\chapter{Experimente}
\section{Materialien}
HEL, Sorbitol, Harnstoff, Oktan und Zitronensäure wurden von Fluka (Buchs, Schweiz) erworben. Maleinsäure und Dinatriumcitrat stammen von Merck (Darmstadt), Natriumphosphat und Natriummaleat von Sigma-Aldrich (Taufkirchen). Die Reinheit des HEL wurde über SDS-Gelelektrophorese überprüft und das Material ohne weitere Aufreinigung verwendet.

Das Polypeptid GVG(VPGVG)$_\km{3}$ wurde analog wie unter \cite{Nicolini2004} beschrieben mit der Fmoc\--Fest\-phasen\-synthese hergestellt und von Professor Waldmann (Universität/MPI Dortmund) freundlicherweise zur Verfügung gestellt.

\section{Software}

Wenn nicht anders vermerkt, wurden die Daten mithilfe des Programmes Origin (Version 6.0, MicroCal, Northampton, MA, England) ausgewertet und dargestellt. Für Moleküldarstellungen wurde das Programm WebLab Viewer (Version 2.01, Molecular Simulations Inc., San Diego, USA) verwendet. Komplexere Grafiken und Abbildungen wurden mit Hilfe des Programms CorelDraw (Version 11, Corel Cooperation, Ottawa, Kanada) hergestellt.


\section{Protonen-Austauschexperimente an HEL}

\begin{figure}[p,h]
\begin{center}
\begin{minipage}[h]{15.5cm}
\centerline{\fbox{\epsfysize=18cm\epsffile{/source/bilder_experimente/autoklav_röhrchen.eps}}}
\caption{\label{autoklav} Skizze des für die Hochdruckexperimente verwendeten Autoklavs. Zur Abdichtung wurde ein 24 $\times$ 3 O-Ring (Viton Shore 80; Röttcher GmbH \& Co KG, Dortmund) verwendet. Der Autoklav wurde mit 8 Schrauben (Imbus DIN916, $\oslash$ 8 mm, 8.8) verschlossen. Die Proben wurden in ein Glasröhrchen ($\oslash$ 4 mm) gefüllt und mit einem Hochdruckstopfen (Tekapeek GF30, Ensinger GmbH \& Co, Nufringen) verschlossen. Die Dichtung erfolgte mit zwei 2 $\times$ 1 O-Ringen (VI563, C. Otto Gehrckens GmbH \& Co KG, Pinneberg).}
\end{minipage}
\end{center}
\end{figure}

Alle NMR-Messungen wurden an einem Bruker DRX 400 Spektrometer (Bruker, Rheinstetten) durchgeführt.
Austauschexperimente wurden mit HEL-Lösungen unter hitzedenaturierenden (5 \% und 10 \% HEL (w/v), 80 °C, 20 mM Citrat pD 3,4) und kältedenaturierenden Bedingungen (5~\% HEL (w/v), -13 °C, 20 mM Maleat pD 2.4, 3,75 kbar \cite{Nash1997}) durchgeführt. Der etwas höhere pD bei den Hitzdenaturierungsexperimenten sorgte für eine langsamere Austauschgeschwindigkeit, welche auch eine Funktion des pHs ist, so dass der bei hoher Temperatur stark beschleunigte Austausch immer noch beobachtbar war. Der niedrigere pD bei der Kältedenaturierung sorgte für die nötige Destabilisierung von HEL \cite{Nash1997}. Der Einfluss von Cosolventien wurde in Form von 500 mM Sorbitol bei den Hitzdenaturierungsexperimenten sowie von 500 mM Sorbitol und 2 M Harnstoff bei der Kältedenaturierung untersucht.

Zur Bestimmung der Schutzfaktoren bei der Hitzdenaturierung wurden die Lösungen in ein NMR-Röhrchen gefüllt, für definierte Zeiten in ein Wärmebad (80 °C) gehalten und anschließend schnell in einem Eisbad abgekühlt.

