\chapter{Zusammenfassung}

Zweifelsohne spielen Proteine eine tragende Rolle in der Biochemie des Lebens. Ihre funktionale Diversität ist sehr breit und reicht physiologisch von strukturellen Funktionen, wie sie z.B. das Elastin einnimmt, über regulatorischen Aufgaben bis hin zur enzymatischen Katalyse. Entsprechend komplex und vielfältig sind die Strukturen, welche Proteine einnehmen müssen. Die Struktur der Proteine ist eng mit ihrer Stabilität verknüpft, welche wiederum die Summe vieler Wechselwirkungen wie z.B. hydrophober Wechselwirkungen oder Wasserstoffbrückenbindungen, ist. Die Summe dieser Wechselwirkungen entscheidet letztendlich darüber, ob ein Protein in gefalteter oder entfalteter Form vorliegt. Bei erhöhten Temperaturen z.B. führt die hohe Konfigurationsentropie $\Delta S_\km{conf.}$ zur Entfaltung, während bei niedrigen Temperaturen eine Erniedrigung der Hydratisierungsenthalpie $\Delta H_\km{hydr.}$ ebenfalls zu einer Destabilisierung, der sog. Kältedenaturierung, führen kann. Die Umgebung von Proteinen spielt bei der Stabilität von Proteinen eine herausragende Rolle, da jede strukturelle Änderung innerhalb des Moleküls gleichzeitig auch zu einer Interaktion mit der -~zumeist wässrigen~- Umgebung führt (\glqq{\it{slaving}\grqq-Effekt}). Daher setzt ein tieferes Verständnis der Proteinstruktur auch eine tiefere Einsicht in die Wechselwirkungen des Polypeptids mit direkten Umgebung voraus. {\it In vivo} befinden sich globuläre Proteine i.d.R. in einer wässrigen Lösung zusammen mit einem mehr oder minder komplexen Gemisch anderer Stoffe, welche Einfluss auf die Stabilität des Proteins nehmen können.

\vspace{0.5cm}

In dieser Arbeit wurde das Phänomen der Kältedenaturierung anhand zweier Modellsysteme, dem Lysozym aus Hühnereiweiss sowie dem elastin-mimetischen Octadekapeptid $\km{GVG(VPGVG)_3}$, mittels NMR-spektroskopischer Methoden untersucht. Die Untersuchung mittels NMR erlaubt dabei Informationsgewinn auf atomaren Niveau. Die Kältedenaturierung ist als milde Entfaltungsform bekannt, bei welcher, verglichen mit der Hitzdenaturierung, ein Rest an Sekundärstruktur verbleibt, und somit eine stabile, teilentfaltete Form des Proteins einer Untersuchung zugänglich ist. Desweiteren wird die Kältedenaturierung von der Hydratisierungssenthalpie $\Delta H_\km{hydr.}$ angetrieben und erlaubt so Rückschlüsse auf Hydratisierungsphänomene. Die Kältedenaturierung tritt bei Lysozym erst bei Temperaturen unterhalb des Gefrierpunktes auf, weshalb unter erhöhtem Druck (3750 bar) gearbeitet wurde, bei dem Wasser bis weit ($\approx -20$ °C) unter 0 °C flüssig vorliegt und das Lysozym kältedenaturiert ist. Elastin-mimetische Peptide hingegen, zu welchem auch das hier untersuchte Octadekapeptid $\km{GVG(VPGVG)_3}$ gehört, weisen einen sog. ITT, einen {\it Inverse Temperature Transition} oberhalb von 0 °C auf, bei dem mit zunehmender Temperatur der Strukturgrad zunimmt. Der ITT kann wahrscheinlich als eine Art Kältedenaturierung aufgefasst werden, bei dem sich mit abnehmender Temperatur der Strukturgrad verringert und umgekehrt bei steigender Temperatur zunimmt.

\vspace{0.5cm}

Für Lysozym wurde die druckunterstützte Kältedenaturierung (3750 bar, -13 °C, pD 2,4) und der Einfluss der Cosolventien Sorbitol (500 mM) und Harnstoff (2 M) hierauf über $P$-Faktoren NMR-spektroskopisch charakterisiert.  Diese lassen sich aus den Austauschraten labiler Amidprotonen gegen den Deuteronen des Deuteriumoxid-Puffers berechnen und stellen ein Maß für den Strukturgrad um einen gegebenen Aminosäurerest dar. Zum Vergleich wurden für die Hitzedenaturierung (1 bar, 80 °C, pD 3,4) die $P$-Faktoren in reinem Puffer und bei Anwesenheit von 500 mM Sorbitol bestimmt. Darüberhinaus wurde die Hitzdenaturierung mikrokalorimetrisch über DSC und PPC sowie $^\km{1}$H-1D-NMR-spektroskopisch über das Signal des Histidins 15 verfolgt.

\vspace{0.5cm}

Sowohl die DSC- und PPC-Daten als auch die $^\km{1}$H-1D-NMR-spektroskopischen Messungen weisen die Hitzdenaturierung als hochkooperativen Vorgang im Rahmen eines Zweizustandsmodells aus. Bei den kinetischen Protonenaustausch-Messungen konnte jedoch ein Intermediat bei der thermisch induzierten Entfaltung gefunden werden, welches einen Rest an Struktur aufweist. Die vollständig entfaltete Form weist $P$-Faktoren im Bereich der Zufallsknäuel-Konformation auf. Die Höhe der $P$-Faktoren des Intermediats rechtfertigt allerdings keine Zuordnung zu bekannten Zwischenzuständen, wie sie z.B. durch chemische Denaturantien induziert und für {\it Molten Globules} berichtet werden. Es ist weniger strukturiert, weist die höchsten $P$-Faktoren bei oder in der Nähe von verbrückten Cysteinen auf und scheint der vollständig entfalteten Form näher zu stehen. Die Zugabe von Sorbitol führte zu keiner signifikanten Änderung der $P$-Faktoren für dieses Intermediat, was unterstreicht, dass es die Zunahme der Konfigurationsenthalpie $\Delta S_\km{conf.}$ ist, die diese Art der Entfaltung antreibt und bei der Änderungen der Hydratisierung, wie sie von Sorbitol vermittelt wird, kaum eine Rolle spielen.

