berechnet wurde, das der Bildung des intermediären Zustandes zugeordnet wird. Die entsprechenden $P$-Faktoren wurden berechnet und, um die Werte mit den Schutzfaktoren bei Abwesenheit von Sorbitol zu vergleichen, von den $P$-Faktoren der Hitzdenaturierung im reinen Puffer subtrahiert.

\begin{figure}[t,h,p]
\begin{center}
\begin{minipage}[h]{15.5cm}
\centerline{\fbox{\epsfysize=8cm\epsffile{/source/bilder_ergebnisse/Heat_P_difference.eps}}}
\caption{\label{heatPdiff} Differenz der $P$-Faktoren des kinetischen Intermediates von HEL im reinen Puffer ($P_\km{Puffer}$) und bei Anwesenheit von 500 mM Sorbitol ($P_\km{Sorbitol, Puffer}$). Im Rahmen der Messgenauigkeit ergeben sich keine relevanten Differenzen.}
\end{minipage}
\end{center}
\end{figure}

Abb. \ref{heatPdiff} zeigt die so erhaltenen Differenzen in Abhängigkeit der Aminosäureposition von HEL. Es ist ersichtlich, dass im Rahmen der Messgenauigkeit kaum Unterschiede bestehen, d.h das Sorbitol die strukturelle Rigidität des Intermediates kaum - wenn überhaupt - beeinflusst. Dies steht im Einklang mit der Vorstellung, dass bei thermisch induzierter Entfaltung die Konfigurationsentropie $\Delta S_\km{conf.}$ die treibende Kraft darstellt und eine Stabilisierung der Hydratation, welche von Sorbitol vermittelt wird, kaum Auswirkungen hat. Zusammenfassend läßt sich sagen, dass die hitzeinduzierte Entfaltung von HEL über einen Zwischenzustand verläuft, welcher einen Rest nativer Struktur besitzt und insbesondere an bzw. bei den verknüpften Cysteinen 64 und 94 einen höheren Schutz gegenüber einen Protonenaustausch aufweist. Dieser Zwischenzustand zeigt bei Zugabe von 500 mM Sorbitol keine messbare strukturelle Stabilisierung. Endzustand ist die vollständig entfaltete Form $D$ bzw. ein Ensemble entfalteter Konformere, welche $P$-Faktoren im Bereich typischer Zufallsknäuel-Konformationen aufweist.




\subsection{$P$-Faktoren der druckunterstützen Kältedenaturierung} \label{KälteP}

Abb. \ref{coldkin} zeigt die Änderung der $^\km{1}$H-COSY-Signalintensität von HEL für einige Aminosäurereste in Abhängigkeit der Zeit unter druckunterstützen Kältedenaturierungsbedingungen ($T = 13$ °C, $p = 3,75$ kbar, pD 2,0). Es ist ersichtlich, dass die absoluten Austauschraten hier wesentlich langsamer sind als unter Hitzebehandlung. Um signifikante Intensitätsabnahmen zu erreichen, mussten Proben bis zu fast einer Woche im Autoklav unter Hochdruck und tiefen Temperaturen behalten werden. Dies ist auf den Einfluss der tiefen Temperatur zurückzuführen, die den Protonenaustausch, welcher ein mehrstufiger Prozess ist und eine Öffnung der Proteinloci und den eigentlichen Austausch beinhaltet, stark verlangsamt. Durch Berechnung der $P$-Faktoren und Einbeziehung der Referenzwerte der Zufallsknäuel-Konformation wird dieser Effekt jedoch herausgefiltert. Die Daten konnten mit einer monoexponentiellen Funktion angepasst und die entsprechenden $P$-Faktoren ermittelt werden.

\begin{figure}[h,t]
\begin{center}
\begin{minipage}[h]{15.5cm}
\centerline{\fbox{\epsfysize=7cm\epsffile{/source/bilder_ergebnisse/cold_ohne_kinetik.eps}}}
\caption{\label{coldkin} Änderung der relativen Intensität der C$_\alpha$-Amid-Kreuzkorrelationssignale mit der Expositionszeit unter kältedenaturierenden Bedingungen (20 mM Maleat pD 2,0; -13 °C; 3,75 kbar) für ausgesuchte Aminosäurereste (vgl. Abb. \ref{heatkin}).}
\end{minipage}
\end{center}
\end{figure}

Abb. \ref{coldP} zeigt eine Auftragung der so erhaltenen $P$-Faktoren gegen die Position der entsprechenden Aminosäure innerhalb der Sequenz. Die $P$-Faktoren der Kältedenaturierung sind größer als diejenigen, welche für das Intermediat der Hitzedestabilisierung gefunden wurden, und sind im Mittel etwa vier mal größer, weisen von ihrer Größe jedoch auf eine starke Destabilisierung der nativen Struktur hin. Betrachtet man die Verteilung der $P$-Faktoren, zeigt sich, dass die höchsten Schutzfaktoren mit Werten zwischen 40 und 70  bei oder in der Nähe von disulfid-verknüpften Cysteinen gefunden werden; für die meisten anderen Amidprotonen liegen die $P$-Faktoren zwischen 5 und 20. Der Vergleich von helicalen und $\beta$-Faltblattbereichen weist keine signifikanten Unterschiede auf, jedoch zeigt die Schleifenregion zwischen Rest 60 und 79, bis auf Loci bei oder um die Cysteine 64 und 76, erwartungsgemäß keinerlei messbaren Schutz vor der Substitution der Amidprotonen. Es bleibt festzuhalten, dass es sich bei der druckunterstützt-kältedestabilisierten Form von HEL um einen teilentfalteten Zustand handelt, in dem der höchste Schutz von Disulfidbrücken vermittelt wird. Das $\beta$-Faltblatt-Motiv sowie die helicalen Regionen schirmen gleichermaßen vor Austausch ab, während die große Schleifenregion zwischen Serin 60 und Prolin 79, bis auf die Einflüsse von verbrückten Cysteinen, keinen messbaren Schutz gegen einen Protonenaustausch bietet.

\begin{figure}[h,t]
\begin{center}
\begin{minipage}[h]{15.5cm}
\centerline{\fbox{\epsfysize=9cm\epsffile{/source/bilder_ergebnisse/cold_P.eps}}}
\caption{\label{coldP} Auftragung der $P$-Faktoren gegen die Aminosäureposition in der Sequenz von HEL unter Kältedenaturierung. Wie unter Abb. \ref{heat_P} sind Sekundärstrukturelemente und Disulfidverbrückungen durch Doppelpfeile markiert.}
\end{minipage}
\end{center}
\end{figure}

Auch für den kältedestabilisierten Zustand von HEL wurde der Einfluss von 500 mM Sorbitol auf die Konformation des Proteins untersucht. Wie schon bei den Experimenten unter Hitzedenaturierung, führte die Zugabe von Sorbitol zu einer Verschlechterung der Spektrenqualität, wodurch die Anzahl sinnvoll auswertbarer Signale abnahm. Abb. \ref{coldPsorb} zeigt die Differenz der $P$-Faktoren bei An- und Abwesenheit des Zusatzes. Es ist deutlich erkennbar, dass die $P$-Faktoren erheblich zunehmen. Dies bestätigt, dass für dieses Destabilisierungs- bzw. Entfaltungsszenario die Hydratation ein entscheidende Rolle spielt. Sorbitol, welches zu einer preferentiellen Hydratisierung führt, erhöht durch die Verstärkung der Hydratation die strukturelle Rigidität von HEL, wie aus der Erhöhung der Schutzfaktoren eindeutig hervorgeht. Eine zentrale Frage dieser Arbeit war, ob der stabilisierende Einfluss von Cosolventien den kältedenaturierten, teilentfalteten Zustand als Ganzes betrifft, oder ob es bestimmte Regionen bzw. Sekundärstrukturelemente gibt, welche durch Zunahme der Hydratation weniger leicht entfalten. Die Identifizierung solcher Bereiche würde auf eine erhöhte lokale strukturelle Stabilität mit Erniedrigung des chemischen Potentials der Hydrathülle hindeuten. Gemäß der Theorie des hydrophoben Kollaps sollte es zumindestens möglich sein, dass es bestimmte Regionen bzw. {\glqq hydrophobe Kerne\grqq} gibt, welche - verglichen mit dem Rest des teilentfalteten Proteins - überverhältnismäßig stabilisiert werden. Ein Blick auf Abb. \ref{coldPsorb} zeigt jedoch, dass für HEL kein solcher Bereich identifiziert werden kann, der durch außerordentlichen Zugewinn an Schutzfaktoren hervorsticht. Lediglich das Cystein 64, welches auch in den vorhergehenden Experimenten durch überdurchschnittlich hohe Schutzfaktoren auffiel, zeigt hier eine abweichende Erhöhung.

