\chapter{Diskussion}

\section{Hitzedenaturierung von HEL} \label{heathel}

Verglichen mit den Entfaltungstemperaturen, welche sich in der Literatur finden (siehe \cite{Petersen2004} und die Referenzen, die dort angegeben werden), liegt der hier mittels DSC bestimmten $T_\km{m}$-Wert von 70 °C bei einem pD von 3,4 um ca. 6 °C niedriger. Diese Abweichung kann einerseits daran liegen, dass in dieser Arbeit ein anderes Puffersystem verwendet wurde, welches die Stabilität von HEL beeinflussen kann. Andererseits weist die pH-abhängige Stabilitätskurve von HEL im Bereich zwischen pH 4 und 2 einen starken Abfall auf, so dass geringe pH-Änderungen hier zu einer drastischen Verschiebung von $T_\km{m}$ führen können. So finden sich bei \cite{Petersen2004} für einen pH von 3,8 Werte für $T_\km{m}$, $\Delta H_\km{cal}$ und $\Delta H_\km{H}$ von etwa 76~°C, 430~kJ/mol und 490 kJ/mol. Die Enthalpieänderungen $\Delta H_\km{cal}$ weichen also um knapp 10, die van't-Hoff-Enthalpien um knapp 5 \% voneinander ab. In Anbetracht des unterschiedlichen pHs und der Tatsache, dass die Enthalpie-Werte je nach verwendeten Basislinien-Modell variieren können, sind diese Abweichungen akzeptabel. Die Motivation zur Durchführung der mikrokalorimetrischen Messungen innerhalb dieser Arbeit lag auch weniger in der Bestimmung thermodynamischer Kenndaten, als in der Charakterisierung des Übergangs, welcher sich auf Basis der DSC-Daten  innerhalb eines Zweizustandsmodells interpretieren läßt. Die PPC-Kurve läßt sich ebenfalls in diesem Rahmen interpretieren. Die Änderungen von $\alpha(T)$ fallen in dieser Arbeit größer aus, als in der Literatur berichtet \cite{Lin2002}, allerdings läßt sich dies auch auf unterschiedliche pHs sowie der Tatsache zurückführen, dass hier, um eine Vergleichbarkeit mit den NMR-Daten zu gewährleisten, mit $\km{D_2O}$-Puffer gearbeitet wurde. Dieses ist strukturierter als normales, leichtes Wasser und führt so zu größeren temperaturabhängigen Änderungen von $\alpha$.
Die Charakterisierung des Entfaltungsübergangs durch die $^\km{1}$H-NMR-spektroskopische Bestimmung des Histidin 15-$\delta$-Signals bestätigt die Zuordnung zu einem Zweizustands-Modell. Dies ist etwas verwunderlich, da in den kinetischen Protonen-Austauschexperimenten ein Zwischenzustand gefunden wird.

Klassischerweise wird die Hitzedenaturierung von Lysozym, anders als beim homologen $\alpha$-Lact\-al\-bu\-min, im Gleichgewicht als Zweizustandsübergang beschrieben, welches nur ein transientes Intermediat aufweist \cite{Sugai1994}. Ausnahmen sind hier das Lysozym aus Pferde- und Hundemilch, welche einen stabilen {\it Molten Globule}-Zustand ausbilden \cite{Koshiba2000, Kobashigawa2000,Morozova1995}. Allerdings wird in neueren Arbeiten von teilweise entfalteten Gleichgewichts-Zwischenzuständen unter Einfluss von Guanidiumhydrochlorid und niedrigem pH (pH 0,9; \cite{Sasahara2000, Sasahara2002}) sowie Hitze \cite{Hirai1999, Arai1999, vanStokkum1995} berichtet. In einer theoretischen Arbeit mittels Computersimulationen wurde ein initiales, {\glqq quasi-stabiles\grqq} Intermediat bei der thermischen Entfaltung gefunden, in welchem sich die Sekundärstruktur umlagert \cite{Mark1992}.

Vor diesem Hintergrund gilt es, das auf Basis der Protonen-Austausch-NMR gefundene Intermediat einzuordnen. Die in dieser Arbeit gewonnenen Daten legen aufgrund der Abwesenheit eines Hinweises für diesen Zwischenzustand in den DSC-Messungen nahe, dass es sich tatsächlich um ein rein transientes, kinetisches Phänomen handelt. Die Diskussionen über Gleichgewichts- und transiente Zustände des Lysozyms in der Literatur zeigen jedoch, dass hier nicht voreilig geschlossen werden darf: Möglicherweise fällt dieses Intermediat bei der Verwendung von Standardmethoden wie CD-Spektroskopie oder DSC nicht auf, und erst der Einsatz kombinierter Methoden wie DSC und SAXS \cite{Hirai1999, Arai1999}, Protonenaustauschbestimmung mittels FTIR \cite{vanStokkum1995} oder die direkte Suche nach diesem Intermediat \cite{Sasahara2000, Sasahara2002} führen zu Anhaltspunkten, die auf das Vorhandensein dieses Zwischenzustands schließen lassen. Es könnte sein, dass dieses Intermediat mittels DSC nicht detektierbar ist und nur über struktursensitive Methoden wie z.B. der Protonen-Austausch-$^\km{1}$H-NMR-Spektroskopie nachgewiesen werden kann. Interessanterweise wurde in \cite{vanStokkum1995} das Intermediat ebenfalls über Protonen-Deuteronen-Substitution, die aber über FTIR-Spektroskopie vermessen wurde, gefunden. Allerdings tritt dort der Zwischenzustand schon bei vergleichsweise niedrigen Temperaturen ($\approx$ 46 °C) auf.