Zur Kältedenaturierung wurden die betreffenden Lösungen in ein etwa 4,5 cm langes Glasröhrchen mit 4 mm Innendurchmesser (7 mm  Außendurchmesser) gefüllt, welches mit einem beweglichen Stopfen verschlossen werden konnte (vgl. Abb \ref{autoklav}). Der Stopfen wiederum konnte mit einer Schraube geöffnet und verschlossen werden, so dass die Proben blasenfrei ins Röhrchen gefüllt werden konnten. Das so präparierte Röhrchen wurde in einen vorgekühlten Autoklaven gegeben, in dem frisches Druckmedium Oktan, temperiert auf Raumtemperatur, gefüllt wurde. Der Autoklav wurde verschlossen und mit einer Spindelpresse (HIP Technology, Frankfurt) ein Druck von 3,75 kbar eingestellt  (siehe Abb. \ref{autoklav}). Da der Autoklav auf -13 °C temperiert wurde, wurde er zum Schutz gegen Luftfeuchtigkeit und zur Isolierung in einem Plastiksäckchen luftdicht verschlossen und dann in ein passend zurechtgeschnittenes Styroporgefäß gegeben. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde der Druck langsam abgelassen, wodurch die Probe gefror. Nach Öffnen des Autoklavs konnte die Probe entnommen und die HEL-Lösung in ein Eppendorfreaktionsgefäß gegeben und im Gefrierschrank aufbewahrt werden. Das COSY-Spektrum der Probe wurde vermessen und die Intensität der Signale wurde mittels der XWINNMR-Software von Bruker, mit der eine Integrationsmaske erstellt werden kann, ermittelt. Als Referenzwerte wurden die Signale aromatischer, nicht austauschbarer Protonen verwendet. Die Zuordnung der Signale erfolgte gemäß \cite{Redfield1988}. Die Intensität der Signale wurde gegen die Inkubationszeit aufgetragen und die gemessene Austauschrate $k_\km{obs}$ durch Anpassung gemäß Formel \ref{fit} bestimmt. Die entsprechende Austauschrate $k_\km{rc}$ wurde nach \cite{Bai1993, Nash1997} berechnet und der Schutzfaktor $P$ nach Gleichung \ref{P} ermittelt. Der Einfluss der Cosloventien auf $k_\km{rc}$ wurde ignoriert, da dieser bei niedrigem pH vernachlässigt werden kann \cite{Bhattacharjya1997, Englander1984}.




\section{NMR-Messungen an GVG(VPGVG)$_\km{3}$ }
Die $^\km{1}$H,$^\km{1}$H-2D-NOESY-, die $^\km{13}$C,$^\km{1}$H-HSQC-, die $^\km{13}$C,$^\km{1}$H-HMBC- und $T_\km{1}$-aufgelösten Spektren wurden an einem Varian 600 MHz Spektrometer an einer 10\% igen (w/v) Lösung von $\km{GVG(VPGVG)_3}$ in 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0; 20 \% (v/v) $\km{D_2O}$) gemessen, wobei die NOESY-, HSQC- und HMBC-Messungen mit angelegtem z-Gradienten erfolgten. Die Analyse der Daten erfolgte mit der Varian-eigenen Software VNMR mit Ausnahme der NOESY-Spektren, welche mit dem Programm MestReC (Version 4.5.2.0, Mestrec Research, Santiago de la Compestela, Spanien) prozessiert wurde. Vor den $T_\km{1}$-Messungen wurde die Lösung 20 Minuten lang mit Argon begast. Die Messungen erfolgten bei Temperaturen von 278, 300, 333 und 248 K  in einen Frequenzbereich von 30.000 Hz, auf dem 65536 Datenpunkte zu $d$2-Zeiten zwischen 0,0125 und 25,6 s in 12 Inkrementen gemäß der {\it inversion recovery}-Pulssequenz bestimmt wurden.

Das NOESY-Spektrum wurde über einen Frequenzbereich von jeweils 6000 Hz gemessen und bestand aus 2048 $\times$ 512 Datenpunkten. Die Apodisation erfolgte mit einer {\it sine bell}-Funktion in der $t_\km{2}$- und einer {\it sine square}-Funktion in der $t_\km{1}$-Domäne. In beiden Dimensionen wurde eine exponentielle Multiplikation von 1 Hz durchgeführt und in der F1-Domäne wurde {\it zero filling} auf 2048 Punkte benutzt. Die Mischzeit betrug 1,2 s.

Das HSQC-Spektrum hatte eine Frequenzbreite von 9612 Hz ($^\km{1}$H-Domäne) und 25641 Hz ($^\km{13}$C-Domäne) mit jeweils 128 Punkten. Die Daten wurden mit Gauss-Apodisation zu einem Spektrum von 2048 $\times$ 2048 Punkten prozessiert. Das HMBC-Spektrum wurde zu 2 $\times$ 512 Datenpunkten auf einer Frequenzbreite von 9612 Hz ($^\km{1}$H-Domäne) bzw. 36199 Hz ($^\km{13}$C-Domäne) vermessen, welche mit {\it sine bell}-Apodisation zu einem 2048 $\times$ 1024 Spektrum transformiert wurden.

Alle 1D-Spektren und $^\km{1}$H-2D-COSY-Spektren wurden auf einem Bruker DRX 400 Spektrometer mit Standardpulssequenzen gemessen und mit Standardparametern prozessiert. Die Zuordnung der Signale erfolgte auf Basis von \cite{Kurkova2003} und dem Programm ShiftX \cite{Neal2003}. Die Numerierung der Aminosäurereste in dieser Arbeit folgt hierbei der Literaturstelle \cite{Kurkova2003} gemäß $\km{G_1V_1G_2V_2P}$ und nicht nach dem Schema $\km{VPGVG}$. Dies führt jedoch nur zu einer Änderung der Nummern der Valine.

