Eldorado Collection:http://hdl.handle.net/2003/363372024-03-29T02:20:48Z2024-03-29T02:20:48ZCovalent allosteric inhibitors of Akt generated using a click fragment approachWesthuizen, Leandi van derWeisner, JörnTaher, AbuLandel, InaQuambusch, LenaLindemann, MariusUhlenbrock, NiklasMüller, Matthias P.Green, Ivan R.Pelly, Stephen C.Rauh, DanielOtterlo, Willem A. L. vanhttp://hdl.handle.net/2003/423752024-03-04T23:12:26Z2022-02-16T00:00:00ZTitle: Covalent allosteric inhibitors of Akt generated using a click fragment approach
Authors: Westhuizen, Leandi van der; Weisner, Jörn; Taher, Abu; Landel, Ina; Quambusch, Lena; Lindemann, Marius; Uhlenbrock, Niklas; Müller, Matthias P.; Green, Ivan R.; Pelly, Stephen C.; Rauh, Daniel; Otterlo, Willem A. L. van
Abstract: Akt is a protein kinase that has been implicated in the progression of cancerous tumours. A number of covalent allosteric Akt inhibitors are known, and based on these scaffolds, a small library of novel potential covalent allosteric imidazopyridine-based inhibitors was designed. The envisaged compounds were synthesised, with click chemistry enabling a modular approach to a number of the target compounds. The binding modes, potencies and antiproliferative activities of these synthesised compounds were explored, thereby furthering the structure activity relationship knowledge of this class of Akt inhibitors. Three novel covalent inhibitors were identified, exhibiting moderate activity against Akt1 and various cancer cell lines, potentially paving the way for future covalent allosteric inhibitors with improved properties.2022-02-16T00:00:00ZDesign and synthesis of Nrf2-derived hydrocarbon stapled peptides for the disruption of protein-DNA-interactionsWiedemann, BiancaKamps, DominicDepta, LauraWeisner, JörnCvetreznik, JanaTomassi, StefanoGentz, SaschaHoffmann, Jan-ErikMüller, Matthias P.Koch, OliverDehmelt, LeifRauh, Danielhttp://hdl.handle.net/2003/410102022-07-28T22:12:15Z2022-06-22T00:00:00ZTitle: Design and synthesis of Nrf2-derived hydrocarbon stapled peptides for the disruption of protein-DNA-interactions
Authors: Wiedemann, Bianca; Kamps, Dominic; Depta, Laura; Weisner, Jörn; Cvetreznik, Jana; Tomassi, Stefano; Gentz, Sascha; Hoffmann, Jan-Erik; Müller, Matthias P.; Koch, Oliver; Dehmelt, Leif; Rauh, Daniel
Abstract: Misregulation and mutations of the transcription factor Nrf2 are involved in the development of a variety of human diseases. In this study, we employed the technology of stapled peptides to address a protein-DNA-complex and designed a set of Nrf2-based derivatives. Varying the length and position of the hydrocarbon staple, we chose the best peptide for further evaluation in both fixed and living cells. Peptide 4 revealed significant enrichment within the nucleus compared to its linear counterpart 5, indicating potent binding to DNA. Our studies suggest that these molecules offer an interesting strategy to target activated Nrf2 in cancer cells.2022-06-22T00:00:00ZDesign, Synthese und Evaluation Mutanten-selektiver Inhibitoren zur Adressierung onkogener KRas-VariantenGoebel, Lisahttp://hdl.handle.net/2003/409972022-07-21T06:36:26Z2022-01-01T00:00:00ZTitle: Design, Synthese und Evaluation Mutanten-selektiver Inhibitoren zur Adressierung onkogener KRas-Varianten
Authors: Goebel, Lisa
Abstract: Ras-Proteine fungieren als molekulare Schalter in der Signaltransduktion essentieller zellulärer Prozesse, indem sie zwischen einem inaktiven GDP-gebundenen und einem aktiven GTP-gebundenen Zustand wechseln. Onkogene Ras-Mutationen, die in etwa 25 % aller humanen Krebsarten vorkommen und zu einer Fehlregulation des switch Mechanismus führen sind daher attraktive Zielstrukturen in der Präzisionsmedizin. Trotz jahrzehntelanger intensiver Forschung nach Entdeckung der Ras-Onkogene im Jahre 1981 waren Versuche, Ras gezielt zu adressieren, weitestgehend erfolglos und Ras-Proteine galten lange Zeit als nicht adressierbar (engl.: undruggable). Neue Hoffnung ergab sich jedoch im Jahr 2013 durch die erfolgreiche gezielte Adressierung der G12CMutation von Ras durch Kevan Shokat. Neben kovalenten Inhibitoren, die innerhalb der switch-II-Tasche irreversibel an die G12C-Mutation binden und deren Optimierung schließlich im Mai 2021 zur Zulassung des ersten KRasG12C-Inhibitors Sotorasib (Amgen) für die Behandlung von nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) führte, wurden zudem Nukleotid-kompetitive Inhibitoren entwickelt, die ebenfalls kovalent an KRasG12C binden können. Strategien, die eine direkte Konkurrenz zur Nukleotidbindung beinhalten, wurden ursprünglich aufgrund der hohen Affinität von GDP/GTP für Ras und der hohen zellulären Nukleotid-Konzentrationen verworfen, erlangten jedoch durch die Kombination mit einem kovalenten Wirkmechanismus der Inhibitoren erneut Aufmerksamkeit im akademischen Umfeld. Die dabei am β-Phosphat der GDP-Derivate eingeführten elektrophilen Gruppen führten jedoch zu einer dramatischen Reduzierung der reversiblen Bindungsaffinität der Nukleotidderivate, da wichtige Wechselwirkungen mit dem Protein und dem Mg2+-Ion verloren gehen. Um diese Limitierung zu überwinden und diesen Ansatz der kovalenten Nukleotid-kompetitiven Inhibitoren an onkogene KRas-Varianten mit Cysteinen im P-loop (KRasG12C und KRasG13C) anzupassen, wurden im Rahmen dieser Arbeit mittels strukturbasiertem Wirkstoffdesign Nukleotidanaloga synthetisiert, die einen Thiolreaktiven Linker an den 2‘,3‘-OH-Gruppen der Ribose für eine kovalente Proteinmodifikation tragen. Anhand von massenspektrometrischen Experimenten konnte gezeigt werden, dass die dargestellten Nukleotidderivate selektiv an KRasG13C binden, ohne dabei KRasG12C sowie KRasWT zu adressieren. Mittels einer detaillierten kinetischen Charakterisierung wurden anschließend die Affinitäten der Nukleotidanaloga gegenüber KRas im Vergleich zu den unmodifizierten Nukleotiden bestimmt. Neben der Bestimmung der Kinetik der Nukleotidassoziation (kon) mit einer bereits etablierten stopped-flow Methode wurde im Rahmen dieser Arbeit zudem ein HPLC-basierter Assay zur Evaluierung der relativen Affinitäten der Nukleotidanaloga entwickelt. Die Affinitäten der dargestellten Nukleotidderivate sind dabei mit denen der unmodifizierten Nukleotide vergleichbar, sodass der eingeführte Linker keinen Einfluss auf die reversible Wechselwirkung und die Affinität hat, was bei einem Nukleotid-kompetitivem Ansatz von maßgeblicher Bedeutung ist. Im Rahmen dieser Arbeit konnte zudem gezeigt werden, dass bei KRasG13C, welches eine drastisch erhöhte intrinsische Nukleotidaustauschrate im Vergleich zum WT besitzt, infolge einer kovalenten Proteinmodifikation der SOS-katalysierter Nukleotidaustausch verhindert und kovalent modifiziertes KRasG13C im inaktiven Zustand stabilisiert wird. Eine gesteigerte GTP-Hydrolyse in Gegenwart von GAPs konnte für kovalent modifizierte KRasG13C im Vergleich zu KRasWT nicht beobachtet werden, die intrinsische GTP-Hydrolyse ist hingegen vergleichbar mit der von KRasWT. Die in dieser Arbeit generierten Komplexkristallstrukturen von KRasG13C-edaGDP und KRasG13C-bdaGDP ermöglichten darüber hinaus einen detaillierten Einblick in den Bindemodus der Nukleotidderivate und bestätigten den erwarteten Bindemodus sowie die kovalente Bindungsknüpfung an Cys13. Aufgrund der limitierten Verfügbarkeit von KRasG13C-abhängigen Krebszelllinien wurden zunächst erfolgreich artifizielle KRas-abhängige Zelllinien, darunter NIH-3T3 sowie Ba/F3-Zellen generiert, die in Zukunft für die Charakterisierung mutantenselektiver KRas-Inhibitoren genutzt werden können. Für die zelluläre Charakterisierung der in dieser Arbeit dargestellten Nukleotidanaloga, die aufgrund ihres anionischen Charakters nicht die Zellmembran überwinden können, wurden verschiedene Strategien für den Transfer in Zellen getestet, unter anderem ein NTP-Transporter vermittelter Transfer sowie die Elektroporation. Durch Elektroporation rekombinanter KRas-Proteine in Zellen konnte schließlich gezeigt werden, dass bei der Verwendung von kovalent modifiziertem KRasG13C eine onkogene Signalweiterleitung in vivo inhibiert wird, was die Möglichkeit des Einsatzes von kovalenten Nukleotid-basierten Inhibitoren bei KRasG13C-getriebenem Krebs verdeutlicht.2022-01-01T00:00:00ZStrukturbiologische und zelluläre Charakterisierung Isoform-selektiver kovalent-allosterischer Akt-InhibitorenDepta, Laurahttp://hdl.handle.net/2003/408932022-05-06T22:12:23Z2022-01-01T00:00:00ZTitle: Strukturbiologische und zelluläre Charakterisierung Isoform-selektiver kovalent-allosterischer Akt-Inhibitoren