Es gibt also genügend Hinweise, das gefundene Intermediat diesem bereits in der Literatur diskutierten Zwischenzustand zuzuordnen. Ob es sich um einen stabilen oder transienten handelt, kann auf Grundlage der ermittelten Daten nicht entschieden werden, aber die in dieser Arbeit vorgenommene Charakterisierung über $P$-Faktoren ist in der Lage, den Strukturgrad dieses Intermediates einzuordnen und ihn mit $P$-Faktoren bekannter  {\it Molten Globule}-Zustände anderer Proteine zu vergleichen. So sollte eine Einordnung dieses Intermediates zum bekannten {\it Molten Globule} oder, falls die $P$-Faktoren niedriger sind, zu einem Zustand, der einer vollständig entfalteten Konformation $D$ näher steht, möglich sein. Sollte Letzteres der Fall sein, gäbe es eine Erklärung für die Abwesenheit eines Hinweises auf diesem Zustand im DSC: da das Intermediat mehr $D$ ähnelt als $N$, wäre der Übergang vom Intermediat zu $D$ kaum bemerkbar, da nur wenn der Übergang vom Intermediat zu $D$ mit einer signifikanten Enthalpieänderung verbunden ist, dies mittels DSC detektiert werden kann.

Ein Vergleich mit $P$-Faktoren aus der Literatur ist jedoch insofern schwierig, als die Darstellungen der Zwischenzustände von der Destabilisierung durch chemische Denaturantien über thermische Einwirkung bis zu Rückfaltungsexperimenten reichen, bei der das Protein ausgehend von der entfalteten Form $D$ renaturiert wird. Weiterhin muss zwischen kinetischen und Gleichgewichtsexperimenten unterschieden werden. Darüber hinaus kann auch die Zuordnung zu einem {\it Molten Globule} kritisch sein: die Bindung von 1-Anilino\-naptha\-lin-8-sulfon\-säure, welche früher ein Kriterium hierfür war, erscheint zweifelhaft \cite{Baldwin1993}. Für ein pH-induziertes, teilweise entfaltetes Intermediat von Apomyoglobin werden $P$-Faktoren bis 200 angegeben \cite{Hughson1990}; die harnstoffdenaturierte Form des T4-Lysozyms weist Schutzfaktoren bis knapp 4, das Rückfaltungsintermediat $P$-Faktoren bis zu 200 auf \cite{Lu1992}. Für das kinetisches Intermediat der P117G-Mutante der Staphylococcen Nuklease werden Schutzfaktoren bis zu 63 gefunden \cite{Jacobs1994}. Durch chemische Agentien kann bei HEL ein teilentfalteter Zustand induziert werden. Hierfür wird in einer 25 \% wässrigen Hexafluoracetonlösung von $P$-Faktoren bis zu 70 berichtet (\cite{Bhattacharjya1997}, die Autoren bezeichnen diesen Zustand als {\glqq {\it molten globule like} \grqq}). Die durch 25 \% Trifluorethanol induzierte Form weist Schutzfaktoren bis 200 auf \cite{Buck1993}. Verglichen mit diesen Werten erscheinen die hier für HEL Ermittelten sehr klein und es liegt nahe, dass es sich bei dem thermisch induzierten Intermediat von HEL weniger um ein {\glqq klassisches\grqq} {\it Molten Globule} handelt, sondern dass dessen Konformation eher dem des vollständig entfalteten Zustands $D$ ähnelt. Dies würde auch die Schwierigkeit erklären, diesen Zustand zu detektieren: Da beim Übergang der denaturierten Form zum Intermediat nur geringe (energetische) Änderungen aufträten und der Hauptteil sich beim Übergang vom Intermediat zur nativen Form ergäbe, wirkt die Entfaltung insgesamt wie ein Quasi-Zwei-Stufen-Prozess. Dieses Bild stünde im Einklang mit unseren Messergebnissen und den Literaturdaten, bestätigt wird es weiterhin durch die Größe der $P$-Faktoren für das Intermediat, welche niedriger als diejenigen sind, welche sich in der Literatur finden.