Die Rotationskorrelationszeiten $\tau_\km{est.}$ wurden für primäre, sekundäre und tertiäre Kohlenstoffe gemäß Formel \ref{tauest} abgeschätzt. Für die quartären Carbonylkohlenstoffe wurde angenommen, dass sie über dipolare Wechselwirkungen mit den nächsten Wasserstoffen relaxieren. Dies sind das Amidproton der betreffenden Peptidgruppe (Abstand $r$ = 202 pm - für V$_\km{2}$, dessen benachbartes Prolin kein Amidproton aufweist, wurde dieser Wert dennoch verwendet, da das P-$\delta$-Wasserstoff diesem Kohlenstoff ebenfalls sehr nahe kommen kann) und das $\alpha$-Wasserstoff ($r$ = 209 pm bzw. $r$ = 201 pm für Prolin) des entsprechenden Restes. Die Relaxationsrate $\frac{1}{T_\km{1}}$ wurde dann als lineare Summe der einzelnen Anteile der Relaxation über $r_\km{\alpha}$ und $r_\km{Amid}$ angesetzt:

\begin{equation}
\frac{1}{T_\km{1}} = (\frac{\mu_\km{0}}{4 \pi})^\km{2} \hbar^2 \gamma_\km{H}^\km{2} \gamma_\km{C}^\km{2} \tau_\km{est} ( \frac{n}{r_\km{\alpha}^\km{6}} + \frac{1}{r_\km{Amid}^6}) \label{tauestCO}
\end{equation}
\vspace{0.2cm}
Die so für die Carbonylkerne abgeschätzten Korrelationszeiten $\tau_\km{est.}$ stellen eher grobe Schätzwerte dar, sind aber bei Betrachtung der relativen Änderungen bei Erhöhung der Temperatur, die hier gemacht werden soll, durchaus sinnvoll.

\section{DSC- und PPC-Messungen}
Die DSC- und PPC-Messungen wurden von Dr. Revanur Ravindra an einem VP DSC-Kalorimeter von MicroCal (Northampton, MA, England) durchgeführt. Für die PPC-Messungen wurde mit einem Druckaufsatz von Microcal gearbeitet. Als Pufferlösung wurde 20 mM Citrat pD 3,4 verwendet, um eine Vergleichbarkeit mit den Protonenaustauschexperimenten der Hitzedenaturierung zu gewährleisten.

Bei den DSC-Messungen wurden jeweils ca. 0.5 ml Probe mit 5-8 mg/ml HEL in die Messzelle und ca. 0.5 ml Puffer in die Referenzzelle gefüllt. Für die PPC-Messungen wurde die Konzentration auf 8-10 mg/ml HEL erhöht.

Jede Messung wurde mindestens einmal mit steigender und absteigender Temperatur durchgeführt, um die Reversibilität des Übergangs zu überprüfen. Die Daten wurden mittels eines Erweiterungsprogrammes für das Programm Origin von MicroCal ausgewertet \cite{Plotnikov1997}.

\section{$^\km{1}$H-NMR-Messungen der Hitzdenaturierung von HEL}
Für die Vermessung der Hitzdenaturierung mittels $^\km{1}$H-NMR wurden die eindimensionalen $^\km{1}$H-Spektren einer 5 \%igen (w/v) HEL-Lösung bei unterschiedlichen Temperaturen in einem Bruker DRX 400-Spektrometer bestimmt (Einstrahlfrequenz 4,65 ppm, Spektrale Breite 12 ppm, 32k Datenpunkte). Die Spektren wurden mit dem Programm MestreC (MestreC23, Mestrec Research, Santiago de la Compestela, Spanien) ausgewertet, indem die Intensität der Signale auf das Wassersignal skaliert und die Signalintensitäten des Histidin 15, welches zwei diskrete, unterschiedliche Signale im nativen und denaturierten Zustand aufweist \cite{Nash1997}, bestimmt wurde. Unter Annahme eines Zweizustands-Überganges entspricht der Quotient dieser beiden Signalintensitäten der Gleichgewichtskonstane $K$, mit der $\Delta G_\km{unf.}$ als Funktion der Temperatur berechnet werden kann. Durch die erhaltenen Werte kann eine Ausgleichsgerade gelegt werden, aus deren Achsenabschnitt $\Delta H_\km{unf.}$ und aus deren Steigung $\Delta S_\km{unf.}$ bestimmt werden kann:

\begin{equation}
\Delta G_\km{unf.} = \Delta H_\km{unf.} - T \Delta S_\km{unf.}
\end{equation}