Authors: Depta, Laura
Abstract: Die Proteinkinase Akt, die aus drei Isoformen (Akt1/Akt2/Akt3) besteht, ist ein zentraler Knotenpunkt innerhalb des PI3K/Akt/mTOR-Signalwegs. Genomische Veränderungen wie aktivierende Mutationen in PI3K und Amplifikationen von AKT-Genen können eine Überaktivierung der Akt-Isoformen und damit einhergehend verschiedene Krankheiten auslösen. Trotz intensiver Forschung in den letzten Jahrzehnten sind mehrere klinische Studien mit potenziellen Arzneimittelkandidaten gescheitert. Verantwortlich dafür sind u. a. der Mangel an Informationen über Isoform-spezifische Funktionen im Zusammenhang mit menschlichen Krankheiten sowie die nicht selektive Adressierung der Isoformen und die damit verbundenen Nebenwirkungen. In dieser Arbeit war das Hauptziel, strukturbiologische und zelluläre Systeme zu etablieren, die die Grundlage für ein strukturbasiertes Wirkstoffdesign von Isoform-selektiven kovalent-allosterischen Akt-Inhibitoren (CAAIs) bilden. Zu diesem Zweck wurde zunächst ein detaillierter Sequenz- und Strukturvergleich der Akt-Isoformen durchgeführt. Die Strukturanalyse und ein fundiertes Konstruktdesign ermöglichten die Entwicklung effizienter Expressions- und Reinigungsstrategien. Weiterhin konnte im Rahmen von Kristallisationsstudien ein einzigartiger Einblick in die Akt2-Bindungstasche gewonnen werden, indem diese in Akt1 nachgebildet wurde. Dieser Einblick, kombiniert mit biochemischen und massenspektrometrischen Daten, ermöglichte eine Evaluierung einer fokussierten Substanzbibliothek und eine Verifizierung des von einem Homologiemodell abgeleiteten CAAI-Designansatzes. Um weiterführende zelluläre Studien zu ermöglichen, wurde ein Ba/F3-Akt-Isoform-abhängiges Modellsystem etabliert. Mit Hilfe dieses Modellsystems konnten biochemische Selektivitätsprofile der fokussierten Substanzbibliothek erstmalig in den zellulären Kontext übertragen werden und dienten als Grundlage für weitere Studien an der menschlichen Krebszelllinie PANC1. Darueber hinaus zeigten zellulären Studien an Akt-knock-out-Modellen die Vorteile der Isoform-selektiven CAAIs gegenüber invasiven genetischen knock-outs für die Entschlüsselung der Isoform-spezifischen Funktionen von Akt.; The protein kinase Akt, comprising three isoforms (Akt1/Akt2/Akt3), is a central signaling node within the PI3K/Akt/mTOR pathway. Genomic alterations such as activating mutations in PI3K and amplifications of AKT genes can trigger overactivation of Akt isoforms and concomitant various diseases. Despite intensive research in the last decades, several clinical trials with potential drug candidates have failed. Responsible for this are, among others, the lack of information on isoform-specific functions in the context of human disease and the non-selective targeting of the isoforms and associated side effects. In this work, the main objective was to establish structural biology and cellular systems that form the basis for structure-based drug design of isoform-selective covalent-allosteric Akt inhibitors (CAAIs). For this purpose, a detailed sequence and structural comparison of Akt isoforms was performed. Structural analysis and a founded construct design enabled the development of efficient expression and purification strategies. Furthermore, crystallization studies provided unique insight into the Akt2 binding pocket by mimicking it in Akt1. This insight, combined with biochemical and mass spectrometry data, allowed evaluation of a focused compound library and verification of the homology model-derived CAAI design approach. To enable further cellular studies, a Ba/F3-Akt isoform-dependent model system was established. Using this model system, biochemical selectivity profiles of the focused compound library could be transferred to the cellular context for the first time and served as a basis for further studies in the human cancer cell line PANC1. Furthermore, cellular studies on Akt knock-out models demonstrated the advantages of isoform-selective CAAIs over invasive genetic knock-outs for deciphering the isoform-specific functions of Akt.2022-01-01T00:00:00ZScanning protein surfaces with DNA-encoded librariesKunig, Verena B. K.Potowski, MarcoKlika Škopić, MatejaBrunschweiger, Andreashttp://hdl.handle.net/2003/408852022-04-27T22:12:30Z2020-12-09T00:00:00ZTitle: Scanning protein surfaces with DNA-encoded libraries
Authors: Kunig, Verena B. K.; Potowski, Marco; Klika Škopić, Mateja; Brunschweiger, Andreas
Abstract: Understanding the ligandability of a target protein, defined as the capability of a protein to bind drug-like compounds on any site, can give important stimuli to drug-development projects. For instance, inhibition of protein–protein interactions usually depends on the identification of protein surface binders. DNA-encoded chemical libraries (DELs) allow scanning of protein surfaces with large chemical space. Encoded library selection screens uncovered several protein–protein interaction inhibitors and compounds binding to the surface of G protein-coupled receptors (GPCRs) and kinases. The protein surface-binding chemotypes from DELs are predominantly chemically modified and cyclized peptides, and functional small-molecule peptidomimetics. Peptoid libraries and structural peptidomimetics have been less studied in the DEL field, hinting at hitherto less populated chemical space and suggesting alternative library designs. Roughly a third of bioactive molecules evolved from smaller, target-focused libraries. They showcase the potential of encoded libraries to identify more potent molecules from weak, for example, fragment-like, starting points.2020-12-09T00:00:00ZTowards DNA-encoded micellar chemistry: DNA-micelle association and environment sensitivity of catalysisKlika Škopić, MatejaGramse, ChristianOliva, RosarioPospich, SabrinaNeukirch, LauraManisegaran, MagilinyRaunser, StefanWinter, RolandWeberskirch, RalfBrunschweiger, Andreashttp://hdl.handle.net/2003/408382022-03-30T22:12:07Z2021-05-12T00:00:00ZTitle: Towards DNA-encoded micellar chemistry: DNA-micelle association and environment sensitivity of catalysis
Authors: Klika Škopić, Mateja; Gramse, Christian; Oliva, Rosario; Pospich, Sabrina; Neukirch, Laura; Manisegaran, Magiliny; Raunser, Stefan; Winter, Roland; Weberskirch, Ralf; Brunschweiger, Andreas
Abstract: The development of DNA-compatible reaction methodologies is a central theme to advance DNA-encoded screening library technology. Recently, we were able to show that sulfonic acid-functionalized block copolymer micelles facilitated Brønsted acid-promoted reactions such as the Povarov reaction on DNA-coupled starting materials with minimal DNA degradation. Here, the impact of polymer composition on micelle shape, and reaction conversion was investigated. A dozen sulfonic acid-functionalized block copolymers of different molar mass and composition were prepared by RAFT polymerization and were tested in the Povarov reaction, removal of the Boc protective group, and the Biginelli reaction. The results showed trends in the polymer structure-micellar catalytic activity relationship. For instance, micelles composed of block copolymers with shorter acrylate ester chains formed smaller particles and tended to provide faster reaction kinetics. Moreover, fluorescence quenching experiments as well as circular dichroism spectroscopy showed that DNA-oligomer-conjugates, although highly water-soluble, accumulated very effectively in the micellar compartments, which is a prerequisite for carrying out a DNA-encoded reaction in the presence of polymer micelles.2021-05-12T00:00:00ZSynthese, in vitro und in vivo Evaluierung molekularer Sonden, PROTACs und PET-Tracern zur Adressierung der Proteinkinase AktLindemann, Mariushttp://hdl.handle.net/2003/407102022-02-09T06:12:53Z2022-01-01T00:00:00ZTitle: Synthese, in vitro und in vivo Evaluierung molekularer Sonden, PROTACs und PET-Tracern zur Adressierung der Proteinkinase Akt
Authors: Lindemann, Marius