In dieser Arbeit wurde, nach Wissen des Autors, zum ersten Mal das thermisch induzierte Intermediat von HEL über $P$-Faktoren identifiziert und charakterisiert. Zwar wurden Schutzfaktoren für die Hitzedentaturierung von HEL bereits veröffentlicht \cite{Buck1994, Radford1992}, doch berichten diese nicht über ein Intermediat und ordnen nicht die gemessenen $P$-Faktoren explizit einem Zwischenzustand zu. Außerdem wurden diese Messungen bei einem anderen pH und nahe der mittleren Entfaltungstemperatur $T_\km{m}$ vermessen, während in dieser Arbeit der Protonenaustausch bei 80 °C und damit bei einer Temperatur durchgeführt wurde, bei dem HEL im thermodynamischen Gleichgewicht vollständig denaturiert vorliegt. Dennoch sollen an dieser Stelle die hier gemessenen Werte mit der Literatur verglichen werden, bietet sich doch hier eine Möglichkeit eines direkten Vergleichs, da beide Datensätze unter thermischer Einwirkung gemessen wurden. Abb. \ref{Bucklit} zeigt einen Vergleich der $P$-Faktoren in Abhängigkeit der Sequenzposition, wie sie nach \cite{Buck1994} bei einer Temperatur von 69 °C und in dieser Arbeit bei 80 °C bestimmt wurden. Es fällt auf, dass die Werte in der Größenordnung übereinstimmen, im Detail sich allerdings teilweise erhebliche Differenzen zeigen. Im Mittel weichen die Werte um 40 \% voneinander ab, insbesondere im $\beta$-Faltblattbereich zwischen den Resten 41 und 60 findet man starke Unterschiede. Bei den Experimenten in dieser Arbeit scheint also die $\beta$-Domäne strukturierter zu sein. Übereinstimmend jedoch finden sich die höchsten Schutzfaktoren an bzw. nahe bei verbrückten Cysteinen (Cystein 64 und 97; das Cystein 115 konnte in der vorliegenden Arbeit leider nicht aufgelöst werden). Unter Berücksichtigung der unterschiedlichen Temperaturen und der Tatsache, dass bei der Berechnung von $k_\km{rc}$ die Aktivierungsenergien als temperaturunabhängig angenommen werden, stimmen die Werte, bis auf diejenigen im $\beta$-Faltblattbereich, recht gut überein.

Buck {\it et al.} beschreiben den thermisch induzierten denaturierten Zustand auf Basis der niedrigen $P$-Faktoren als einen im Wesentlichen Entfalteten, dessen Reststruktur starken Fluktuationen unterliegt. Dies steht im Einklang mit den obigen Betrachtungen, die das Intermediat weniger als {\it Molten Globule} als einen Zustand, der einem vollständig Entfalteten entspricht, charakterisieren.


\begin{figure}[h]
\begin{center}
\begin{minipage}[h]{15.5cm}
\centerline{\fbox{\epsfysize=10cm\epsffile{/source/bilder_diskussion/bucklit.eps}}}
\caption{\label{Bucklit} Vergleich der $P$-Faktoren für das thermisch induzierte Intermediat (weiße Balken) und nach Buck {\it et al.} (\cite{Buck1994}; schwarze Balken). Große Abweichungen finden sich im $\beta$-Faltblattbereich zwischen Aminosäurerest 41 und 60; übereinstimmend finden sich die höchsten $P$-Faktoren bei oder nahe bei den disulfidverbrückten Cysteinen 64 und 97.}
\end{minipage}
\end{center}
\end{figure}


In der Literatur konnte gezeigt werden, dass die Anwesenheit von Sorbitol die Aktivierungsenergie der Entfaltung von HEL kaum beeinflusst \cite{Petersen2004} und dies wurde dahingehend gedeutet, dass hier die Stabilisierung der nativen Form $N$ über die Destabilisierung der entfalteten Form $D$ erreicht wird. Wie auf Basis des preferentiellen-Ausschluss-Mechanismus' zu erwarten (siehe Kap. \ref{cosolv}), interagiert Sorbitol nicht mit der nativen Form $N$, sondern hauptsächlich mit dem Lösungsmittel Wasser, wodurch sich das chemische Potential des hydratisierten Proteins erniedrigt. Dies steht im Einklang mit dem Befund, dass für das thermisch induzierte Intermediat von HEL kaum Änderungen der $P$-Faktoren bei Anwesenheit von Sorbitol verzeichnen lassen: Das Sorbitol sorgt im Wesentlichen für eine Destabilisierung der vollständig entfalteten Form, die Konformation des nativen Zustands $N$ oder evtl. Intermediate wird hingegen kaum beeinflusst \cite{Wimmer1997}. Bei erhöhten Temperaturen, bei der die Konfigurationsentropie $\Delta S_\km{conf.}$ die treibende Kraft der Hitzdenaturierung ist, fällt der Einfluss des Sorbitols also kaum ins Gewicht.

Insgesamt gesehen legen die Daten also das Vorhandensein eines kinetischen, möglicherweise auch thermodynamisch stabilen, Intermediates nahe, welches nur noch einen geringen Rest an nativer Struktur besitzt, welches aber von den $P$-Faktoren her weniger als {\it Molten Globule} zu bezeichnen ist. Die Werte legen einen niedrigeren Strukturgrad nahe, bei dem der höchste Schutz durch Cysteinbrücken vermittelt wird.