\begin{figure}[h,t]
\begin{center}
\begin{minipage}[h]{15.5cm}
\centerline{\fbox{\epsfysize=8cm\epsffile{/source/bilder_ergebnisse/Cold_P_sorb.eps}}}
\caption{\label{coldPsorb} Auftragung der Differenz der $P$-Faktoren des kältedenaturierten Zustandes im reinen Puffer ($P_\km{Puffer}$) und bei Anwesenheit von 500 mM Sorbitol ($P_\km{Sorbitol, Puffer}$) gegen die Sequenz. Der Zusatz dieses Cosolvens führt zu einer starken Erhöhung der Schutzfaktoren.}
\end{minipage}
\end{center}
\end{figure}

Es erscheint allerdings sinnvoller, bei der Suche nach Bereichen mit überdurchnittlicher Stabilität auf die \emph{relative} Änderung der $P$-Faktoren zu schauen. Abb. \ref{relPsorb} zeigt eine entsprechende Auftragung, bei der der Quotient aus der Differenz der $P$-Faktoren und dem $P$-Faktor im reinen Puffer gegen die Sequenzposition aufgetragen ist. Auch hier zeigt sich, dass die relativen Änderungen im Rahmen der Messgenauigkeit sehr gleichmäßig über die Sequenz verteilt sind und im Schnitt etwa 60 \% betragen. Falls es lokale Bereiche geben sollte, die durch die stabilisierende Wirkung des Sorbitols überdurchschnittlich beeinflusst werden, so ist der strukturelle Effekt, der hieraus resultiert, zumindestens wenn man ihn mit der Methode des Protonenaustauschs bewertet, nicht sonderlich ausgeprägt. Es ergibt sich damit das Bild, dass die über das Sorbitol vermittelte Stabilisierung das gesamte Protein gleichermaßen beeinflusst, d.h., dass die Stabilisierung und die dadurch resultierende Rigidisierung des teilentfalteten Zustands unter den vorliegenden Bedingungen kooperativ verlaufen.

\begin{figure}[h,t]
\begin{center}
\begin{minipage}[h]{15.5cm}
\centerline{\fbox{\epsfysize=8cm\epsffile{/source/bilder_ergebnisse/rel_P_sorb.eps}}}
\caption{\label{relPsorb} Auftragung der relativen Änderung der $P$-Faktoren $\frac{P_\km{Sorbitol, Puffer}- P_\km{Puffer}}{P_\km{Puffer}}$ gegen die Sequenzposition der Aminosäuren. Es kann kein Bereich identifiziert werden, der durch die Sorbitol-Stabilisierung im Rahmen der Messgenauigkeit einen überdurchschnittlichen Schutz vor Protonenaustausch zugewinnt.}
\end{minipage}
\end{center}
\end{figure}

In einem weiteren Ansatz wurde der umgekehrte Weg beschritten, d.h., dass das kältedestabilisierte HEL durch Zusatz von Harnstoff weiter destabilisiert wurde. Vielleicht würde der Zusatz eines chaotropen Agens zu diesem durch Hydratationseffekte teilentfalteten Zustandes Bereiche bzw. Motive innerhalb des Proteins anzeigen, welche in besonderer Weise auf eine Änderung der Hydratisierung bzw. Solvatation reagieren. Abb. \ref{coldPurea} zeigt die Differenz der so erhalten $P$-Faktoren und der $P$-Faktoren, welche in reinem Puffer erhalten wurden. Die Schutzfaktoren nehmen unter Zusatz von Harnstoff stark ab, d.h. dass die Destabilisierung der Hydratation und Adsorption des Harnstoffs auf der Proteinoberfläche zu einem weniger strukturierten Molekül führt. In der Betrachtung der Differenz der Schutzfaktoren ist, wie es bei dem Zusatz von Sorbitol der Fall war, bis auf Loci bei bzw. in der Nähe von Cysteinbrücken kein ausgeprägter Bereich bzw. kein ausgewiesenes Sekundärstrukturmotiv erkennbar, welches eine stark abweichende Änderung der Schutzfaktoren aufwiese. Auch bei Betrachtung der relativen Änderungen (Abb. \ref{relPurea}) ergibt sich, dass der Zusatz des Harnstoffs das Protein als Ganzes betrifft und kein distinkter Bereich identifiziert werden kann, der auf die Destabilisierung der Hydratation in besonderer Weise reagierte. Der Schutz vor Protonenaustausch und damit die strukturelle Rigidität des Moleküls betrifft die gesamte Sequenz gleichermaßen.

Insgesamt kann festgehalten werden, dass das druck\-unter\-stützte-kälte\-de\-stabili\-sierte HEL teilentfaltetet ist, wobei, wie bei dem thermisch induzierten Intermediat (vgl. \ref{HitzeP}), der hauptsächliche Faktor struktureller Rigidität durch Cysteinbrücken vermittelt wird.

\begin{figure}[p,h,t]
\begin{center}
\begin{minipage}[h]{15.5cm}
\centerline{\fbox{\epsfysize=8cm\epsffile{/source/bilder_ergebnisse/Cold_P_urea.eps}}}
\caption{\label{coldPurea} Differenz der $P$-Faktoren bei Anwesenheit und Abwesenheit von 2 M Harnstoff gegen die Sequenzposition der entsprechenden Aminosäure. Der Zusatz des Chaotrops führt insgesamt zu einer starken Abnahme des Schutzes gegen Protonenaustausch. Die größten Änderungen sind bei bzw. in der Nähe von den verbrückten Cysteinen 64, 76 und 94 zu verzeichnen, die in reinem Puffer die höchsten Schutzfaktoren aufweisen.}
\end{minipage}
\end{center}
\end{figure}

\begin{figure}[p,h,t]
\begin{center}
\begin{minipage}[h]{15.5cm}
\centerline{\fbox{\epsfysize=8cm\epsffile{/source/bilder_ergebnisse/rel_P_urea.eps}}}
\caption{\label{relPurea} Die relative Änderung der $P$-Faktoren gegen die Sequenzposition der Aminosäuren bei Zusatz von 2 M Harnstoff. Die Änderungen sind gleichmäßig entlang der Sequenz verteilt und betragen im Schnitt 60 \%. Auf Basis der Sekundärstrukturelemente kann kein Bereich erkannt werden, welcher überdurchnittlich destabilisiert würde bzw. überdurchnittlich starken Schutz gegen Protonenaustausch böte.}
\end{minipage}
\end{center}
\end{figure}


Der Einfluss der kosmo- bzw chaotropen Substanzen Sorbitol und Harnstoff unterstreicht, dass die Hydratation dasjenige Element ist, welches in diesem Entfaltungsszenario die hauptsächliche Rolle spielt, denn ungleich der thermischen Denaturierung, in dem der Zusatz von Sorbitol kaum Auswirkungen zeigte, erhöht bzw. erniedrigt der Zusatz von Sorbitol bzw. Harnstoff den Schutz vor Protonensubstitution in der vorhergesagten Weise. Es gilt zu unterstreichen, dass die Konformation von HEL durch die Stabilisierung bzw. Destabilisierung als Ganzes in kooperativer Weise beeinflusst wird und keine bestimmten Regionen bzw. keine bestimmten Sekundärstrukturelemente innerhalb des Proteins identifiziert werden können, welche ein signifikant abweichendes Verhalten aufweisen.
\newpage

\section{Thermisch induzierte Faltung des Polypeptids \\ $\km{GVG(VPGVG)_{\km{3}}}$}

\subsection{Zuordnung der $^\km{1}$H- und $^\km{13}$C-Signale} \label{Zuordnung}
Abb. \ref{1DH} zeigt die Strukturformel der repetitiven Untereinheit $\km{G_1V_1G_2V_2P}$ sowie das eindimensionale $^\km{1}$H-NMR-Spektrum von GVG(PVGVG)$_\km{3}$ . Die von der Sequenz bzw. Summenformel zu erwartenden Signale können in den entsprechenden Bereichen gefunden und durch Integration quantitativ nachgewiesen werden. Die skalaren Konnektivitäten können dem 2D-COSY-Spektrum entnommen werden (Abb. \ref{2DCOSY}).