Abstract: Tumorerkrankungen stellen weltweit die zweithäufigste Todesursache dar und aufgrund der demographischen Entwicklung nimmt die Anzahl der Neuerkrankungen und Todesfälle stetig zu. Zur Adressierung der Proteinkinase Akt, ein hochrelevantes Protein in der Tumorentstehung, wurde für die präklinische Entwicklung die Hochskalierung eines kovalent-allosterischen Akt Inhibitor (CAAI) durchgeführt. Hiermit konnten in ersten Xenograft-Modellen vielversprechende Ergebnisse erhalten werden. Zur Optimierung der PK-Eigenschaften dieses CAAI wurde der chemische Raum erweitert. Die kleine fokussierte Substanzbibliothek auf Basis eines monozyklischen Pyridins lieferte neue Einblicke in die SAR der CAAIs. Dies ermöglichte das Design und die Synthese eines Akt-spezifischen Radioliganden, welcher in ersten in vivo Tiermodellen ein stabiles radioaktives Signal induzierte und durch weitere Optimierung zur Entwicklung eines PET-Tracers beitragen kann. Zur genaueren Analyse der Tumorbiologie von Akt wurden molekulare Sonden auf Basis der CAAIs entwickelt und in vitro etabliert. Als neuer innovativer Adressierungsansatz konnten erfolgreich die ersten drei Akt-spezifischen allosterischen PROTACs dargestellt werden, die einen Akt1-Abbau in Panc1-Zellen induzierten.; Tumor diseases represent the second leading cause of death worldwide and due to demographic trends the number of new cases and deaths is steadily increasing. To address the protein kinase Akt, a highly relevant protein in tumorigenesis, upscaling of a covalent-allosteric Akt inhibitor (CAAI) was performed for preclinical development. Promising results were obtained with this in initial xenograft models. To optimize the PK properties of this CAAI, the chemical space was expanded. The small focused compound library based on a monocyclic pyridine provided new insights into the SAR of CAAIs. This enabled the design and synthesis of an Akt-specific radioligand, which induced a stable radioactive signal in initial in vivo animal models and may contribute to the development of a PET tracer through further optimization. For a more detailed analysis of Akt tumor biology, molecular probes based on CAAIs were developed and established in vitro. As a new innovative targeting approach, the first three Akt-specific allosteric PROTACs were successfully displayed, which induced Akt1 degradation in Panc1 cells.2022-01-01T00:00:00ZCellular model system to dissect the isoform-selectivity of Akt inhibitorsQuambusch, LenaDepta, LauraLandel, InaLubeck, MelissaKirschner, ToniaNabert, JonasUhlenbrock, NiklasWeisner, JörnKostka, MichaelLevy, Laura M.Schultz-Fademrecht, CarstenGlanemann, FranziskaAlthoff, KristinaMüller, Matthias P.Siveke, Jens T.Rauh, Danielhttp://hdl.handle.net/2003/405962021-12-09T23:12:12Z2021-09-06T00:00:00ZTitle: Cellular model system to dissect the isoform-selectivity of Akt inhibitors
Authors: Quambusch, Lena; Depta, Laura; Landel, Ina; Lubeck, Melissa; Kirschner, Tonia; Nabert, Jonas; Uhlenbrock, Niklas; Weisner, Jörn; Kostka, Michael; Levy, Laura M.; Schultz-Fademrecht, Carsten; Glanemann, Franziska; Althoff, Kristina; Müller, Matthias P.; Siveke, Jens T.; Rauh, Daniel
Abstract: The protein kinase Akt plays a pivotal role in cellular processes. However, its isoforms’ distinct functions have not been resolved to date, mainly due to the lack of suitable biochemical and cellular tools. Against this background, we present the development of an isoform-dependent Ba/F3 model system to translate biochemical results on isoform specificity to the cellular level. Our cellular model system complemented by protein X-ray crystallography and structure-based ligand design results in covalent-allosteric Akt inhibitors with unique selectivity profiles. In a first proof-of-concept, the developed molecules allow studies on isoform-selective effects of Akt inhibition in cancer cells. Thus, this study will pave the way to resolve isoform-selective roles in health and disease and foster the development of next-generation therapeutics with superior on-target properties.2021-09-06T00:00:00ZDNA-kodierte Substanzbibliotheken: Chemische Stabilisierung der DNA, Entwicklung neuer Synthesemethoden und Identifizierung von TEAD-YAP-InhibitorenKunig, Verena B. K.http://hdl.handle.net/2003/405302021-10-20T22:12:14Z2021-01-01T00:00:00ZTitle: DNA-kodierte Substanzbibliotheken: Chemische Stabilisierung der DNA, Entwicklung neuer Synthesemethoden und Identifizierung von TEAD-YAP-Inhibitoren
Authors: Kunig, Verena B. K.
Abstract: Die Technologie der DNA-kodierten Substanzbibliotheken (DELs) hat sich in den letzten Jahren als eine vielversprechende Alternative zum Hochdurchsatz-Screening zur Identifizierung kleiner organischer Moleküle, welche mit pharmazeutisch relevanten, biologischen Zielstrukturen interagieren, etabliert. DELs bestehen aus einer Vielzahl an DNA-kodierten Molekülen, welche gleichzeitig in Affinitäts-basierten Selektionsassays gegenüber einer Zielstruktur getestet und im Anschluss anhand ihrer einzigartigen DNA-Sequenz leicht „entschlüsselt“ werden können. Ein Großteil der in der Literatur beschriebenen DELs wird über „split and pool“-Synthesen in wässriger Lösung synthetisiert. Dies hat zur Folge, dass viele gängige Synthesemethoden der organischen Chemie, die auf trockene Lösungsmittel angewiesen sind, nicht für die DEL-Synthese zur Anwendung kommen können. Eine weitere Limitierung zur Herstellung von DELs stellt die Stabilität der DNA gegenüber verschiedenen Reaktionsbedingungen dar. Viele als Katalysatoren standardmäßig in der präparativen organischen Chemie eingesetzte Metallsalze sowie stark saure Reaktionsbedingungen können in der DEL-Synthese nicht verwendet werden.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Fokus auf die Synthese von DELs basierend auf einer Festphasenstrategie gelegt. Diese bietet neben der freien Wahl des Lösungsmittels den Vorteil, dass die Nukleobasen der DNA vollständig geschützt vorliegen und somit die gesamte DNA eine höhere Stabilität aufweist. Im ersten Teil der Arbeit wird die Synthese einer Indol-fokussierten DNA-kodierten Substanzbibliothek, ausgehend von dem chemisch sehr stabilen, controlled pore glass (CPG)-gebundenen Hexathymidin („hexT“)-Adapteroligonukleotid beschrieben (thymidine-initiated DNA-encoded chemistry, TIDEC). Die im Vergleich zu anderen DELs recht kleine Bibliothek von 8.112 Molekülen konnte im Selektionsscreening vielversprechende Wirkstoffkandidaten für schwierig zu adressierende Proteine wie dem Transkriptionsfaktor TEAD4 liefern. Das in diesem Verfahren verwendete Adapteroligonukleotid hexT erlaubt jedoch keine Kodierung von Startmaterialien. Diese Einschränkung wird im weiteren Verlauf der Arbeit adressiert durch die Überführung weiterer organischer Synthesemethoden (Ugi-Vierkomponentenreaktion, Ugi-Azid-Vierkomponentenreaktion, Ugi-Vierkomponenten-aza-Wittig-Reaktion, Groebke-Blackburn-Bienaymé-Dreikomponentenreaktion, AgOAc-vermittelte 1,3-dipolare Azomethin-Ylid-Cycloaddition, Yb(PFO)3-vermittelte Dreikomponenten-Pyrazolsynthese) auf ein neues, effizienteres DNA-Kodierungsformat, das den Einsatz von kodierten Startmaterialien ermöglicht. Damit auch harschere Reaktionsbedingungen in der DEL-Synthese verwendet werden können, wird im letzten Teil der Arbeit durch den Austausch der vulnerablen Purinnukleobase Adenin durch die chemisch modifizierte Base 7-Deazaadenin die Etablierung eines chemisch stabilisierten DNA-Barcodes beschrieben.2021-01-01T00:00:00ZStrukturbasierte Entwicklung und Evaluierung von Sondenmolekülen zur allosterischen Regulation von Isoformen der Proteinkinase AktQuambusch, Lenahttp://hdl.handle.net/2003/405102021-10-07T22:12:09Z2021-01-01T00:00:00ZTitle: Strukturbasierte Entwicklung und Evaluierung von Sondenmolekülen zur allosterischen Regulation von Isoformen der Proteinkinase Akt
Authors: Quambusch, Lena
Abstract: Als zentraler negativer Regulator der Apoptose ist die Proteinkinase Akt mit ihren drei Isoformen (Akt1/Akt2/Akt3) entscheidend für das Überleben der Zelle und eine Schlüssel-Zielstruktur in der Wirkstoffforschung. Für ein anhaltendes Scheitern klinischer Akt Wirkstoff-Kandidaten im Kontext der gezielten Krebstherapie mag der Mangel an Informationen über die Akt Isoformen und ihrer pathophysiologischen Rolle in humanen Krankheitsbildern mitverantwortlich sein. Das komplexe Netzwerk der homologen Proteinkinasen konnte bislang anhand von molekular-biologischen Methoden nicht eindeutig aufgelöst werden. Einschnitte in das Interaktom durch genetische Entfernung von Akt ist überschattet durch Redundanzen der anderen homologen Isoform oder mögliche Kompensierungsprozesse über alternative Signalwege. Es bedarf einer gezielten temporalen Kontrolle der Funktionen ebendieser Enzyme, um verknüpft Interaktionsprofile in einer physiologisch-relevanten Zeitskala zu evaluieren. Diese Pertubationsstudien können elementare Grundsteine für neue innovative therapeutische Ansätze liefern sowie dabei helfen, toxische Nebenwirkungen der bisher bekannten Wirkstoffe einzuordnen und diese Vorteile in vielversprechende Behandlungsstrategien zu übersetzen.