\section{Kältedenaturierung von HEL}

Vergleicht man die $P$-Faktoren der Kältedenaturierung mit denen, welche bei thermischer Destabilisierung von HEL erhalten wurden, so ist ersichtlich, dass sie wesentlich größer sind. Bei der Kältedenaturierung handelt es sich offensichtlich um eine mildere Art der Entfaltung, bei der ein höherer Grad an Reststruktur erhalten bleibt. Die Höhe der Schutzfaktoren passt eher zu den Werten, wie sie für stabile Intermediate bzw. {\it Molten Globules} berichtet werden (vgl. Kap. \ref{heathel}). Vergleicht man die hier erhaltenen $P$-Faktoren mit denen, wie sie von Nash {\it et al.} \cite{Nash1997} berichtet werden, so fällt auf, dass die hier bestimmten Werte etwas größer sind; das Cystein 97 zeigt einen starken Unterschied. Dies könnte darin begründet sein, dass Nash {\it et al.} 1,5 mM 3-(Trimethylsilyl)-2, 2, 3, 3-d$_\km{4}$-Propionsäure als Referenzsubstanz verwendeten. In dieser Arbeit fiel bei Vorexperimenten auf, dass 3-(Trimethylsilyl)-1-Propansulfonsäure, welches zur Kalibrierung der chemischen Verschiebung dient, ein deteregenzähnliches Verhalten aufwies und zur Schaumbildung führte, weshalb bei den Experimenten auf derlei Referenzsubstanz verzichtet wurde. Insbesondere bei der Kältedenaturierung, bei der Hydratisierungsphänomene vermutlich eine dominierende Rolle spielen, könnten Detergenzien einen unerwünschten Einfluss nehmen. Dies könnte die Unterschiede, welche gefunden wurden, erklären. Insgesamt jedoch stimmen die Werte qualitativ überein und bestätigen, dass es sich bei dem druckunterstützten, kältedenaturierten Zustand um eine teilentfaltete Struktur handelt.

Ein Ziel dieser Arbeit war es auch, den Einfluss chaotroper bzw. kosmotroper Substanzen auf die Struktur eines stabilen, teilentfalteten Zustands zu untersuchen. Die meisten Studien bisher charakterisierten stabilisierende bzw. destabilisierende Einflüsse über die Bestimmung makroskopischer Parameter wie $T_\km{m}$ oder thermodynamischer Größen wie $\Delta G_\km{unf.}$; Einflüsse auf molekularem Niveau konnten darüber hinaus nicht erhalten werden. Eine interessante Frage ist diejenige, ob Cosolventien einen schrittweisen Einfluss haben, d.h. ob sie nach und nach diskrete Elemente innerhalb des Proteins stabilisieren bzw. destabilisieren, oder ob der Einfluss hochkooperativ verläuft, d.h. das Protein konzertiert, quasi im Sinne eines \glqq{Alles-oder-nichts \grqq}-Phasenübergangs betrifft. Dies ist auch hinsichtlich der Frage wichtig, was unter einer {\glqq teilentfalteten\grqq} Struktur genau zu verstehen ist: Handelt es sich um eine Struktur, bei der bestimmte Strukturelemente persistent vorhanden sind, während andere dauerhaft entfaltet sind, oder eher um ein Ensemble von Strukturen, die mehr oder minder Fluktuationen unterliegen.

Im Lichte der erhobenen Daten scheint für die druckunterstützte Kältedenaturierung von HEL letzteres der Fall zu sein. Es konnten keine Abschnitte innerhalb der Sequenz gefunden werden, welche Hinweise auf eine abweichenden Grad an Stabilisierung bzw. Destabilisierung aufwiesen. Der Einfluss der Colsolventien ist sehr einheitlich, d.h. verläuft hochkooperativ.

Daher bedeutet {\glqq teilentfaltete Struktur\grqq} also weniger, dass bestimmte Bereiche von HEL gefaltet sind, während andere vollkommen entfaltet sind, sondern dass alle Bereiche des Proteins zu einem gewissen Grad fluktuieren, d.h. teilentfaltet sind.


\section{Thermisch induzierte Faltung des Polypeptids \\ $\km{GVG(VPGVG)_{\km{3}}}$}

Bei der Bestimmung der $T_\km{1}$-Zeiten konnte für keinen $^\km{13}$C-Kern eine Abnahme der Werte mit Erhöhung der Temperatur festgestellt werden. Lediglich die Abweichungen vom Arrhenius-Verhalten können als ein Indiz für eine Zunahme des Strukturgrades, d.h. der Bildung der $\beta$-Schleifen-Konformation gewertet werden. Die Anwesenheit dieses Strukturmotivs konnte durch die Valin-$\gamma$-Prolin-$\delta$- und Valin$_\km{2}$-$\alpha$-Prolin-$\delta$-Kopplungen belegt werden. Auch konnte durch CD-spektroskopische Messungen, welche von Chiara Nicolini am Lehrstuhl für Physikalische Chemie I der Universität Dortmund durchgeführt wurden (siehe Abb. \ref{CD}), ein Übergang von einer ungeordneten zu einer $\beta$-Schleifen-Konformation in einem breiten Bereich zwischen ca. 0 °C und 100 °C nachgewiesen werden.