\begin{figure}[h]
\begin{center}
\begin{minipage}[h]{15.5cm}
\centerline{\fbox{\epsfysize=13cm\epsffile{/source/bilder_ergebnisse/1H1D_NMR_seq.eps}}}
\caption{\label{1DH} Strukturformel der repetitiven Untereinheit $\km{G_1V_1G_2V_2P}$ (oben) und das $^{1}$H-1D-NMR-Spektrum von GVG(PVGVG)$_\km{3}$ (unten). Von den theoretisch zu erwartenden 93 Protonen können nach Skalierung auf das Signal der Valin-$\gamma$-Protonen ($\hat{=}$ 42 H) durch Integration 91 nachgewiesen werden, was im Rahmen der Genauigkeit als zufriedenstellend zu bezeichnen ist.}
\end{minipage}
\end{center}
\end{figure}


\begin{figure}[h,t]
\begin{center}
\begin{minipage}[h]{15.5cm}
\centerline{\fbox{\epsfysize=12cm\epsffile{/source/bilder_ergebnisse/COSY_new.eps}}}
\caption{\label{2DCOSY} Konturdiagramm des $^{1}$H-2D-COSY-Spektrums des Octadecamers GVG(PVGVG)$_\km{3}$ . Die jeweiligen Kreuzkorrelationssignale und ihre Zuordnung sind mit Pfeile markiert. Es wird auch eine verschobene, wahrscheinlich Prolin-$\delta$-$\delta$, Kopplung (P$\delta_\km{sh}$) gefunden.}
\end{minipage}
\end{center}
\end{figure}

Hier sind die skalaren Kopplungen der $\beta$- und $\gamma$-Protonen sowie der $\alpha$- und $\beta$-Protonen des Valins sichtbar. Im letzteren Fall kann zwischen den Valinen 1 und 2 unterschieden werden. Für das Prolin können die geminalen Kopplungen der $\beta$- und der $\delta$-Protonen sowie die skalaren Kopplungen zwischen $\alpha$-$\beta$, $\beta$-$\gamma$ und $\gamma$-$\delta$ gefunden werden.
Es findet sich auch eine verschobene Kopplung (P$\delta_\km{sh}$), die wahrscheinlich auf eine geminale $\delta$-Kopplung zurückzuführen ist. Dies könnte ein Hinweis auf ein Prolin mit abweichender Konformation zurückzuführen sein. Im $^\km{1}$H-1D-Spektrum ergibt sich für eines der beteiligten Signale (das andere ist überlagert) eine relative Intensität von 0,2, d.h. bei ca. 20 \% der Gesamtmolekülpopulation befände sich eines der drei vorhandenen Proline in dieser abweichenden Konformation.
Insgesamt zeigen die Spektren, dass die Probe rein ist und in der vorausgesetzten Zusammensetzung vorliegt. Bis auf die verschobene, geminale Prolin-$\delta$-Kopplung kann keine Feinstruktur gefunden werden, die auf signifikante Anteile von Unterpopulationen mit abweichender Konformation hinwiese. Die Signale des $^\km{1}$H-2D-COSY-Spektrums werden bei der Analyse des $^\km{1}$H-2D-NOESY-Spektrums (siehe Kap. \ref{kapnoesy}) noch von Wichtigkeit sein, um echte NOE-Wechselwirkungen von evtl. Artefakten durch Spin-Diffusion zu unterscheiden.


\begin{figure}[p,h,t]
\begin{center}
\begin{minipage}[h]{15.5cm}
\centerline{\fbox{\epsfysize=7cm\epsffile{/source/bilder_ergebnisse/D2OH2O_13C_hochtief.eps}}}
\caption{\label{13CH2OD2O} $^\km{13}$C-Spektrum von GVG(PVGVG)$_\km{3}$  in $\km{D_2O}$ (oben) und $\km{H_2O}$ (unten). Auf der linken Seite ist der Tieffeldbereich mit den Carbonyl-$^\km{13}$C-Signalen, auf der rechten Seite befindet sich der Hochfeldbereich mit den anderen Kohlenstoffsignalen. Die meisten Signale lassen sich gemäß des pentameren Motivs $\km{G_1V_1G_2V_2P}$ zuordnen, doch im Tieffeldbereich und um dem Glycin-$\alpha$-Signal lassen sich zusätzliche Signale finden ({\it a}, {\it b}, {\it c}, {\it d} und {\it e}). Das Signal {\it c} weist einen leichten Isotopeneffekt auf und ist im $\km{D_2O}$-Spektrum um 0,5 ppm in Richtung Hochfeld verschoben.}
\end{minipage}
\end{center}
\end{figure}

Abb. \ref{13CH2OD2O} sind die $^\km{13}$C-1D-Spektren des Octadekamers in $\km{H_2O}$ und $\km{D_2O}$ zu entnehmen. Die Hauptsignale lassen sich gemäß der Literatur \cite{Kurkova2003} dem repetitiven Motiv $\km{G_1 V_1 G_2 V_2 P}$ zuordnen, wie man sie auch im Hochpolymer findet. Desweiteren lassen sich zusätzliche Signale im Carbonyl- und im Glycin-$\alpha$-Bereich finden. Über die flankierenden Signale im Glycin-$\alpha$-Bereich lässt sich sagen, dass diese ebenfalls auf Glycin-$\alpha$-Kohlenstoffe zurückzuführen sein müssen, welche sich in einer unterschiedlichen konformellen Umgebung befinden, da es höchst unwahrscheinlich ist, dass Signale anderer Kohlenstoffe sich über einen so großen Bereich verschieben. Die Signale {\it a}, {\it b} und {\it c} lassen sich nicht ohne weiteres zuordnen, da alle $^\km{13}$C-Carbonyl-Signale in einem relativ engen Bereich liegen und diese je nach struktureller Umgebung über relativ weite Bereiche variieren können. Eingedenk der Tatsache, dass das GVG(PVGVG)$_\km{3}$  drei der pentameren Einheiten $\km{G_1V_1G_2V_2P}$ besitzt, weist das Spektrum also recht wenig Feinstruktur auf, was darauf zurückzuführen sein könnte, dass die strukturelle Umgebung der jeweiligen Kohlenstoffe recht einheitlich ist oder dass das Molekül eine hohe Dynamik aufweist - oder beides.

Es gilt festzustellen, woher die zusätzlichen Signale stammen. Denkbar ist, dass sich die entsprechenden Kohlenstoffe innerhalb der Sequenz in einer unterschiedlichen sterischen Umgebung befinden und so eine bzw. mehrere Subpopulation(-en) von Konformeren bilden. Weiterhin könnten die Signale von terminalen Aminosäureresten herrühren, welche eine andere und vermutlich dynamischere Umgebung als die Reste im Innern der Sequenz besitzen. Um eine eindeutige Zuordnung zu ermöglichen, wurde das HSQC- und das HMQC-Spektrum des Ocatdekamers aufgenommen. Erstere Methode erlaubt einen Rückschluss auf die Konnektivität zwischen direkt verbundenen $^\km{13}$C- und $^\km{1}$H-Kernen, letztere die Bestimmung von Konnektivitäten über einige chemische Bindungen hinweg.