Die allosterische Adressierung einer Interdomänen-Bindetasche in Akt mit pharmakologisch-vorteilhaften kovalenten Liganden erwies sich als äußerst vielversprechend. Besonders in Bezug auf Affinität und Selektivität gegenüber ATP-kompetitiven Inhibitoren. Bereits identifizierte allosterische Verbindungen wiesen ein interessantes Selektivitätsprofil gegenüber den Akt Isoformen auf, welches in Kombination mit einer irreversiblen Alkylierungs-Strategie deutlich verbessert werden konnte. Ausgehend von diesen Einblicken in die Struktur-Aktivitätsbeziehung der jeweiligen vermeintlich Isoform-selektiven Liganden sollten weitere Optimierungen durchgeführt werden, um sehr potente, funktionelle Sondenmoleküle zu gewinnen.
Die eingeschränkte Verfügbarkeit von Akt2 und Akt3 Kristallstrukturen konnte mithilfe von Homologiemodellen und detailliertem Sequenzvergleich überwunden werden, um grundlegende Informationen für ein gezieltes Design allosterischer Liganden zu erlangen. Aus den modell-abgeleiteten Bedingungen wurde eine Substanzbibliothek strukturbasiert entworfen und unter Verwendung effizienter synthetischer Strategien umgesetzt. Auf Basis von 50 kovalent-allosterischen Akt Inhibitoren (CAAI) konnten anhand biochemischer Daten Rückschlüsse auf die Struktur-Aktivitätsbeziehung der Liganden gezogen werden. Infolgedessen gelang eine detaillierte Aufschlüsselung von vermeintlichen Bindepräferenzen der allosterischen Akt Isoform-Bindetaschen samt Offenlegung umfangreicher Selektivitätsprofilen der Inhibitoren. Ferner konnten die irreversiblen Eigenschaften der kovalenten Verbindungen ergründet sowie neue strukturelle Einblicke in die Protein-Ligand-Wechselwirkung mithilfe von Röntgenstrukturanalyse gewonnen werden.
Weiterführend konnten die biochemisch erfassten Selektivitätsprofile der Inhibitoren in ein Akt-Isoform abhängiges Zellsystem übersetzt werden, welches es erlaubt, im Hochdurchsatz und ohne Einschränkung durch gewebsspezifische Expressionslevel die Aktivität der Liganden zu bewerten. Außerdem ermöglichte die Identifizierung von Inhibitoren mit optimalen Selektivitätsfenstern im Ba/F3-Modell-Systemen tiefergehende Studien mit der komplexeren Krebszelllinie PANC1. Daraus resultierte die Ergründung von vorteilhaften Inhibitor-Konzentrationen, welche eine selektive Adressierung der jeweiligen Akt Isoform in zellulären Systemen gewähren.
Darüber hinaus konnten in dieser Arbeit funktionalisierte Alkin-Sonden aus den Akt2-selektive Pyrazinon CAAIs gewonnen werden. Als proof-of-concept glückte in ersten in gel Fluoreszenz-Studien die gezielte Modifizierung der Alkin-Funktionalität über eine Kupfer-vermittelte Click-Reaktion mit einem Fluorophor. Diesen chemischen Werkzeugen vermag es gelingen, die Funktionen der Akt Isoformen in komplexen Systemen zu entschlüsseln und ihre Aufgabe in pathophysiologischen Zusammenhängen aufzuklären. Neben der elementaren Rolle in funktionellen Studien stellen die erarbeiteten selektiven Liganden potentielle Wirkstoff-Vorläufer dar, die ein hohes Potenzial besitzen Teil einer innovativen Lösung zur erfolgreichen Adressierung der Proteinkinase Akt und ihrer Isoformen im klinischen Kontext zu sein.2021-01-01T00:00:00ZBiochemische und strukturbiologische Evaluierung von MKK7-Ligand WechselwirkungenWolle, Patrikhttp://hdl.handle.net/2003/405022021-09-29T22:12:09Z2021-01-01T00:00:00ZTitle: Biochemische und strukturbiologische Evaluierung von MKK7-Ligand Wechselwirkungen
Authors: Wolle, Patrik
Abstract: Mitogen-aktivierte Proteinkinase-Signalwege sind in eukaryotischen Zellen von besonderer Bedeutung, da sie einen zentralen Bestandteil der Weiterleitung von extrazellulären Signalen zum Zellkern darstellen. Beim Menschen sind insgesamt vier MAPK-Signalwege bekannt.
In dieser Arbeit wurde im Speziellen der JNK-Signalweg genauer untersucht, der vor allem in Folge von physischen Stimuli wie Hitze, Strahlung und osmotischen Schock sowie Cytokine aktiviert wird. Ebenso ist der JNK-Signalweg in die Entwicklung von Organen während der Embryogenese und in der Entwicklung des Gehirns und des Nervensystems beteiligt. Dies macht den Signalweg zu einem relevanten Ziel für die Wirkstoffforschung. Es konnte bereits gezeigt werden, dass eine direkte Einwirkung auf JNK, zum Beispiel durch selektive JNK-Inhibitoren, viele Nebenwirkungen auslösen kann. Aus diesem Grund sollte in dieser Arbeit die Regulierung eine der beiden Aktivatoren von JNK, die Mitogen aktivierte Protein Kinase Kinase 7 (MKK7), genauer analysiert werden. Hierfür sollte nach Liganden gesucht werden, welche die Aktivität der Kinase innerhalb eines Organismus spezifisch modulieren können, mit dem Ziel, mit Hilfe dieser Substanz Veränderungen in der Funktionsweise des Signalweges, zum Beispiel in den Phosphorylierungsmustern der JNK Substrate, oder in der Morphologie der Zelle, zu detektieren.
Dazu wurde zunächst eine Auswahl von verschiedenen biochemischen Assays hinsichtlich ihrer Eignung auf die Charakterisierung von MKK7-Liganden untersucht und mit einem, auf diese Weise identifizierten, geeignetem System eine Bibliothek niedermolekularer Substanzen durchmustert. Die gefundenen Hits wurden sowohl biochemisch als auch mit Hilfe von massenspektrometrischen Messungen validiert. Der potenteste Inhibitor (Verbindung 22) wurde anschließend in Mäusen auf seine pharmakokinetischen Eigenschaften hin untersucht, und in einem Ansatz mit DRG-Zellen auf seine spezifische Wirksamkeit hin untersucht und zeigte auch hier eine hohe Aktivität wie auch Selektivität.