\begin{figure}[h]
\begin{minipage}[h]{15.5cm}
\centerline{\fbox{\epsfysize=7cm\epsffile{/source/bilder_diskussion/CD18mer.eps}}}
\caption{\label{CD} Änderungen der Ellipitizität des Octadekamers bei 197 ($\Box$) und 217 ($\circ$) nm zwischen 0 und 100~°C. Die Änderungen belegen den Übergang von einer ungeordneten zu einer Typ II $\beta$-Schleifen-Konformation.}
\end{minipage}
\end{figure}

Eine Erklärung für die Abwesenheit einer absoluten Abnahme an Beweglichkeit liegt wahrscheinlich in der generell hohen Dynamik des Octadekamers. Die abgeschätzten Rotationskorrelationszeiten liegen teilweise in dem Bereich für freie Aminosäuren, was von einer sehr hohen Mobilität des Moleküls zeugt. Wenn die Moleküle viele Freiheitsgrade an Bewegung besitzen, welche bei der Zunahme der Temperatur weiter angeregt werden, könnte im Vergleich dazu die Abnahme der Dynamik durch die Zunahme an Struktur sehr gering ausfallen. Der Übergang erstreckt sich über einen weiten Temperaturbereich (vgl. Abb. \ref{CD}), so dass dem System beim Übergang viel thermische Energie zugeführt wird. So erhöht sich im gesamten die Dynamik des Systems, und die Zunahme des Faltungsgrades macht sich daher nur in kleinen Abweichungen vom Arrhenius-Verhalten bemerkbar.

Die Aktivierungsenergien $E_\km{a}$, welche für $\km{GVG(VPGVG)_3}$ bestimmt wurden, liegen zwischen 5 (P-$\delta$) und 15 kJ mol$^\km{-1}$ (G$_\km{2}$-C=O). Für Kohlenstoffe des Dekapeptids {\it LHRH} (engl.: {\it Luteinizing Hormone-Releasing Hormone}) z.B. findet man in der Literatur \cite{Deslauriers1977} Werte zwischen etwa 10 und 30 kJ mol$^\km{-1}$. Die hier am $\km{GVG(VPGVG)_3}$-Molekül bestimmten Werte liegen also im Mittel um den Faktor zwei niedriger und zeugen von einer niedrigen Rotationsbarriere für die Aminosäurereste des elastin-mimetischen Peptids.

NMR-spektroskopisch konnten Subpopulationen identifiziert werden: In den $^\km{13}$C-1D-Spektren konnten zusätzliche Signale von zwei Glycinen und einem Valin$_\km{1}$ entdeckt werden. Anhand der $T_\km{1}$-Zeiten befinden sich die Glycine vermutlich in terminalen Positionen; sie könnten aber beide auch zu einer einzigen terminalen GVG-Gruppierung gehören. Der $T_\km{1}$-Wert des Valins $c$ lässt keine eindeutige terminale Zuordnung zu. In den homonuklearen $^\km{1}$H-2D-COSY- und NOESY-Spektren finden sich verschobene Prolin-$\delta$-Signale (P-$\delta_\km{sh}$ und P-$\delta_\km{3}$), die auf Subpopulationen mit Prolinen in abweichender Konformation schließen lassen. Dementsprechende Abweichungen in den $^\km{13}$C-Spektren sind allerdings nicht zu verzeichnen. Für die verschobenen Prolin-$\delta_\km{sh}$-Kopplung im 2D-COSY-Spektrum lassen sich im NOESY-Spek\-trum keine weitergehenden Informationen gewinnen. Das verschobene Prolin-Signal im NOESY (Prolin-$\delta_\km{3}$) hingegen zeigt ein Kreuzkorrelationssignal mit einem Valin-$\alpha$ in der Position 1. Dies ist etwas ungewöhnlich, da das Prolin und das Valin$_\km{1}$ durch das Glycin$_\km{1}$ voneinander getrennt sind, was für eine ungewöhnliche Geometrie der beteiligten Reste spricht. Eine Erklärung hierfür wäre, dass der Kontakt über die pentamere Untereinheit hinaus zustande kommt. Das carboxy-terminale Valin$_\km{1}$ z.B. kann dem N-terminalen Prolin sehr nahe kommen. Der Befund, dass auch NOE-Korrelationssignale zwischen der Valin-$\gamma$- und der Prolin-$\beta$/Prolin-$\gamma$-Region gefunden wurden, spricht für diese Erklärung. In der Struktur des $\km{GVG(VPGVG)_3}$ in der $\beta$-Schleifenkonfiguration (vgl. Abb. \ref{urrybeta}) nähern sich die $\gamma$-Protonen des carboxy-terminalen Valin$_\km{1}$ den $\beta$-Protonen des N-terminalen Prolins bis auf etwa 0,22 nm; der geringste Abstand zwischen den entsprechenden Valin-$\gamma$-Protonen und Prolin-$\gamma$-Protonen beträgt ca. 0,33 nm. Auf Basis dieser Struktur ließe sich das Vorhandensein der jeweiligen NOE-Kontakte also erklären. Allerdings beträgt der Abstand zwischen dem Valin$_\km{1}$-$\alpha$- und den Prolin-$\delta$-Protonen hier gut 8 nm, was unvereinbar mit dem vorhandenen NOE-Signal zwischen dem Prolin-$\delta_\km{3}$ und einem Valin$_\km{1}$-$\alpha$ ist. Hier müsste, wenn das Signal wirklich aus der Nähe des carboxy-terminalen Valins und des N-terminalen Prolins resultiert, eine andere Geometrie vorliegen.