%\begin{landscape}
\begin{figure}[t,h]
\begin{center}
\begin{minipage}[h]{15.5cm}
\centerline{\fbox{\epsfysize=13cm\epsffile{/source/bilder_ergebnisse/HSQC.eps}}}
\caption{\label{HSQC} Konturdiagramm des HSQC-Spektrums von GVG(PVGVG)$_\km{3}$. Auf der Abzisse ist die Frequenzdomäne der $^\km{13}$C-Kerne, auf der Ordinate die der $^\km{1}$H-Kerne aufgetragen. Die jeweiligen 1D-Spektren sind links neben der Achse bzw. im oberen Teil des Diagramms dargestellt. Korrelationspeaks zwischen einzelne Signale deuten auf eine direkte chemische Bindung zwischen den betreffenden Kernen hin. Um den Überblick zu erleichtern, wurden entlang der Signalfrequenzen senkrechte bzw. horizontale Hilfslinien gelegt.}
\end{minipage}
\end{center}
\end{figure}
%\end{landscape}

Abb. \ref{HSQC} zeigt ein Konturdiagramm des $^\km{1}$H-$^\km{13}$C-HSQC-Spektrum des Octadekamers. Es bestätigt die oben vorgenommene Zuordnung. Insbesondere zeigt es, dass die flankierenden Signale um die Glycin-$\alpha$-Bande ebenfalls von Glycin-$\alpha$-Kohlenstoffen stammen. Es wird weiterhin deutlich, dass der Glycin-$\alpha$-Bereich eine weitere Feinstruktur besitzt, da sich bei sehr genauer Betrachtung der Korrelationssignale herausstellt, dass das tieffeldverschobene Signal sehr unsymmetrisch ist; auch ist ein kleines, weiteres Signal sichtbar. Die Glycin-$\alpha$-Kohlenstoffpopulation ist also wenig einheitlich, was auf eine diesbezügliche Heterogenität innerhalb des Moleküls und/oder innerhalb des Ensembles an Molekülen hindeutet.

\begin{figure}[h,t]
\begin{center}
\begin{minipage}[h]{15.5cm}
\centerline{\fbox{\epsfysize=11cm\epsffile{/source/bilder_ergebnisse/18merHMQC_high.eps}}}
\caption{\label{HMQC} Konturdiagramm des HMQC-Spektrum von GVG(PVGVG)$_\km{3}$ . Gezeigt ist der Hochfeldbereich der $^\km{13}$C-Frequenzdomäne gegen den $^\km{1}$H-Frequenzbereich, in dem typischerweise die Signale der $\alpha$-Wasserstoffe von Aminosäuren liegen. Wie in Abb. \ref{HSQC} wurden zur besseren Übersicht Hilfslinien eingezeichnet.}
\end{minipage}
\end{center}
\end{figure}

Da Carbonylkohlenstoffe kein direkt chemisch gebundenes Wasserstoffatom aufweisen, können ihre Konnektivitäten nicht über die HSQC-Methode aufgeklärt werden. Hierzu wurde ein HMQC-Spektrum aufgenommen, dessen Konturdiagramm Abb. \ref{HMQC} zu entnehmen ist. Wiederum bestätigt sich die Zuordnung für die Hauptsignale, wie sie oben vorgenommen wurde. Es zeigt sich, dass Korrelationen auch über einzelne Aminosäurereste hinaus bestehen; so weisen das Prolin- sowie das Valin$_\km{1}$-Carbonylkohlenstoff Kreuzkorrelationen mit Glycin-$\alpha$-Wasserstoffen auf. Die Signale {\it a} und {\it b} zeigen Korrelationssignale mit der Glycin-$\alpha$-Region, wobei das Signal {\it b} noch eine sehr schwache Kreuzkorrelation mit dem Valin$_\km{1}$-$\alpha$-Wasserstoff aufweist. Somit können diese beiden Signale also Glycinen zugewiesen werden. Das Signal {\it c} des $^\km{13}$C-Spektrums korreliert mit den $^\km{1}$H-Frequenzen des Valin$_\km{1}$ und zwei Glycin-$\alpha$-Wasserstoffen. In Anbetracht der Tatsache, dass in dem Spektrum Valin- bzw. Prolin-Carbonylkohlenstoffe durchaus mit Glycin-$\alpha$-Wasserstoffen Kreuzkorrelationen aufweisen, umgekehrt Glycin-Carbonylkohlenstoffe mit Valin- oder Prolin-$\alpha$-Wasserstoffen jedoch kaum, ist hier eine Zuordnung von {\it c} zu einem Valin in Position 1 berechtigt. Die zusätzlichen Signale stammen also von einem Valin$_\km{1}$ und zwei Glycinen. Für die $^\km{13}$C-Glycin-$\alpha$-Kerne direkt lassen sich im HMQC-Spektrum überhaupt keine Korrelationssignale nachweisen (Daten nicht gezeigt). Doch der Vergleich der Lage dieser Signale im HSQC-Spektrum ({\it e}: $\delta(^\km{13}$C) $\approx$ 41 ppm, $\delta(^\km{1}$H) $\approx$ 3,75 ppm; {\it d}: $\delta(^\km{13}$C) $\approx$ 44 ppm, $\delta(^\km{1}$H) $\approx$ 3,65 ppm; siehe Abb. \ref{HSQC}) mit den entsprechenden Korrelationspeaks der Carbonylkerne im HMQC-Spektrum legt nahe, dass das zusätzliche Valin$_\km{1}$-Carbonyl-Signal ($\delta(^\km{13}$C$_\km{c})$ $\approx$ 168,5; $\delta(^\km{1}$H) $\approx$ 3,76; Duplett) mit dem zusätzlichen Glycin-$\alpha$-Wasserstoff {\it e} korreliert, während die Lage der zusätzlichen Glycin-Carbonyl-Signale ($\delta(^\km{13}$C$_\km{{\it a}})$ $\approx$ 176,3; $\delta(^\km{13}$C$_\km{{\it b}})$ $\approx$ 173; $\delta(^\km{1}$H) $\approx$ 3,66) eine Kreuzkorrelation mit dem zusätzlichen Glycin-$\alpha$-Wasserstoff {\it d} nahelegen; die anderen Hauptsignale, wie man sie auch im Hochpolymer findet, zeigen Kreuzkorrelation mit dem Glycin-$\alpha$-Hauptsignal. Die Frage, ob es sich bei den zusätzlichen Signalen um andere Konformere oder terminale Aminosäurereste handelt, kann an dieser Stelle nicht eindeutig beantwortet werden: Einerseits legt die Zuordnung zu zwei Glycinen und einem Valin$_\km{1}$ - also einer GVG-Gruppe, welche zudem {\glqq isoliert\grqq} zu sein scheint, da Korrelationen mit den zusätzlichen, separaten Glycin-$\alpha$-Wasserstoffen bestehen - dies nahe. Andererseits besitzt das Signal {\it c} keine Kreuzkorrelation mit dem Signal {\it d}, mit dem die zusätzlichen Glycin-Carbonyl-Kohlenstoffe {\it a} und {\it b} korrelieren. Das Valin$_\km{1}$ {\it c} ist also nicht mit diesen benachbart. Weitere Informationen zu dieser Frage sollte durch die Messung der $T_\km{1}$-Relaxationsraten zu erhalten sein, da über die Bestimmung der Rotationskorrelationszeit eine Aussage über die Dynamik dieser Kohlenstoffe getroffen werden kann. Sollten diese eine höhere Dynamik aufweisen, läge eine terminale Position nahe. Die Glycin-Carbonyl-Kohlenstoffe {\it a} und {\it b} zeigen beide eine Kreuzkorrelation im Bereich des Signals {\it d}, wobei das Signal {\it b} noch eine weitere, schwache Kreuzkorrelation mit der Valin$_\km{1}$-$\alpha$-Region besitzt~-~es ist also nicht auszuschließen, dass die Glycine {\it a} und {\it b} also gemeinsam zu einem GVG-Terminus gehören.

Zusammengefasst gleicht das $^\km{13}$C-NMR-Spektrum demjenigen, welches man auch für die hochpolymere Form dieses Peptids findet \cite{Kurkova2003}. Entsprechend lassen sich die Hauptsignale gemäß der repetitiven Pentameren-Sequenz $\km{G_1V_1G_2V_2P}$ zuordnen. Eine abweichende Feinstruktur finden sich im Carbonylbereich und flankierend zum Glycin-$\alpha$-Hauptsignal. Auf Basis des HMQC-Spektrums lassen sich die zusätzlichen Signale im Carbonylbereich zwei Glycinen und einem Valin in der Position 1 zuordnen. Durch Vergleich des HMQC- und des HSQC-Spektrums können die zusätzlichen Glycin-Car\-bo\-nyl\-kohlen\-stoffe {\it a} und {\it b} dem Glycin-$\alpha$-Signal {\it d} zugewiesen werden. Das Valin$_\km{1,{\it c}}$ scheint dem Glycin bzw. den Glycinen, welche(-s) dem $^\km{13}$C-Signal {\it e} zugrundeliegt bzw. zugrundeliegen, benachbart zu sein.