Für die kältedenaturierte Form wurden wesentlich größere $P$-Faktoren bestimmt, die von der Größe her eher zu bekannten Intermediaten bzw. {\it Molten Globules} passen. Die Kältedenaturierung ist also eine mildere Form der Entfaltung. Auch hier findet sich der höchste Schutz vor Protonenaustausch bei oder benachbart zu verbrückten Cysteinen. Helicale und $\beta$-Faltblatt-Regionen weisen vergleichbare $P$-Faktoren auf. Bei Zugabe von Sorbitol erhöhen sich die $P$-Faktoren drastisch, was ein direkter Hinweis auf den Einfluss der Hydratisierung in diesem Entfaltungsszenario ist. Die Stabilisierung der Struktur erfolgt für das gesamte Protein einheitlich: kein Bereich konnte entlang der Sequenz identifiziert werden, der durch die Zugabe des Sorbitols in außerordentlicher Weise restrukturiert würde. Die Sorbitol-vermittelte Stabilisierung betrifft Lysozym also in uniformer Weise und stabilisiert helicale Strukturen wie Faltblattstrukturen gleichermaßen. Dies zeugt davon, dass Sorbitol kaum mit dem Protein interagiert und die durch das Polyol vermittelte Stabilisierung der Hydratisierung unspezifisch das gesamte Protein betrifft, in Übereinstimmung mit dem Konzept der präferentiellen Hydratation, wie es für Proteine in Osmolyten diskutiert wird. Die Anwesenheit von Harnstoff führt zur Absenkung der $P$-Faktoren. Auch hier ist keine Region innerhalb des Proteins zu verzeichnen, welche in abweichender Weise vom Harnstoff destabilisiert würde. Der Einfluss der Cosolventien auf die kältedenaturierte Form von Lysozym ist also kooperativ und uniform.

\vspace{0.5cm}

Die Charakterisierung des ITT des Octadekapeptids $\km{GVG(VPGVG)_3}$ erfolgte $^\km{13}$C-1D-spek\-tros\-kopisch im Bereich von 23 °C bis 80 °C und die $T_\km{1}$-Raten wurden für die $^\km{13}$C-Kerne bei Temperaturen von 5, 27, 60 und 75 °C bestimmt. Für die Signalzuordnung wurden weiterhin bei Raumtemperatur die $^\km{13}$C-$^\km{1}$H-2D-HSQC und -HMBC-Spektren sowie die homonuklearen $^\km{1}$H-2D-COSY und -NOESY-Spektren bestimmt.

\vspace{0.5cm}

$^\km{13}$C-NMR-spektroskopisch wurden neben den Hauptsignalen des pentameren $\km{G_1\-V_1\-G_2\-V_2\-P}$-Motivs im Bereich zwischen 23 und 80 °C weitere Signale gefunden. Diese konnten zwei terminalen Glycinen und einem Valin zugeordnet werden. Die zwei Glycine könnten zusammen zu einer hochdynamischen, terminalen GVG-Gruppe gehören, es könnte sich bei ihnen aber auch um separate N- bzw. carboxy-terminale Reste handeln. Die Dynamik des Valins rechtfertigt keine Zuordnung zu einer terminalen Position, daher stammt es wahrscheinlich von einer Subpopulation, bei der dieser Rest in einer von der Hauptpopulation abweichenden Konformation vorliegt. Der relative Anteil der terminalen Glycine als auch des konformeren Valins am gesamten Molekülensemble an Konformationen nimmt mit zunehmender Temperatur ab.

Im 2D-COSY- und 2D-NOESY-Spektrum konnten zwei weitere Prolin-$\delta$-Signale entdeckt werden, welche Hinweise auf zwei Subpopulationen geben, bei denen die Konformation des Prolins von der Prolin-Konformation der Hauptpopulation abweicht. Die Anwesenheit des Typ II-$\beta$-Schleifen-Motivs konnte durch das NOESY-Spektrum belegt werden; zudem legen NOE-Signale zwischen der Valin-$\gamma$- und Prolin-$\beta$/$\gamma$-Region Kontakte über die pentamere Sequenz hinaus nahe. Die $T_\km{1}$-Raten nehmen mit der Temperatur im gesamten untersuchten Temperaturbereich zu und zeigen keinen Hinweis auf ein Rückgang, wie man es bei einer Zunahme des Faltungsgrades erwarten würde. Grund hierfür könnte in der hohen Dynamik des Octadekapeptids liegen, dessen Rotationskorrelationszeiten auf Basis der $T_\km{1}$-Raten abgeschätzt werden konnten und teilweise Werte erreichen, wie sie für freie Aminosäuren bekannt sind. Allerdings weicht die Temperaturabhängigkeit der $T_\km{1}$-Zeiten für einige Kerne signifikant vom Arrhenius-Verhalten ab, was man als Hinweis auf eine zunehmende Faltung der pentameren Untereinheiten mit steigender Temperatur werten kann. Die Daten passen in das Bild eines Übergangs von einer ungeordneten, hochdynamischen Struktur in die Typ II $\beta$-Schleifen-Konformation bei Erhöhung der Temperatur.