Zusätzlich wurde Verbindung 22 wie auch eine Reihe weiterer Inhibitoren im Komplex mit MKK7 kokristallisiert, wodurch der Bindungsmodus dieser Inhibitoren aufgeklärt werden konnte.2021-01-01T00:00:00ZStruktur-basiertes Design, Synthese und pharmakokinetische Charakterisierung von kovalenten Inhibitoren zur Adressierung von Krebs-relevanten ProteinkinasenHardick, Juliahttp://hdl.handle.net/2003/402012021-05-27T22:12:30Z2021-01-01T00:00:00ZTitle: Struktur-basiertes Design, Synthese und pharmakokinetische Charakterisierung von kovalenten Inhibitoren zur Adressierung von Krebs-relevanten Proteinkinasen
Authors: Hardick, Julia
Abstract: Die vorliegende Arbeit beinhaltet zwei Abschnitte: (i) die pharmakokinetische Charakterisierung von Inhibitoren mit dem Fokus auf der Analyse der metabolischen Stabilität in Anwesenheit von Lebermikrosomen, die einen Phase I Metabolismus nachbilden. Hierzu wurde ein entsprechendes Assaysystem in der Arbeitsgruppe etabliert. (ii) Das Struktur basierte Wirkstoffdesign, die organische Synthese von niedermolekularen Verbindungen und deren Charakterisierung, mit dem Ziel selektive und potente Inhibitoren für Krebs relevante Proteinkinasen zu identifizieren. Die Kombination aus biochemischem Aktivitätsassay und zellulärem Viabilitätsassay erlaubte eine Bewertung der generierten Substanzbibliotheken. Massenspektrometrische Studien ermöglichten die Analyse der kovalenten Adressierung des Zielproteins, sowie Komplexkristallstrukturen verwendet wurden, welche tiefere Einblicke in die Bindungsmodi der Inhibitoren erlaubten.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Phase I Metabolismus Assays etabliert, der einen wichtigen Beitrag zur Optimierung und Weiterentwicklung der Inhibitoren leistet. Der Assay wurde in Gegenwart von humanen und murinen Lebermikrosomen durchgeführt, welche die Cytochrom P450 Enzyme beinhalten, durch die die Mehrheit der auf dem Markt zugelassenen Wirkstoffe abgebaut werden. Untersucht wurde die metabolische Stabilität von 200 Verbindungen über die Zeit, sodass Parameter wie die Halbwertszeit (t1/2) und die intrinsische Clearance (CLint) für eine Vielzahl an Verbindungen aus unterschiedlichen Projekten bestimmt und mit Referenzverbindungen verglichen werden konnten.
Die Proteinkinase MKK7 ist Teil des JNK Signalwegs, dessen Fehlregulierung in neurodegenerativen Erkrankungen sowie bei Herzinfarkten mit darauffolgenden ischämischen Reperfusionsschäden identifiziert wurde. Unzureichende Selektivitätsprofile und mangelnde Wirksamkeit wurden bislang für JNK Inhibitoren beschrieben, weshalb die Adressierung der JNK aktivierenden Kinase MKK7 eine gute Alternative darstellt die genannten Selektivitätsmängel zu umgehen. Der literaturbeschriebene, potente Pyrazolopyrimidin-basierte kovalente MKK7 Inhibitor 24 sollte in komplexen zelluläre in vitro und ersten in vivo Modellsystemen getestet werden, weshalb zunächst ein Gramm der Verbindung hergestellt wurde. Die Identifizierung einer geeigneten Formulierung für die Substanz sowie die Bestimmung der maximal tolerierbaren Dosis bildeten die Grundlage für erste in vivo Mausstudien. Aus diesen ging bei 600 mg pro kg Körpergewicht der Maus durch IV Applikation eine maximale Plasmakonzentration von 5 µM hervor, sowie eine gute Verträglichkeit der Substanz. Die nur mäßige Löslichkeit der Verbindung stellte sich als problematisch dar, weshalb verschiedene Salzformen dargestellt wurden, von denen das HCl Salz 34 eine verbesserte Löslichkeit zeigte. Weiterhin wurde der Einfluss von 24 auf Reperfusionsschäden infolge eines Herzinfarktes in Mausmodellen untersucht.
Hierbei wurden Herzinfarkte induziert und durch die präventive Vorab Gabe der entstandene ischämische Reperfusionsschaden im Vergleich zu unbehandelten Mäusen analysiert. Basierend auf den bislang erzielten Ergebnissen lässt sich ein geringerer ischämischer Reperfusionsschaden bei vorheriger Verabreichung von 24 vermuten.
Die Behandlung von Krebs wurde in den letzten Jahren durch den Ansatz der Präzisionsmedizin revolutioniert. Hierbei können durch die Identifizierung von prädiktiven Biomarkern große Patientenpopulationen in Subgruppen unterteilt werden, die somit eine individuelle und maßgeschneiderte Therapie erhalten. Die zielgerichtete Adressierung mit TKIs wurde erfolgreich für die Proteinkinasen EGFR, KIT und PDGFR beschrieben.
Her2, ein Mitglied der ErbB Rezeptorfamilie, wurde bei etwa 4 % aller Patienten mit NSCLC als Treiber identifiziert, wovon ca. 80 % Insertionsmutationen in Exon20 entsprechen. Geringe Überlebens und Ansprechraten von < 40 % auf die bislang angewendeten Therapien mit TKIs verdeutlichen den dringenden Bedarf an wirksamen Inhibitoren für Krebspatienten mit positivem Her2 Mutationsstatus. In dieser Arbeit wurden kovalente, Pyrrolopyrimidin basierte Typ II Inhibitoren mit dem Ziel weiterentwickelt, die Löslichkeit der Inhibitoren durch Einführung von Löslichkeitsgruppen zu steigern und somit eine verbesserte zelluläre Aktivität erzielen zu können. Durch Einbringung von polaren Alkohol und Amin-funktionalitäten in ortho Position zum Michael Akzeptor wurde eine gesteigerte biochemische, aber gleichbleibende zelluläre Aktivität festgestellt. Kristallisationsstudien verifizierten den angenommenen Bindungsmodus und die pharmakokinetische Charakterisierung zeigte bspw. Optimierungsbedarf bzgl. der Stabilität in murinem Blutplasma sowie in Lebermikrosomen.
Mutationen in den Proteinkinasen KIT und PDGFR wurden bei der Mehrheit von Patienten mit gastrointestinalen Stromatumoren identifiziert. Die derzeitig zugelassenen Wirkstoffe für die Behandlung von GIST sind reversible, ATP kompetitive Inhibitoren, von denen lediglich Avapritinib und Ripretinib speziell für die Therapie von GIST entwickelt wurden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde basierend auf der Ponatinibstruktur eine Substanzbibliothek von Typ II bzw. Typ III Inhibitoren synthetisiert. Diese wurden mit einer reaktiven Gruppe dekoriert, um eine kovalente Bindung mit Cys788 oder Cys809 in KIT bzw. Cys814 oder Cys835 in PDGFR auszubilden. In MS und MS/MS Experimenten konnte die spezifische Bindung der synthetisierten Inhibitoren an Cys788 in KIT nicht nachgewiesen werden. Ferner wurden einzigartige, Patienten abgeleitete PDGFR mutierte Zelllinien entwickelt und in einem HTS eingesetzt. Die Durchmusterung von fokussierten Kinaseinhibitor-bibliotheken sollte zukünftig neue Leitstrukturen identifizieren, um spezifische Inhibitoren für PDGFR mutierte gastrointestinale Stromatumore designen und synthetisieren zu können.2021-01-01T00:00:00ZKristallisation und strukturbiologische Charakterisierung klinisch-relevanter Mutationsvarianten der Rezeptor-Tyrosinkinasen EGFR und Her2Niggenaber, Janinahttp://hdl.handle.net/2003/401112021-03-26T23:10:25Z2021-01-01T00:00:00ZTitle: Kristallisation und strukturbiologische Charakterisierung klinisch-relevanter Mutationsvarianten der Rezeptor-Tyrosinkinasen EGFR und Her2
Authors: Niggenaber, Janina
Abstract: Lungenkrebs ist die häufigste Ursache für krebsbedingte Todesfälle weltweit.[1] In den letzten Jahren hat jedoch die sogenannte Präzisionsmedizin die Krebstherapie von Nicht-kleinzelligen Lungenkrebs-Patienten (NSCLC-Patienten) revolutioniert. Die Identifizierung von prädikativen Biomarkern sowie das detaillierte genetische Verständnis ermöglichte die Entwicklung niedermolekularer Verbindungen zur gezielten Inhibierung der aberranten Zielstrukturen genetisch definierter Patientengruppen. Durch die gezielte Adressierung der onkogenen Zielproteine können die Nebenwirkungen verringert werden, wodurch die Präzisionsmedizin eine vielversprechende Alternative zur platinbasierten Chemotherapie darstellt.[2,3]
Genetische Mutationen, die zur Entstehung und zur Progression von NSCLC führen, sind häufig in den Rezeptor-Tyrosinkinasen zu finden. Hierbei sind im Rahmen dieser Arbeit vor allem der epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) sowie der humane epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 (Her2) zu nennen.[4,5] Die Entstehung von Resistenzmutationen innerhalb der Kinase-Domäne von EGFR, während der Behandlung mit zielgerichteten Tyrosinkinase-Inhibitoren, erfordert das stetige Aufklären der Resistenzmechanismen sowie die Entwicklung neuer Wirkstoffe.[6] Daher ist ein detailliertes Verständnis der Mutanten sowie der Protein-Inhibitor-Interaktionen auf molekularer Ebene für die Entwicklung neuartiger Verbindungen erforderlich.