\subsection{Temperaturabhängige Messungen} \label{T1}

Aus dem vorhergehenden Kapitel geht hervor, dass das $^\km{13}$C-NMR-Spektrum aufgrund einer ausreichenden Separation der Linien am geeignetsten für eine Konformationsbestimmung ist. Die Feinstruktur der Glycin-$\alpha$-Signale konnte nur mit dieser Methode bestimmt sowie die zusätzlichen Carbonylsignale detektiert werden. Abb. \ref{13CT} zeigt die Änderungen im $^\km{13}$C-1D-Spektrum, welche mit der Erhöhung der Temperatur einhergehen. Es wird deutlich, dass die relative Höhe der Signale {\it a}, {\it b}, {\it c}, {\it d} und {\it e} mit zunehmender Temperatur abnimmt. Die Abnahme der Höhe sowie die Änderung der chemischen Verschiebung von {\it c} fällt hierbei besonders stark aus, während die anderen Signale selbst bei 80 °C nicht vollständig verschwunden sind. Der Rückgang der relativen Intensität dieser zusätzlichen Signale ist damit wohl auf die Abnahme der Population der zugrundeliegenden Kerne zurückzuführen. Die Reduktion der Signalintensität aufgrund eines Koaleszenzeffektes ist sehr unwahrscheinlich, da ausschließlich die als {\glqq zusätzlich\grqq} klassifizierten Signale betroffen sind.

Für die Kohlenstoffkerne wurden für vier verschiedene Temperaturen (278, 300, 333 und 348 K) die jeweiligen $T_\km{1}$-Relaxationszeiten bestimmt. Abb. \ref{T13D} zeigt ein 3D-Diagramm, in dem die relative Intensität der Signale als Funktion der chemischen Verschiebung $\delta$ und der Mischzeit $d$2 aufgetragen ist. Für die jeweiligen Kohlenstoffkerne konnte durch Anpassung der Signalhöhen als Funktion der Mischzeit $d$2 die Relaxationsrate $T_\km{1}$ berechnet werden. Gemäß Formel \ref{tauest} bzw. \ref{tauestCO} wurden daraus die Rotationskorrelationszeiten $\tau_\km{est.}$ bestimmt. Tabelle \ref{13CT1tab} sind die so berechneten Werte zu entnehmen.


\begin{figure}[p,h]
\begin{center}
\begin{minipage}[h]{15.5cm}
\centerline{\fbox{\epsfysize=18cm\epsffile{/source/bilder_ergebnisse/T_C13_H2O_.eps}}}
\caption{\label{13CT} $^\km{13}$C-1D-Spektren von $\km{G_1V_1G_2V_2P}$ in Abhängigkeit der Temperatur. Abschnitt A zeigt den Hochfeld-, Abschnitt B den Tieffeldbereich mit den Carbonylkohlenstoffen. Die relative Höhe der Signale {\it a}, {\it b}, {\it c}, {\it d} und{\it e} nimmt mit steigender Temperatur ab,  wobei das Signal {\it c} eine wesentlich stärkere Temperaturabhängigkeit bezüglich der chemischen Verschiebung und der Signalintensität aufweist.}
\end{minipage}
\end{center}
\end{figure}


\begin{landscape}
\thispagestyle{empty}
\begin{table}[p]
\begin{scriptsize}
\caption{\label{13CT1tab}$T_\km{1}$-Raten und abgeschätze Rotationskorrelationszeiten $\tau_{\mathrm{est.}}$ des Octadekamers bei 278, 300, 333 und 348 K.}

\vspace{0.3cm}
 \begin{tabular}[h]{|c|c|c|c|c|c|c|c|c|}
 \hline
$^\km{13}$C-Atom  &  $T_\km{1}$(278 K) / s & $T_\km{1}$(300 K) / s & $T_\km{1}$(333 K) / s & $T_\km{1}$(348 K) / s & $\tau_\km{est.}$(278 K) / ns  & $\tau_\km{est.}$(300 K) / ns &  $\tau_\km{est.}$(333 K) / ns & $\tau_\km{est.}$(348 K) / ns \\
\hline
P-C=O & 1,0 +/-0,1 & 1,7 +/- 0,3 & 1,7 +/- 0,2 & 2,5 +/- 0,2 & 0,93 +/- 0,09 &  0,6 +/- 0,1 & 0,55 +/- 0,06 & 0,37 +/- 0,03 \\
\hline
V$_\km{1}$-C=O & 1,2 +/- 0,2 & 1.3 +/- 0.2 & 2,0 +/- 0,1 & 2,4 +/- 0,4 & 0,9 +/- 0,1 & 0,8 +/- 0,01 & 0.52 +/- 0.03 & 0,43 +/- 0,07 \\
\hline
V$_\km{2}$-C=O & 1,02 +/- 0,07 & 1,3 +/- 0,1 & 2,1 +/- 0,2 & 2,6 +/- 0,3 & 1,02 +/- 0,07 & 0,79 +/- 0,06 & 0,49 +/- 0,05 & 0,40  +/- 0.05 \\
\hline
G$_\km{1}$-C=O & 1,01 +/- 0,08 & 1,7 +/- 0,1 & 2,2 +/- 0,2 & 2,5 +/- 0,4 & 0,71  +/- 0,06 & 0,42 +/- 0,02 & 0,33 +/- 0,03 & 0,29 +/- 0,05 \\
\hline
G$_\km{2}$-C=O & 0,9 +/- 0,1 & 1,5 +/- 0,4 & 2,2 +/- 0,4 & 3,8 +/- 0,7 & 0,8 +/- 0,1 & 0,5 +/- 0,1 & 0,33 +/- 0,06 & 0,19 +/-  0,03 \\
 & 1,0 +/- 0,2 & - & - & - &  0,7 +/- 0,2 &  - & - & - \\
 \hline
P$\alpha$ & 0,35 +/- 0,02 & 0,4 +/- 0,02 & 0,54 +/- 0,03 & 0,56 +/- 0,04 & 0,126 +/- 0,007 & 0,110 +/- 0,006 & 0,081 +/- 0,005 & 0,079  +/-  0,006 \\
  & - & - &  0,54 +/- 0,03 & 0,56  +/- 0.04 & - & - & 0,081 +/- 0,005 & 0,079 +/- 0,006 \\
  \hline
V$_\km{1} \alpha$ & 0,36 +/- 0,03 & 0,43 +/- 0,02 & 0,75 +/- 0,06 & 0,84 +/- 0,05 & 0,12 +/- 0,01 & 0,122 +/- 0,005 & 0,059 +/- 0,005 & 0,052 +/- 0.003 \\
\hline
V$_\km{2} \alpha$ & 0,31 +/- 0,03 & 0,41 +/- 0,02 & 0,45 +/- 0,04 & 0,59 +/- 0,07 & 0,14 +/- 0,01 & 0,107 +/- 0,005 & 0,098 +/- 0,009 & 0,075 +/- 0.009 \\
\hline
P$\delta$ & 0,2 +/- 0,01 & 0,26 +/- 0,02 & 0,29 +/- 0,01 & 0,39 +/- 0,05 & 0,110 +/- 0.006 & 0,085 +/- 0,007 & 0,076 +/- 0,003 & 0,056 +/- 0.007 \\
\hline
G$\alpha$  & 0,17 +/- 0,02 & 0,236 +/- 0,007 & 0,3 +/- 0,02 & 0,36 +/- 0,03 & 0,13 +/- 0,02 & 0,093 +/- 0,003 & 0,073 +/- 0,005 & 0,061 +/- 0,005 \\
  & - & -  & 0,3 +/- 0,02 & 0,41 +/- 0,05 & -& -& 0,073 +/- 0,005 & 0,054 +/- 0,007 \\
 \hline
V$_\km{1,2} \beta$ & 0,37 +/- 0,05 & 0,51 +/- 0,03 & 0,9 +/- 0,1 & - & 0,12 +/- 0,02 & 0,085 +/- 0,005 & 0,049 +/- 0,006 & - \\
- & 0,35 +/- 0,01 & 0,41 +/- 0,01 & 0,53 +/- 0,03 & 0,71 +/- 0,05 & 0,126 +/- 0.004 & 0,107 +/- 0,003 & 0,083 +/- 0,005 & 0,062 +/- 0,004 \\
\hline
P$\beta$ & 0,28 +/- 0,01 & 0,34 +/- 0,01 & 0,42 +/- 0,03 & 0,46 +/- 0,05 & 0,079 +/- 0,003 & 0,065 +/- 0,002 & 0,052 +/- 0,004 & 0,048 +/- 0.005 \\
\hline
P$\gamma$ & 0,32 +/- 0,02 & 0,40 +/- 0,02 & 0,51 +/- 0,02 & 0,63 +/- 0,09 & 0,069 +/- 0,004 & 0,055 +/- 0,003 & 0,043 +/- 0,002 & 0,035 +/- 0.005 \\
\hline
V$_\km{1} \gamma$ & 0,32 +/- 0,02 & 0,6 +/- 0,03 & 0,76 +/- 0,02 & 1,06 +/- 0.05 & 0,046 +/- 0,003 & 0,024 +/- 0,001 & 0,0193 +/- 0,0005 & 0,0138 +/- 0,0007 \\
  & 0,340 +/- 0,007 & 0,52 +/- 0,01 & - & - & 0,0432 +/- 0,0009 & 0,0283 +/- 0.0005 & - & - \\
   & 0,297 +/- 0,008 & 0,429 +/- 0,008 & - & - & 0,049 +/- 0,001 & 0,0342 +/- 0,0006 & - & - \\
   \hline
V$_\km{2} \gamma$ & 0,4 +/- 0,01 & 0,53 +/- 0,02 & 1,02 +/- 0,05 & - & 0,037 +/- 0,001 & 0,028 +/- 0,001 & 0,0144 +/- 0.0007 & - \\
  & 0,4 +/- 0,01 & 0,586 +/- 0,008 & 1,2 +/- 0,1 & - & 0,037 +/- 0,001 & 0,0251 +/- 0,0003 & 0,012 +/- 0,001 & - \\
  & 0,4 +/- 0,02 & 0,66 +/- 0,04 & 0,93 +/- 0,05 & 1,23 +/- 0,09 & 0,037 +/- 0,002 & 0,022 +/- 0,001 & 0,0158 +/- 0.0009 & 0,0119 +/- 0.0009 \\
 & 0,46 +/- 0,02 & - & - & - & 0,032 +/- 0,001 & - & - & - \\
\hline
G$_\km{{\it a}}$-C=O & 4,2 +/- 0,8 & 11 +/- 5 & 11 +/- 2 & 8 +/- 3 & 0,17 +/- 0,03 & 0,07 +/- 0,04 & 0,07 +/- 0,01 & 0,09 +/- 0,04 \\
\hline
G$_\km{{\it b}}$-C=O & -  & 2,6 +/- 0,6 & - & 6 +/- 3 & -  & 0,28 +/- 0,07 & - & 0,12 +/- 0,08 \\
\hline
V$_\km{1, {\it c}}$-C=O & - & 1,9 +/- 0,3 & - & - & - & 0,55 +/- 0,09 & - & - \\
\hline
G$_\km{d} \alpha$ & 0,36 +/- 0,04 & 0,7  +/-  0,1 & 1,3 +/- 0,1 & - & 0,061 +/- 0.007 & 0,031 +/- 0,005 & 0,018 +/- 0,001 & - \\
\hline
G$_\km{e} \alpha$ & - & 0,25 +/- 0,03 & - & - & - & 0,09 +/- 0.01 & - & - \\
\hline