Ob es sich bei dem hier gefundenen Kontakt zwischen dem Prolin-$\delta_\km{3}$- und dem Valin$_\km{1}$-Signal um dasjenige Valin$_\km{1}$ handelt, welches in den $^\km{13}$C-Spektren aufgefallen ist (Signal {\it c}), kann aufgrund mangelnder verbindener Informationen zwischen $^\km{13}$C- und $^\km{1}$H-Spektren nicht beurteilt werden. Eine Auswertung der Signalintensitäten im NOESY gemäß der ISPA (engl.: {\it isolated spin pair approximation}) um die Kernabstände zu berechnen, ergab keine sinnvoll interpretierbaren Ergebnisse. Wahrscheinlich war die gewählte Mischzeit von 1,2 s für eine quantitative Analyse zu lang und/oder die Dynamik entlang der Polypetidkette zu hoch und zu heterogen, so dass hierüber keine zusätzlichen Informationen erhalten werden konnten. Ein Zusammenhang zwischen dem Prolin-$\delta_\km{3}$-Valin$_\km{1}$-$\alpha$ Korrelationssignal und dem zusätzlichen Signal {\it c} des $^\km{13}$C-1D-Spektrums sowie eine Zuordnung des entsprechenden Valins zu einer terminalen Position liegt insofern nahe, als dass der NOE-Kontakt strukturell schlecht über eine räumliche Nähe innerhalb einer pentameren Einheit erklärt werden kann; weiterhin zeigt das Signal {\it c} des $^\km{13}$C-1D-Spektrums wie die Signale der terminalen Glycine {\it a} und {\it b} eine Intensitätsabnahme mit steigender Temperatur. Dem steht allerdings die relativ geringe Dynamik entgegen, die nicht wesentlich höher als die des V$_\km{1}$-Hauptsignals ist. Sollte also ein terminales V$_\km{1}$ Urheber obiger Signale im $^\km{1}$H,$^\km{1}$H-2D-NOESY- und im $^\km{13}$C-1D-Spektrum sein, so müsste es strukturell über z.B. eine Wasserstoffbrücke stabilisiert sein, um die relativ geringen $T_\km{1}$-Zeiten zu erklären.

\begin{figure}[h,t,p]
\begin{minipage}[h]{15.5cm}
\centerline{\fbox{\epsfysize=7cm\epsffile{/source/bilder_diskussion/18merVorschlag_2.eps}}}
\caption{\label{betaNOE} 3D-Darstellung der Aminoäurereste V$_\km{2}$ und P von $\km{GVG(VPGVG)_3}$ im $\beta$-Schleifen-Motiv. Das V$_\km{2}$-$\alpha$-Proton und die V$_\km{2}$-$\gamma$-Protonen sind nahe bei den P-$\delta$-Protonen und führen so zum entsprechendes Kreuzkorrelationssignal im NOESY-Spektrum. }
\end{minipage}
\end{figure}

\begin{figure}[h,t,p]
\begin{minipage}[h]{15.5cm}
\centerline{\fbox{\epsfysize=9cm\epsffile{/source/bilder_diskussion/18merVorschlag_1.eps}}}
\caption{\label{interNOE} Interpentamerer Kontakt zwischen dem carboxyterminalen Valin und N-terminalen Prolin, das die gefundenen V-$\gamma$-P-$\beta$/$\gamma$-Kontakte erklären könnte.  }
\end{minipage}
\end{figure}

Die sich aus diesen Erörterungen ergebenden Konsequenzen für die Konformation des Polypeptids im teilgefalteten Zustand sind in Abb. \ref{betaNOE} bis \ref{Vorschlag} zusammengefasst. Abb. \ref{betaNOE} zeigt die Struktur zwischen dem V$_\km{2}$ und dem P in der $\beta$-Schleifen-Konformation und verdeutlicht, wie die Nähe der $\alpha$-, $\gamma$ und $\delta$-Protonen die vorgefundenen NOE-Signale erklären kann und auf das Vorhandensein der Typ II-$\beta$-Schleife zurückzuführen sind. Abb. \ref{interNOE} ist ein strukturelles Muster zu entnehmen, welches die Ursache der NOE-Signale zwischen V-$\gamma$- und P-$\beta$/$\gamma$-Protonen sein könnte. Durch die räumliche Nähe einzelner $\beta$-Schleifen (hier: der ersten und der dritten) können sich die jeweiligen Protonen nahe kommen. Natürlich sind auch andere Konformationen denkbar, die zu einer Nähe entsprechenden Protonen führen könnten. Ein Vorschlag, wie die Konformation aussehen könnte, die zu dem Muster der Kreuzkorrelationen des Signals $\delta_\km{3}$ passt, ist in Abb. \ref{Vorschlag} dargestellt. Eine Kopplung zwischen P-$\delta$-Protonen und einem V$_\km{1}$-$\alpha$-Proton ist auch hier innerhalb des pentameren $\km{G_1V_1G_2V_2P}$-Motivs eher unwahrscheinlich. Damit aber die P-$\delta$-Protonen exponiert genug sind, müsste das Prolin so orientiert sein, dass die entsprechende $\beta$-Schleife nicht mehr ausgebildet werden kann (entsprechend fehlt der P-$\delta$-V$_\km{2}$-$\alpha$-Kontakt). Wenn das gegenüberliegende V$_\km{1}$ entsprechend orientiert ist, kann ein interpentamerer NOE-Kontakt entstehen. Allerdings ist auf Basis dieser Struktur nicht zu erklären, wie es zum NOE-Kontakt zwischen dem P-$\delta$ und dem P-$\alpha$ kommt.