Die Proteinkristallographie stellt eine wichtige Methode zur Strukturaufklärung dar. [7,8] Allerdings sind bis zur finalen Kristallstruktur viele Herausforderungen wie das Konstruktdesign, die Proteinexpression in unterschiedlichen Expressionssystemen sowie die Proteinreinigung und die Identifizierung geeigneter Kristallisation-bedingungen zu meistern.
Nach Optimierung der genannten Arbeitsschritte konnten im Rahmen dieser Arbeit verschiedene Kristallisationssysteme Krebs-relevanter EGFR-Varianten etabliert werden, mit deren Hilfe ein verlässliches Wachstum qualitativ hochwertiger Proteinkristalle in Komplex mit niedermolekularen Verbindungen für die Strukturaufklärung ermöglicht werden konnte. Neben dem Interaktionsnetzwerk der Verbindungen und es Zielproteins konnten wichtige strukturelle Einblicke für weitere strukturbasierte Designansätze neuartiger Inhibitoren sowie Optimierungen bereits vorliegende Inhibitoren identifiziert werden.
Im Rahmen dieser Arbeit konnten insgesamt 47 finale Kristallstrukturen der EGFR-Mutationsvarianten generiert werden, von denen bisher zwölf in der Protein Data Bank publiziert wurden.
[1] F. Bray, J. Ferlay, I. Soerjomataram, R. L. Siegel, L. A. Torre, A. Jemal. Global Cancer Statistics 2018: GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries. Ca: Cancer J. Clin. 2018, 68, 394-424. [2] A. Thomas, S. V. Liu, D. S. Subramaniam, G. Giaccone. Refining the Treatment of NSCLC According to Histological and Molecular Subtypes. Nat. Rev. Clin. Oncol. 2015, 12, 511-526. [3] S. O. Dolly, D. C. Collins, R. Sundar, S. Popat, T. A. Yap. Advances in the Development of Molecularly Targeted Agents in Non-Small-Cell Lung Cancer. Drugs 2017, 77, 813-827. [4] S. V. Sharma, D. W. Bell, J. Settleman, D. A. Haber. Epidermal Growth Factor Receptor Mutations in Lung Cancer. Nat. Rev. Cancer 2007, 7, 169-181. [5] J. Mendelsohn, J. Baselga. The EGF Receptor Family as Targets for Cancer Therapy. Oncogene 2000, 19, 6550-6565. [6] J. Lategahn, M. Keul, D. Rauh. Lessons To Be Learned: The Molecular Basis of Kinase-Targeted Therapies and Drug Resistance in Non-Small Cell Lung Cancer. Angew. Chem., Int. Ed. 2018, 57, 2307-2313. [7] M. W. Parker. Protein Structure from X-Ray Diffraction. J. Biol. Phys. 2003, 29, 341-362. [8] Z. Sayers, B. Avsar, E. Cholak, I. Karmous. Application of Advanced X-Ray Methods in Life Sciences. Biochim. Biophys. Acta. Gen. Subj. 2017, 1861, 3671-3685.2021-01-01T00:00:00ZStrukturbiologische Untersuchung und zelluläre Charakterisierung kovalent-allosterischer Akt-InhibitorenLandel, Inahttp://hdl.handle.net/2003/400932021-03-24T23:10:18Z2020-01-01T00:00:00ZTitle: Strukturbiologische Untersuchung und zelluläre Charakterisierung kovalent-allosterischer Akt-Inhibitoren
Authors: Landel, Ina
Abstract: Aufgrund der Schlüsselposition der Proteinkinase Akt im PI3K/Akt-Signalweg resultiert aus genetischen Läsionen vorgeschalteter Proteine eine Überaktivierung der Kinase in verschiedenen Tumorerkrankungen. Zudem sind onkogene Mutationen der Akt-Kinase wie die E17K-Mutation bekannt, sodass die zielgerichtete Adressierung von Akt von großem Interesse in der medizinalchemischen Forschung ist. Dabei konnte das enorme Potential einer kovalent-allosterischen Modulation mit der Leitstruktur Borussertib durch dessen herausragende inhibitorische Potenz und Selektivität im Vergleich zu den in klinischen Studien untersuchten allosterischen und ATP-kompetitiven Akt-Inhibitoren bereits aufgelöst werden.
Mit den in dieser Arbeit etablierten Zellsystemen konnten weiterführend die gesteigerte anti-proliferative Aktivität von Borussertib im Vergleich zu den Referenzinhibitoren gezeigt und die selektive Inhibition der Akt-Kinase und der nachgeschalteten Signalkaskaden durch Borussertib intrazellulär bestätigt werden. Außerdem konnte die in vivo-Wirksamkeit von Borussertib in Kombination mit dem MEK-Inhibitor Trametinib in KRas-mutierten Patienten-abgeleiteten Xenograft-Modellen (PDX) nachgewiesen werden. Um eine ausreichende orale Bioverfügbarkeit zu erreichen, ist jedoch die weitere Optimierung von Borussertib im Rahmen des strukturbasierten Wirkstoffdesigns (SBDD) erforderlich. Dafür konnte in dieser Arbeit ein verlässliches Kristallisationssystem für die Akt1-Kinase etabliert und somit 35 Kristallstrukturen im Komplex mit einer Vielzahl von kovalent-allosterischen Inhibitoren gelöst werden. Die erhaltenen Komplexstrukturen bestätigen die Bindung in der allosterischen Interdomänentasche sowie die kovalente Adressierung der in der Aktivierungsschleife befindlichen Cysteine. Zudem konnte mit dem vertieften Verständnis der Struktur-Aktivitäts-Beziehungen (SAR) die Grundlage für die weitere Optimierung der CAAIs geliefert werden.
Um das SBDD auch zur Adressierung der onkogenen Akt1 E17K-Mutante zu ermöglichen, wurden zahlreiche Kristallisationsexperimente durchgeführt, welche letztendlich zur Identifizierung vielversprechender Bedingungen führten. Weiterhin konnten sowohl die biochemische als auch zelluläre Charakterisierung mit dem in dieser Arbeit generierten Ba/F3 Akt1 E17K-Zellsystem die Überlegenheit der CAAIs im Vergleich zu den klinischen Akt-Inhibitoren auch hinsichtlich der Adressierung der Akt1 E17K-Mutante auflösen.
Die validierten Methoden zur Etablierung eines Kristallisationssystems konnten außerdem auf die Rezeptortyrosinkinasen c-Kit- und PDGFR, welche prominente Zielproteine in gastrointestinalen Stromatumoren (GIST) darstellen, transferiert werden. Durch Reproduktion der beschriebenen Expressions-, Reinigungs- und Kristallisationsbedingungen konnten Kristalle des c-Kit Wildtyp-Proteins sowie vielversprechende Ansätze für PDGFR erhalten werden. Die Strukturanalyse der c-Kit-Kristalle lieferte dabei neue Ansätze zur Optimierung des Kristallisationskonstrukts.2020-01-01T00:00:00ZBiochemische, kinetische und zelluläre Charakterisierung kovalent-allosterischer Akt-InhibitorenWeisner, Jörnhttp://hdl.handle.net/2003/392382020-08-19T01:40:50Z2020-01-01T00:00:00ZTitle: Biochemische, kinetische und zelluläre Charakterisierung kovalent-allosterischer Akt-Inhibitoren
Authors: Weisner, Jörn
Abstract: Die Proteinkinase B (auch: Akt) spielt eine essenzielle Rolle in einer Vielzahl zellulärer Signaltransduktionskaskaden, welche grundlegende Prozesse wie Proliferation, Überleben und Apoptose regulieren. Eine Fehlregulation von Akt ist mit diversen kardiovaskulären, neurodegenerativen sowie onkologischen Krankheitsbildern assoziiert. Häufig sind genetische Läsionen in den vorgeschalteten Proteinen wie PI3K und PTEN ursächlich für derartige Erkrankungen, aber auch Alterationen in membranständigen Rezeptor-Tyrosinkinasen wie EGFR und c-Kit können pathologische Änderungen in der Akt-vermittelten Signalweiterleitung bewirken. Direkte Läsionen in Akt, wie bspw. die aktivierende somatische Mutation E17K oder eine Amplifikation und Überexpression von Akt, treten weniger häufig auf, können jedoch ebenfalls als treibender Bestandteil in der Pathogenese involviert sein. Eine pharmakologische Inhibition von Akt kommt daher als vielseitige Strategie für die therapeutische Behandlung diverser Erkrankungen in Frage. Neben den klassischen ATP-kompetitiven Inhibitoren, welche zumeist unzureichende Selektivitätsprofile aufweisen und signifikante Nebenwirkungen induzieren, existieren für Akt auch allosterische Liganden, welche an der Grenzfläche zwischen regulatorischer PH-Domäne und katalytischer Kinase-Domäne binden. Dieser einzigartige Bindungsmodus gewährt eine ausgezeichnete Selektivität für das Zielprotein verbunden mit einer Minimierung der möglichen off-target-vermittelten Toxizitäten.