\end{tabular}
\end{scriptsize}
\end{table}
\end{landscape}

\begin{figure}[h,t]
\begin{center}
\begin{minipage}[h]{15.5cm}
\centerline{\fbox{\epsfysize=9cm\epsffile{/source/bilder_ergebnisse/T1_3d_new.eps}}}
\caption{\label{T13D} 3D-Diagramm eines Datensatzes zur $T_\km{1}$-Bestimmung von $\km{GVG(VPGVG)_3}$ bei Raumtemperatur. Gezeigt sind die erhaltenen $^\km{13}$C-1D-Spektren als Funktion der Mischzeit $d$2. Durch Anpassen der Signalhöhen der jeweiligen Kerne gemäß Gleichung \ref{T1fit} kann $T_\km{1}$ erhalten werden. }
\end{minipage}
\end{center}
\end{figure}

Einige Hauptsignale des $^\km{13}$C-Spektrums sind in kleinere Einzelsignale aufgespalten; so besteht die Glycin-$\alpha$- und die Glycin$_\km{2}$-Carbonyl-Bande aus jeweils zwei leicht verschobenen Einzelsignalen, für die teilweise beide $T_\km{1}$-Zeiten ermittelt werden konnten. Für die Valin-$\gamma$-Kohlenstoffe konnten bis zu vier Einzelsignale aufgelöst werden, und neben dem Valin-$\beta$-Peak findet sich ein schwaches, gering tieffeldverschobenes Signal. Diese Einzelsignale werden den jeweiligen Hauptsignalen zugeordnet, da die Verschiebungen nur sehr gering sind und im HSQC- bzw. HMQC-Spektrum auch keine zusätzliche Information über sie gewonnen werden konnte.

Im unteren Teil der Tabelle \ref{13CT1tab} sind die Daten für die zusätzlichen Kohlenstoffe {\it a}, {\it b}, {\it c}, {\it d} und {\it e} aufgelistet. Diese Signale sind schwächer als die Hauptsignale und nehmen mit steigender Temperatur ab, so dass teilweise nur für einzelne Temperaturen die $T_\km{1}$-Zeiten bestimmt werden konnten. Für den Glycin-Carbonylkohlenstoff {\it a} zeigt sich deutlich, dass die $T_\km{1}$-Werte sehr hoch sind - so hoch, dass die Bedingung $5 T_\km{1} < \km{d1}$ sogar nicht mehr erfüllt ist und damit die Werte auch nicht quantitativ auswertbar sind. Allerdings lässt sich feststellen, dass die Dynamik dieses Kernes außerordentlich hoch ist, was eine terminale Position des entsprechenden Glycins nahelegt. Auch das Glycin-Carbonyl {\it b} weist überdurchschnittlich hohe $T_\km{1}$-Werte auf, die zwar nicht ganz so hoch wie bei {\it a} sind, aber auch eine terminale Position wahrscheinlich machen. Für das Valin$_\km{1}$-Signal {\it c} konnte nur ein einziger Wert bestimmt werden. Dieser ist signifikant höher als der des entsprechenden Valin$_\km{1}$-Hauptsignals. Allerdings fällt der Unterschied im Rahmen der Genauigkeit nicht so hoch aus, als dass man von einer wesentlich höheren Dynamik diese Restes sprechen könnte, und die eine Zuordnung zu einer terminalen Position rechtfertigte. Das Glycin-$\alpha$-Signal {\it d} weist, verglichen mit dem Glycin-$\alpha$-Hauptsignal, $T_\km{1}$-Werte auf, welche doppelt bis dreifach so groß sind. Entsprechend fallen die abgeschätzten Rotationskorrelationszeiten wesentlich schneller aus. Auch hier legt die höhere Dynamik eine terminale Position nahe, was in Anbetracht des Befundes, dass dieses Glycin-Signal den Glycin-Carbonylkohlenstoffen {\it a} und {\it b} zugeordnet werden kann (vgl. Kap. \ref{Zuordnung}), ein stimmiges Bild ergibt: Die Glycin-Reste, welche {\it a}, {\it b} und {\it d} zugrundeliegen, können aufgrund ihrer abweichenden Lage im $^\km{13}$C-Spektrum und ihrer außerordentlich hohen Dynamik also mit hoher Wahrscheinlichkeit einer terminalen Gruppierung des Peptids zugeordnet werden. Für den Glycin-$\alpha$-Peak {\it e}, dessen zugehöriges Glycin bzw. dessen zugehörige Glycine aufgrund von Betrachtungen im Kapitel \ref{Zuordnung} wahrscheinlich vicinal zu dem Valin$_\km{1}$ {\it c} ist bzw. sind, konnte wie im Falle des Valin$_\km{1}$ {\it c} nur bei einer Temperatur von 300 K ein $T_\km{1}$-Wert bestimmt werden, der im Rahmen der
Genauigkeit nicht vom entsprechenden Wert des Gycin-$\alpha$-Hauptsignals abweicht. Die $T_\km{1}$- bzw. $\tau_\km{est.}$-Werte legen für das Valin$_\km{1}$ {\it c} und dem Glycin-$\alpha$ {\it e} keine terminale Position nahe, also ist hier wahrscheinlicher von einer anderen konformeren Struktur der zugrundeliegenden Aminosäurereste auszugehen. Wie Abb. \ref{13CT} zu entnehmen ist, nimmt die relative Höhe der zusätzlichen Signale {\it a}, {\it b}, {\it c}, {\it d} und {\it e} mit zunehmender Temperatur ab, d.h., dass der Anteil der zusätzlichen Konformation {\it c} und {\it e} sowie der terminale {\glqq Charakter\grqq} der Reste {\it a} und {\it b} mit steigender Temperatur abnimmt.