Es ist zu betonen, dass die hier gezeigten Strukturen Vorschläge sind, die bildlich herausstellen sollen, welche Informationen dem NOESY-Spektrum, das bei Raumtemperatur gemessen wurde, zu entnehmen sind. Sie beschreiben mögliche stabile Konformationen, welche neben der ungeordneten Konformation auftreten, die den Hauptteil im Ensemble der Peptidmolküle darstellt. Auch von den Vorschlägen abweichende Strukturen sind denkbar, welche die Signale im NOESY-Spektrum erklären können, jedoch ist die relativ kompakte Struktur der Abb. \ref{urrybeta}, auf der die Überlegungen basieren, durchaus plausibel. Insgesamt kann aufgrund der Komplexität des Systems mit drei pentameren VPGVG-Sequenzen, die vielerlei Konformationen annehmen könne, über die zugrundeliegenden Strukturen nur spekuliert werden. Hier böten sich molekulardynamische Simulationen an, in denen gezielt nach Subpopulationen gesucht und deren Struktur mit den NMR-Ergebnissen verglichen werden kann. Tabelle \ref{18merfeatures} fasst die gefundenen Signale, den spektroskopischen Nachweis und die Zuordnung bzw. weitergehende Interpretation der Daten zusammen.

\begin{figure}[h,t]
\begin{minipage}[h]{15.5cm}
\centerline{\fbox{\epsfysize=9cm\epsffile{/source/bilder_diskussion/18merVorschlag_3.eps}}}
\caption{\label{Vorschlag} Strukturvorschlag für das Polypeptid $\km{GVG(VPGVG)_3}$ auf Basis der $\delta_\km{3}$-Kreuzkorrelationen. Die N-terminale $\beta$-Schleife ist, ausgehend von der Struktur in Abb. \ref{urrybeta} bzw. \ref{betaNOE}, durch Drehung des Prolins aufgelöst worden, was die P-$\delta$-Protonen zum carboxy-terminalen Valin exponiert. Dies trägt der Beobachtung Rechnung, dass das P-$\delta_\km{3}$ nicht mit einem V$_\km{2}$-$\alpha$ koppelt. Das carboxyterminale V$_\km{1}$ ist so gedreht worden, dass sein $\alpha$-Proton den P-$\delta$-Protonen zugewandt ist und so einen NOE-Kontakt zwischen einem P-$\delta$ und einem V$_\km{1}$-$\alpha$, wie er hier gefunden wurde, erklären könnte.}
\end{minipage}
\end{figure}

\begin{table}[h,t]
\begin{center}
\caption{\label{18merfeatures} Zusammenfassende Darstellung der NMR-Ergebnisse über die Hochtemperaturkonformation des Polypeptids $\km{GVG(VPGVG)_3}$.}
\begin{tabular}{|c|c|c|}
\hline
Signal bzw. Kopplung & Methode & Zuordnung \\
\hline
V-$\gamma$-P-$\delta$ & $^\km{1}$H,$^\km{1}$H-2D-NOESY & Typ II $\beta$-Schleife, CD-spektroskopisch  \\
V$_\km{2}$-$\alpha$-P-$\delta$ &  &  bestätigt \\
\hline
V-$\gamma$-P-$\beta$/$\gamma$ & $^\km{1}$H,$^\km{1}$H-2D-NOESY & interpentamerer NOE-Kontakt \\
\hline
verschobene P-$\delta$-H- & $^\km{1}$H,$^\km{1}$H-2D-COSY und  & konformeres Prolin  \\
Kopplung P-$\delta_\km{sh}$ &  -NOESY &  \\
\hline
P-$\delta_\km{3}$-V$_\km{1}$-$\alpha$ & $^\km{1}$H,$^\km{1}$H-2D-NOESY & konformeres Prolin, ( interpenta-  \\
P-$\delta_\km{3}$-P-$\alpha$    &   & merer NOE-Kontakt des terminalen V$_\km{1}$ ?)\\
\hline
G-Carbonyl-{\it a} und {\it b} & $^\km{13}$C-1D-NMR, HSQC,   & terminale Reste, Anteil nimmt  \\
G-$\alpha$-{\it d} & HMQC, $^\km{13}$C-$T_\km{1}$-Relaxation & mit steigender Temperatur ab \\
\hline
V$_\km{1}$-Carbonyl-{\it c} & $^\km{13}$C-1D-NMR, HSQC,  & konformere Aminosäuregruppe, (termi-  \\
G-$\alpha$-{\it e} & HMQC, $^\km{13}$C-$T_\km{1}$-Relaxation & nale Gruppierung, die auch Urheber des  \\
 & & P-$\delta_\km{3}$-V$_\km{1}$-$\alpha$-NOE-Kontakts ist ?), Anteil \\
  & & nimmt mit steigender Temperatur ab \\
\hline