In der vorliegenden Arbeit wird das rationale Design sowie die Charakterisierung von kovalent-allosterischen Akt-Inhibitoren in biochemischen und zellulären Systemen beschrieben. Basierend auf Komplexkristallstrukturen mit reversibel bindenden Liganden wurden in computergestützten Modellierungsansätzen initial neue Moleküle, welche zusätzlich mit einem Cystein-reaktiven Michael-Akzeptor dekoriert sind, entworfen. Mithilfe von massenspektrometrischen und Aktivitäts-basierten Analysen konnte für eine fokussierte Substanzbibliothek auf Basis des 1,6-Naphthyridinon-Grundgerüsts ein kovalenter Bindungsmechanismus sowie eine potente Inhibition von Akt1 in vitro nachgewiesen werden. In weiterführenden strukturbiologischen Untersuchungen konnten für vier der dargestellten Verbindungen Komplexkristallstrukturen mit Akt1 gelöst und hierdurch die Besetzung der allosterischen Bindetasche in Akt1 sowie die irreversible Bindung zu Cys296 bzw. Cys310 nachgewiesen werden. Unter Verwendung von zellulären, Krebs-relevanten Modellsystemen konnte die anti-proliferative Wirksamkeit dieser neuartigen Substanzklasse abgebildet werden, welche anhand von Western Blot-Studien auf die on-target-Inhibition von Akt zurückgeführt werden konnte. In Folge von in vitro pharmakokinetischen Untersuchungen konnte mit Verbindung 3a (Borussertib) eine Leitstruktur identifiziert werden, deren vielversprechenden Aktivitäts-, Selektivitäts- und PK-Profile eine anschließende Evaluierung in in vivo-Modellen erlaubten. Trotz einer unzureichenden oralen Bioverfügbarkeit sowie einer moderaten MTD von 20 mg/kg bei intraperitonealer Applikation konnte die in vivo-Wirksamkeit der Leitstruktur in Patient-abgeleiteten Xenograft-Modellen des Kolorektal- sowie Pankreaskarzinoms in Kombination mit dem MEK-Inhibitor Trametinib gezeigt werden. Diese Eigenschaften verdeutlichen das Potential der kovalent-allosterischen Akt-Inhibition und bilden zeitgleich das Rational für die Weiterentwicklung und Optimierung der Leitstruktur zum klinischen Kandidaten.
Ein weiteres Projekt beinhaltete die Identifikation und Charakterisierung von Modulatoren des Keap1/Nrf2-Signalwegs, welcher zytoprotektive Funktionen gegenüber oxidativem Stress und Entzündungsprozessen, die in der Entstehung von kardiovaskulären und neurodegenerativen Krankheitsbildern beteiligt sind, vermittelt. Zusätzlich kann eine Fehlregulation von Nrf2 für die Tumorentstehung und progression förderlich sein. Unter Verwendung eines Fluorophor-markierten, Nrf2-mimikrierenden Sondenpeptids und der rekombinanten Kelch-Domäne von Keap1, welche die Protein-Protein-Interaktion mit Nrf2 vermittelt, wurde ein Hochdurchsatz-kompatibler, Fluoreszenzpolarisations-basierter Assay entwickelt. Mithilfe dieses Assays und der Screening-Plattform RASPELD wurde die ca. 30000 Substanzen-umfassende in-house Bibliothek nach Modulatoren der Keap1/Nrf2-PPI durchmustert. Zwar konnte keins der identifizierten Hit-Moleküle in Folgestudien als Inhibitor validiert werden, der entwickelte Assay erweitert dennoch das Portfolio der Screening-Plattform RASPELD und fungiert dabei als Grundlage für zukünftige Screening-Kampagnen auch hinsichtlich der Identifikation von möglichen Stabilisatoren der Keap1/Nrf2-Interaktion.
Desweiteren wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit Elektronenspinresonanz-Spektroskopie-basierte Studien an der p38α MAPK hinsichtlich der konformationellen Plastizität und Aktivierungsschleifendynamik durchgeführt. Hierfür wurde ein heterolog exprimiertes und positionsspezifisch mit dem spin label MTSSL markiertes p38α-Konstrukt eingesetzt und in An- und Abwesenheit von Typ I- und Typ II-Inhibitoren charakterisiert. Die rotatorische Mobilität des eingebrachten Spinmarkers ermöglichte hierbei die Quantifizierung von konformationellen Zuständen in p38α in Abhängigkeit der Ligandenbindung. Mithilfe dieser Methodik konnten zwei separate Zustände der Aktivierungsschleife identifiziert werden, welche der DFG-in- bzw. der DFG-out-Konformation zugeordnet werden konnten und im apo-Zustand im Verhältnis 9:1 vorlagen. Anders als in vorhandenen Komplexkristallstrukturen konnte für keinen der getesteten Typ I- bzw. Typ II-Inhibitoren eine vollständige Verschiebung des Konformations-gleichgewichts zugunsten eines einzelnen Zustands beobachtet werden. Stattdessen waren unabhängig vom gebundenen Liganden beide Konformationen koexistent. Temperaturabhängige Messungen erlaubten die Evaluierung des Konformationsübergangs von DFG-in nach DFG-out auf thermodynamischer Ebene. Im apo-Zustand sowie in der Typ I-Inhibitor-gebundenen Form von p38α war die Gibbs-Energie ΔG positiv, d. h. der Konformationsübergang ist energetisch ungünstig. Für die Typ II-stabilisierte Konformation wurden im Vergleich geringere Reaktionsenthalpien und -entropien ermittelt, was wiederum für eine bevorzugte Adaption der DFG-out-Konformation spricht. Neben der thermodynamischen Differenzierung zwischen Typ I- und Typ II-Inhibitoren bilden die hier präsentierten Ergebnisse auch die Grundlage für detaillierte Folgestudien wie bspw. Abstands-basierte Multilaterationsansätze. Diese ermöglichen eine dreidimensionale Kartierung von flexiblen und dynamischen Strukturelementen in Proteinen, wie bspw. der Aktivierungsschleife in Proteinkinasen, die in Kristallstrukturen häufig unzureichend aufgelöst sind.2020-01-01T00:00:00ZEtablierung von biochemischen und strukturbasierten Systemen zur Charakterisierung wirkstoffresistenter EGFR-MutantenKeul, Marinahttp://hdl.handle.net/2003/391782020-06-24T01:40:51Z2019-01-01T00:00:00ZTitle: Etablierung von biochemischen und strukturbasierten Systemen zur Charakterisierung wirkstoffresistenter EGFR-Mutanten
Authors: Keul, Marina
Abstract: Die Identifikation von EGFR-Mutationen in Exon19 und Exon21 als prädiktive Biomarker, die mit einer erhöhten Sensitivität gegenüber EGFR-Inhibitoren der ersten Generation assoziiert werden konnten, leitete einen Paradigmenwechsel in der Behandlung von NSCLC-Patienten ein.[1-2] In entsprechenden Studien konnte retrospektiv gezeigt werden, dass lediglich Tumore auf die Behandlung mit Gefitinib ansprachen, wenn eine somatische EGFR-Mutation vorlag und im Umkehrschluss Patienten ohne die entsprechende Mutation nicht von der Behandlung mit Gefitinib profitierten, obwohl die Tumore von einer Entität des gleichen Gewebetyps abgeleitet wurden.[3-4] Anhand dieses Beispiels wurde einerseits das enorme Potential der zielgerichteten Therapie deutlich, aber auch die Tatsache, dass ein tiefgründiges Verständnis der Tumorbiologie eine Voraussetzung für die erfolgreiche zielgerichtete Krebstherapie darstellt.