\begin{figure}[h,t]
\begin{center}
\begin{minipage}[h]{15.5cm}
\centerline{\fbox{\epsfysize=6.5cm\epsffile{/source/bilder_ergebnisse/T1_T_CO_2pix.eps}}}
\caption{\label{T1COCA} Änderungen der $T_\km{1}$-Zeiten mit der Temperatur für die Carbonylkohlenstoffe. Durch die Werte wurden zur besseren Übersicht mit der Funktion {\it B-spline} eine Kurve gelegt.}
\end{minipage}
\end{center}
\end{figure}

\begin{figure}[h,t]
\begin{center}
\begin{minipage}[h]{15.5cm}
\centerline{\fbox{\epsfysize=6.0cm\epsffile{/source/bilder_ergebnisse/T1_T_Caside.eps}}}
\caption{\label{T1side} Änderungen der $T_\km{1}$-Raten mit der Temperatur für die C-$\alpha$- (links) und die Seitenkettenkohlenstoffe (rechts). Durch die Werte wurde zur besseren Übersicht mit der Funktion {\it B-spline} eine Kurve gelegt.}
\end{minipage}
\end{center}
\end{figure}

Im Folgenden sollen die Änderung der $T_\km{1}$-Raten der Hauptsignale mit der Temperatur genauer betrachtet werden. Abb. \ref{T1COCA} zeigt eine Auftragung der $T_\km{1}$-Raten in Abhängigkeit der Temperatur für die Carbonylkohlenstoffe, Abb. \ref{T1side} die entsprechende Auftragung für die C-$\alpha$- und Seitenkettenkohlenstoffe. Es ist ersichtlich, dass für keinen Kern ein Rückgang der $T_\km{1}$-Werte mit steigender Temperatur zu erkennen ist. Da das Octadekamer mit zunehmender Temperatur einen höheren Grad an Struktur annimmt, sollte man eigentlich erwarten, dass zumindestens Atome, welche an wichtigen Strukturelementen der $\beta$-Schleife beteiligt sind, kleinere $T_\km{1}$-Zeiten aufweisen, da eine Zunahme an Struktur (erhöhter Faltungsgrad) mit rückläufiger Dynamik einhergehen sollte. Ursache für diese Abweichung vom erwarteten Verhalten könnte in der außerordentlich hohen intrinsischen Dynamik des $\km{GVG(VPGVG)_3}$-Moleküls liegen, bei der die temperaturabhängige Erhöhung der Dynamik durch gesteigerte Dreh- und Translationsbewegungen die gleichzeitige Einschränkung der Dynamik durch Zunahme des Faltungsgrades -~wie z.B. durch starrere Bindungswinkel oder Fixierung durch Wasserstoffbrücken~- teilweise oder vollständig kompensiert.

Schaut man sich den Verlauf der $T_\km{1}$-Zeiten mit steigender Temperatur an, so fällt jedoch auf, dass für einige Kohlenstoffkerne die $T_\km{1}$-Werte nicht mit einem exponentiellen Anstieg in Übereinstimmung gebracht werden können, wie man es gemäß der Arrhenius-Gleichung erwarten würde (siehe Gleichung \ref{T1Arrhenius}). Dies kann als ein Hinweis auf eine Zunahme des Faltungsgrades gewertet werden, der die thermisch induzierte Erhöhung der Dynamik teilweise kompensiert und so zu einer Abweichung vom exponentiellen Anstieg führt.

Es wurden die relative Änderungen der abgeschätzten Rotationskorrelationszeit berechnet, d.h. die Quotienten aus der Differenz $\tau_\km{est.}$(348K) - $\tau_\km{est.}$(278K) und $\tau_\km{est.}$ bei 278 K. Bei dieser Vorgehensweise wird so der einzelnen Dynamik der Kerne, die unspezifisch durch die reine Temperaturerhöhung beschleunigt werden kann, Rechnung getragen.

Abb. \ref{taucrel} zeigt die entsprechende Auftragung der relativen Änderung von $\tau_\km{est.}$ gegen die Kohlenstoffkerne des pentameren Motivs $\km{G_1V_1G_2V_2P}$. Es wird deutlich, dass die Unterschiede zwischen den einzelnen $^\km{13}$C-Kernen gering ausfallen. Die Valin-$^\km{13}$C-$\gamma$-Kerne, d.h. die Methylkohlenstoffe des Valins, welche die mobilsten im Molekül sind, weisen zusammen mit dem Glycin$_\km{2}$-Carbonylkohlenstoff den höchsten Zuwachs an Dynamik mit steigender Temperatur auf. Die sterisch gehinderten Prolin-$^\km{13}$C-$\alpha$ und -$^\km{13}$C-$\beta$, welche sich in einem Ring befinden, zeigen den niedrigsten Zuwachs an Mobilität. Insgesamt liegen alle Werte in einem Bereich einer Abnahme von $\tau_\km{est.}$ von etwa 50 \% +/- 20 \%. Die Unterschiede zwischen den Werten sind klein, aber die Fehlerbalken überlappen nicht allesamt, was man im Rahmen des oben gewonnenen Bildes interpretieren kann: die Zunahme der Dynamik durch die Temperaturerhöhung kompensiert im Wesentlichen die Einschränkung der Dynamik, welche aus der Zunahme des Faltungsgrades resultiert. Kleine, relative Unterschiede können dennoch festgestellt werden.


\begin{figure}[h,t]
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\begin{minipage}[h]{15.5cm}
\centerline{\fbox{\epsfysize=7cm\epsffile{/source/bilder_ergebnisse/reltauc.eps}}}
\caption{\label{taucrel} Auftragung der relativen Änderung von $\tau_\km{est.}$ im Temperaturintervall zwischen 278 und 348 K gegen die Sequenz $\km{G_1V_1G_2V_2P}$. Die einzelnen Aminosäurereste sind noch hinsichtlich der Kohlenstoffe, aus denen sie bestehen, in C-$\alpha$-, C-$\beta$-, C-$\gamma$-, C-$\delta$- und Carbonyl-Kohlenstoffe (C=O) unterteilt.}
\end{minipage}
\end{center}
\end{figure}

Abb. \ref{Arrheniusbackbone} zeigt die Auftragung des Logarithmus von $T_\km{1}$ gegen $T^\km{-1}$ gemäß der Arrheniusgleichung (vgl. Gleichung \ref{T1Arrhenius}) für die Rückgratkohlenstoffe. Abb. \ref{Arrheniussidechain} sind die entsprechenden Auftragungen für die Seitenkettenkohlenstoffe zu entnehmen. Der Eindruck, welcher schon bei der Betrachtung der Auftragung von $T_\km{1}$ gegen $T$ gewonnen wurde, bestätigt sich hier: während sich die Werte für einige Kohlenstoffkerne gut mit einer linearen Funktion annähern lassen (z.B. P-$\beta$, P-$\gamma$, V$_\km{2}-\gamma$), weichen die Datenpunkte für andere Kerne (z.B. P-C=O, P-$\delta$) erheblich von einer linearen Funktion ab. Diese Abweichungen vom Arrhenius-Verhalten deuten, wie oben schon diskutiert, auf eine Zunahme des Faltungsgrades innerhalb der Molekülpopulation hin.