\end{tabular}
\end{center}
\end{table}



Vergleicht man die Ergebnisse der NMR-spektroskopischen Charakterisierung von $\km{GVG(VPGVG)_3}$ insgesamt mit denen, wie sie für die hochpolymere Form dieses Polypeptids beschrieben werden ($M_\km{r} \approx \km{10^5 g/mol}$, \cite{Kurkova2003}), so fällt auf, dass sie im Wesentlichen übereinstimmen. Für niedrige Temperaturen stimmen die $^\km{13}$C-1D-Spektren bzgl. den Hauptsignale überein, lediglich die hier als zusätzliche Signale identifizierten fehlen, was die Zuordnung dieser zu terminalen Gruppen erhärtet. Bei höheren Temperaturen ändern sich die spektralen Eigenschaften des Hochpolymers, was in der Literaturstelle auf (Pre-)Aggregationsphänomene zurückgeführt wird. Derlei Änderungen konnten für das Octadekamer nicht gefunden werden.

Auch stimmen die gefundenen $T_\km{1}$-Werte gut überein, was angesichts der Tatsache überrraschend ist, als die hochpolymere Form eine molekulare Masse besitzt, welche ca. 70 mal größer ist als die des Octadekamers. Für $\km{GVG(VPGVG)_3}$ finden sich sogar Relaxationszeiten, welche niedriger sind als die des Hochpolymers. Da $T_\km{1}$ invers proportional zur Rotationskorrelationszeit ist (siehe Formel \ref{tauest}), bedeutet dies, dass die Dynamik dieser Kerne im Octadekamer niedriger als im Hochpolymer ist. Eine Erklärung hierfür wäre, dass es im Wesentlichen interne Bewegungen sind, die die Dynamik des $\km{GVG(VPGVG)_3}$-Polypetids ausmachen und Translations- sowie Rotationsbewegungen des gesamten Moleküls, welche bei kleineren Molekülen schneller sind, nicht so sehr ins Gewicht fallen.

Zusammenfassend lassen sich die Daten im Rahmen eines Überganges von einer ungeordneten Konformation der pentameren (VPGVG)-Einheit in eine $\beta$-Schleifen-Konformation des Typs II interpretieren. Bei Raumtemperatur konnte das $\beta$-Schleifen-Motiv nachgewiesen werden. Neben der ungeordneten Konformation und der $\beta$-Schleifen-Konformation scheinen bei Raumtemperatur noch zwei weitere niedrig populierte Spezies mit Prolinen in abweichender Konformation vorzukommen, was durch das Vorhandensein zweier verschobener Prolin-$\delta$-Signale (P-$\delta_\km{sh}$ und P-$\delta_\km{3}$) nahegelegt wird.

Darüber hinaus konnten $^\km{13}$C-NMR-spektroskopisch mindestens zwei weitere Subpopulationen identifiziert werden. Erstens finden sich zwei hochdynamische, terminale Glycine, die zusammen zu einer sehr beweglichen terminalen GVG-Gruppe, aber auch zu separaten Termini gehören könnten. Zweitens deutet ein zusätzliches Valin-Carbonyl-Signal auf ein von der Konformation der Hauptpopulation abweichendes Valin$_\km{1}$ hin. Die Besetzung dieser Subpopulationen nimmt mit zunehmender Temperatur ab.

Auf der Ebene der $T_\km{1}$-Zeiten konnte kein signifikanter Rückgang der Dynamik aufgrund der Zunahme des Faltungsgrades mit steigender Temperatur gefunden werden. Allerdings folgt die Temperaturabhängigkeit von $T_\km{1}$ für einige Kohlenstoffe im Rahmen der Genauigkeit keinem Arrhenius-Verhalten, was man als Indiz für eine Zunahme des mittleren Faltungsgrades innerhalb des Molekülensembles möglicher Konformationen werten kann. Die aus den $T_\km{1}$-Zeiten berechneten Aktivierungsenergien sind relativ niedrig, so dass sich insgesamt das Bild eines Ensembles von hochdynamischen Molekülen ergibt, deren mögliche Konformationen nur durch geringe Aktivierungsbarrieren getrennt sind. Gleichzeitig kann allerdings bei Raumtemperatur das Typ-II $\beta$-Schleifen-Motiv und vermutlich auch ein interpentamerer Kontakt nachgewiesen werden, welche auf der Zeitskala eines NOESY-Experiments stabil sind.