\begin{figure}[p,h,t]
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\begin{minipage}[h]{15.5cm}
\centerline{\fbox{\epsfysize=22cm\epsffile{/source/bilder_ergebnisse/lnT1_backbone.eps}}}
\caption{\label{Arrheniusbackbone} Auftragung von ln($T_\km{1}$) gegen die reziproke Temperatur gemäß Gleichung \ref{T1Arrhenius} für die Rückgratkohlenstoffe von $\km{GVG(VPGVG)_3}$. Durch die Werte wurde mittels linearer Regression eine Gerade gelegt, aus deren Steigung die Aktivierungsenergie $E_\km{a}$ berechnet werden kann. Der Korrelationskoeffizient $R$ ist jeweils angegeben.}
\end{minipage}
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\end{figure}

\begin{figure}[p,h,t]
\begin{center}
\begin{minipage}[h]{15.5cm}
\centerline{\fbox{\epsfysize=17cm\epsffile{/source/bilder_ergebnisse/lnT1_sidechain.eps}}}
\caption{\label{Arrheniussidechain} Auftragung von ln($T_\km{1}$) gegen die reziproke Temperatur gemäß Gleichung \ref{T1Arrhenius} für die Seitenkettenkohlenstoffe von $\km{GVG(VPGVG)_3}$. Durch die Werte wurde mittels linearer Regression eine Gerade gelegt, aus deren Steigung die Aktivierungsenergie $E_\km{a}$ berechnet werden kann. Der Korrelationskoeffizient $R$ ist jeweils angegeben.}
\end{minipage}
\end{center}
\end{figure}

Betrachtet man sich die Werte der Tabelle \ref{13CT1tab} insgesamt, so spannen die Rotationskorrelationszeiten $\tau_\km{est.}$ in einem Bereich von $10^\km{-11}$ s für die Valin-$\gamma$-Kohlenstoffe bis $10^\km{-9}$ s für die Carbonylkohlenstoffe. Erwartungsgemäß weisen die Rückgratkohlenstoffe höhere Rotationskorrelationszeiten als die Seitenkettenatome auf. $\tau_\km{est.}$ liegt für letztere in einem Bereich, wie man ihn typischerweise für freie Aminosäuren erwartet (0,01 - 0,1 ns \cite{WinterNoll}). Die Dynamik ist für ein 18-meres Polypeptid also sehr hoch.

Insgesamt lassen sich die Ergebnisse am besten innerhalb eines Modells deuten, bei dem ein Ensemble von gefalteten bzw. teilgefalteten $\km{GVG(VPGVG)_3}$-Molekülen neben einem mit ungefalteten Konformationen koexistiert. Die hohe Dynamik spricht einerseits für eine hohe intrinsische Beweglichkeit, d.h. für einen hohen Anteil von Molekülen mit ungefalteten Konformationen. Andererseits deuten die Reduktion der Population der terminalen Glycine $a$ und $b$ mit steigender Temperatur sowie die Abweichungen einiger $T_\km{1}$-Zeiten vom Arrhenius-Verhalten auf eine Zunahme des Faltungsgrades innerhalb der Molekülpopulationen.
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\subsection{$^\km{1}$H-$^\km{1}$H-2D-NOESY} \label{kapnoesy}

Abb. \ref{NOESY} zeigt das Konturdiagramm des $^\km{1}$H-$^\km{1}$H-2D-NOESY-Spektrums von GVG(PVGVG)$_\km{3}$ bei Raumtemperatur. Im Amidbereich konnten nur sehr schwache Signale erhalten werden, vermutlich weil bei dem verwendeten pH von 7 die Austauschzeiten zu hoch sind und so die Amidsignale nicht mehr vom Spektrometer aufgelöst werden konnten. Daher ist in Abb. \ref{NOESY} der Hochfeldbereich nicht dargestellt. Im Tieffeldbereich ist eine größere Anzahl von Kontakten innerhalb von Aminosäureresten zu erkennen. So sind Kreuzkorrelationssignale für die Paare V$\gamma$-V$\beta$, V$\gamma$-V$\alpha$ und V$\alpha$-V$\beta$ der Valine sowie für P$\alpha$-P$\beta$, P$\beta$-P$\gamma$, P$\beta$-P$\delta$, P$\gamma$-P$\delta$  und P$\beta$-P$\delta$ des Prolins sichtbar. Als NOE-Kontakte zwischen verschiedenen Aminosäurereste können deutlich die Kreuzsignale zwischen V$\gamma$ und P$\delta$ sowie zwischen V$_\km{2}\alpha$ und P$\delta$ identifiziert werden. Letztere Zuordnung ist zwar etwas kritisch, da das P$\alpha$- und V$_\km{2} \alpha$-Signal sehr eng beieinanderliegen, aber der Vergleich mit der P$\alpha$-P$\delta$-Kreuzkorrelation zeigt, dass das betreffende Signal hierzu leicht hochfeldverschoben ist, also eher dem V$_\km{1} \alpha$ zugeordnet werden kann. Die Bestimmung dieser V$\gamma$-P$\delta$ und V$_\km{2}\alpha$-P$\delta$-Kontakte ist ein deutlicher Hinweis auf das Vorhandensein des Typ II-$\beta$-Schleifen Motivs, da man in diesem Fall genau diese Signale erwartet \cite{Urry1989}.

\begin{figure}[h]
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\begin{minipage}[h]{15.5cm}
\centerline{\fbox{\epsfysize=10cm\epsffile{/source/bilder_ergebnisse/NOESY.eps}}}
\caption{\label{NOESY} Konturdiagramm des homonuklearen $^\km{1}$H-2D-NOESY-Spektrums des Octadekamers bei 300 K. Zur Übersicht wurden Hilfslinien entlang der Frequenzen der jeweiligen Kerne gezogen. Neben den Signalen ist die relative Höhe der jeweiligen Signale (Integrale) vermerkt.}
\end{minipage}
\end{center}
\end{figure}

Die verschobene Prolin-$\delta$-Kopplung P-$\delta_\km{sh}$, welche schon im COSY-Spektrum aufgefallen ist (vgl. Abb. \ref{2DCOSY}), ist auch im NOESY-zu erkennen und zeigt Korrelationssignale mit dem P$\beta_\km{1}$/P$\gamma_\km{1}$-Bereich, was die vorgenommene Zuordnung bestätigt. Darüber hinaus lassen sich jedoch keine weiteren Kontakte finden.

Unterhalb der P$\delta_\km{2}$-Frequenz lässt sich ein weiteres Signal erkennen, welches von der Lage her ebenfalls einem Prolin-$\delta$ oder einem Glycin-$\alpha$ zugeordnet werden kann. Da es  NOE-Kontakte mit Prolin-$\beta$- und Prolin-$\gamma$-Protonen aufweist, handelt es sich hier wohl um ein leicht verschobenes Prolin-$\delta$-Proton (P$\delta_\km{3}$). Es koppelt wie Prolin-$\delta_\km{1}$ und Prolin-$\delta_\km{2}$ mit dem Valin-$\gamma$-Protonen, allerdings auch mit dem Prolin-$\alpha$ und interessanteweise nicht mir dem Valin$_\km{2}$-, sondern mit dem Valin$_\km{1}$-$\alpha$-Wasserstoff. Neben den Befund aus dem COSY-Spektrum besteht hiermit ein Hinweis auf eine weitere, zweite abweichende Prolin-Konformation mit signifikanter Population.

Neben den Valin-$\gamma$-Prolin-$\delta$-Kopplungen sind auch Kreuzkorrelationssignale zwischen Valin-$\gamma$- und der Prolin-$\beta$/Prolin-$\gamma$-Region erkennbar. Eine mögliche Erklärung dieser Signale könnte das Vorhandensein von Kontakten über die pentamere Untereinheit hinaus sein \cite{Urry1989}. Dies könnte als Hinweis auf einen Grad {\glqq höherer\grqq} Ordnung über die pentamere Untereinheit hinaus gewertet werden.

Weiterhin sind im NOESY-Spektrum Korrelationspeaks mit dem Lösungsmittel Wasser zu entnehmen, obwohl während der Experimente das Signal des Lösungsmittels unterdrückt wurde. Dementsprechend ist die Form der Kreuzsignale verzerrt, aber das reine Vorhandensein dieser Korrelationen ist bemerkenswert, zumal es sich anscheinend nicht um vollkommen unspezifische Artefakte handelt, da das Wasser nur mit bestimmten Kernen korreliert (Valin-$\gamma$, Valin-$\beta$, Glycin$_\km{1}$-$\alpha$, Valin$_\km{1}$-$\alpha$, Prolin-$\alpha$). Nichtsdestotrotz ist es unwahrscheinlich, dass es sich um echte, reine NOE-Kontakte handelt.

Insgesamt kann über das NOESY-Spektrum also das Typ II $\beta$-Schleifen-Motiv nachgewiesen werden. Daneben finden sich im Prolin-$\delta$-Bereich abweichende Signale, welche auf zwei konformere Proline deuten.