Mit dem Ziel charakteristische Merkmale der einzelnen EGFR-Mutanten herauszuarbeiten und innerhalb von Optimierungsstudien an neuartigen Inhibitoren SAR-Profile erstellen zu können, wurden im Rahmen dieser Arbeit verschiedene biochemische und strukturbiologische Systeme für Untersuchungen an wirkstoffresistenten Varianten des EGF-Rezeptors etabliert. Dazu wurde im ersten Schritt die Proteinexpression für einzelne Mutanten des EGFRs in Insektenzellen etabliert und optimiert, um im Anschluss diese durch geeignete Reinigungsstrategien in ausreichender Menge und Reinheit zu erhalten. Auf diesem Weg wurden die EGFR-del19, EGFR-del19/G724S und die EGFR-L858R/T790M/C797S Mutanten für biochemische Assays und die EGFR-T790M/E865A/E866A/K867A sowie die EGFR-T790M/V948R Variante für Kristallisationsstudien erhalten. Ferner konnten entsprechende aktivitätsbasierte Assaysysteme etabliert und Kristallisationssysteme für die EGFR-T790M/V948R Mutante entwickelt werden.
Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit lag auf der Charakterisierung von neuartigen Inhibitoren zur Adressierung der EGFR-T790M Mutante, wobei die kovalente Adressierung des Cys797 in vorangegangenen Studien als entscheidender Faktor für die effiziente Inhibition der Türstehermutante identifiziert und durch die Einführung von Michael-Akzeptorsystemen in verschiedene Gerüstklassen realisiert wurde. Aufgrund des kovalenten Charakters der Bindungsmechanismus ist eine Beurteilung der Aktivität in biochemischen Systemen anhand des IC50-Werts nur schätzungsweise möglich. Daher wurden detaillierte kinetische Bindungsstudien zur Bestimmung der initialen reversiblen Affinität Ki einer Verbindung zum Enzym und der Rate der Inaktivierung kinact herangezogen und distinkte Profile der einzelnen Gerüstklassen ermittelt. So zeigte sich für Pyrazolopyrimidin-basierte Inhibitoren und Pyrimidin-abgeleitete Inhibitoren eine hohe Abhängigkeit der inhibitorischen Wirksamkeit vom kovalenten Charakter der Bindung, was sich in hohen kinact-Werten manifestierte.
In Korrelation mit diesen Daten, resultierte die Einführung der C797S-Mutation in einem drastischen Verlust der inhibitorischen Aktivität.
Weiterhin wurden Pyrrolopyrimidin-basierte Inhibitoren kinetisch evaluiert, für die eine ausgesprochen hohe reversible Affinität nachgewiesen werden konnte und Ki-Werte der Verbindungen im subnanomolaren Bereich gegenüber der EGFR-L858R/T790M Mutante ermittelt wurden. An dieser Stelle konnte zum ersten Mal eine hohe inhibitorische Potenz gegenüber der EGFR-L858R/T790M/C797S Mutante in biochemischen Assays beobachtet werden, so wurde beispielsweise für den Inhibitor RL2029 ein IC50-Wert von etwa 8 nM festgestellt. Im Folgenden konnte diese Aktivität aber nicht in zelluläre Potenz translatiert werden, welches auf die schlechte Zell-Permeabilität der Verbindungen zurückzuführen sein könnte und einen Ansatzpunkt für weitere Optimierungsstudien darstellt.
In dieser Arbeit wurde außerdem eine Durchmusterung der laborinternen Substanzbibliothek nach aktiven Verbindungen gegenüber der PC9-T790M/C797S Zelllinie mit Hilfe der semi-automatisierten Screening-Einheit RASPELD vorgenommen. Hierbei wurden initial 148 Verbindungen identifiziert, die eine Reduktion der Viabilität der untersuchten Zellen um 70% hervorriefen. In weiterführenden Hitvalidierungsstudien wurden fünf interessante Substanzen identifiziert, die EC50-Werte im niedrigen mikromolaren Bereich gegenüber EGFR-mutierten Zelllinien zeigten und gleichzeitig keine Aktivität gegenüber EGFR-WT Zelllinien demonstrierten. Jedoch konnte in biochemischen aktivitätsbasierten Assaysystemen keine inhibitorische Aktivität der Hitverbindungen gegenüber den verschiedenen EGFR-Varianten festgestellt werden, sodass Western-Blot Studien angeschlossen werden sollten oder gegebenenfalls andere Zielstrukturen der Verbindungen in Betracht gezogen werden sollten.
In einem weiteren Teil dieser Arbeit erfolgte innerhalb eines Kooperationsprojektes eine tiefgreifende Charakterisierung der kürzlich identifizierten EGFR-del19/G724S Mutation, die in Patienten eine Wirkstoffresistenz gegenüber des Drittgenerationsinhibitors Osimertinib vermittelt. In biochemischen Assays konnte die klinische Beobachtung verifiziert und nachgestellt werden, sodass das etablierte System als Grundlage für Screening-Experimente genutzt werden konnte. Die Durchmusterung einer fokussierten Substanzbibliothek ergab signifikante Unterschiede in der Potenz der einzelnen Generationen an EGFR-Inhibitoren, sodass abgeleitet werden konnte, dass die del19/G724S-Mutation eine Resistenz gegenüber allen bekannten Drittgenerationsinhibitoren vermittelt. Weiterhin konnten Zweitgenerationsinhibitoren wie Afatinib und Poziotinib als potente Inhibitoren identifiziert werden, für die auch in kinetischen Profilierungen eine hohe Affinität (Ki<1 nM) gegenüber der Osimertinib-resistenten Mutation nachgewiesen werden konnte. Schlussendlich konnte die hohe inhibitorische Wirksamkeit des Afatinibs gegenüber der EGFR-del19/G724S Mutante in zelluläre Potenz und in vivo Aktivität gezeigt werden.2019-01-01T00:00:00ZCovalent-allosteric inhibitors to achieve akt isoform-selectivityQuambusch, LenaLandel, InaDepta, LauraWeisner, JörnUhlenbrock, NiklasMüller, Matthias P.Glanemann, FranziskaAlthoff, KristinaSiveke, Jens T.Rauh, Danielhttp://hdl.handle.net/2003/390332020-03-06T02:40:49Z2019-10-04T00:00:00ZTitle: Covalent-allosteric inhibitors to achieve akt isoform-selectivity
Authors: Quambusch, Lena; Landel, Ina; Depta, Laura; Weisner, Jörn; Uhlenbrock, Niklas; Müller, Matthias P.; Glanemann, Franziska; Althoff, Kristina; Siveke, Jens T.; Rauh, Daniel
Abstract: Isoforms of protein kinase Akt are involved in essential processes including cell proliferation, survival, and metabolism. However, their individual roles in health and disease have not been thoroughly evaluated. Thus, there is an urgent need for perturbation studies, preferably mediated by highly selective bioactive small molecules. Herein, we present a structure‐guided approach for the design of structurally diverse and pharmacologically beneficial covalent‐allosteric modifiers, which enabled an investigation of the isoform‐specific preferences and the important residues within the allosteric site of the different isoforms. The biochemical, cellular, and structural evaluations revealed interactions responsible for the selective binding profiles. The isoform‐selective covalent‐allosteric Akt inhibitors that emerged from this approach showed a conclusive structure–activity relationship and broke ground in the development of selective probes to delineate the isoform‐specific functions of Akt kinases.2019-10-04T00:00:00ZOptimized 4,5-diarylimidazoles as potent/selective inhibitors of protein kinase CK1δ and their structural relation to p38α MAPKHalekotte, JakobWitt, LydiaIanes, ChiaraKrüger, MarcBührmann, MikeRauh, DanielPichlo, ChristianBrunstein, ElenaLuxenburger, AndreasBaumann, UlrichKnippschild, UweBischof, JoachimPeifer, Christianhttp://hdl.handle.net/2003/385182020-01-14T02:40:55Z2017-03-24T00:00:00ZTitle: Optimized 4,5-diarylimidazoles as potent/selective inhibitors of protein kinase CK1δ and their structural relation to p38α MAPK
Authors: Halekotte, Jakob; Witt, Lydia; Ianes, Chiara; Krüger, Marc; Bührmann, Mike; Rauh, Daniel; Pichlo, Christian; Brunstein, Elena; Luxenburger, Andreas; Baumann, Ulrich; Knippschild, Uwe; Bischof, Joachim; Peifer, Christian
Abstract: The involvement of protein kinase CK1δ in the pathogenesis of severe disorders such as Alzheimer’s disease, amyotrophic lateral sclerosis, familial advanced sleep phase syndrome, and cancer has dramatically increased interest in the development of effective small molecule inhibitors for both therapeutic application and basic research. Unfortunately, the design of CK1 isoform-specific compounds has proved to be highly complicated due to the existence of six evolutionarily conserved human CK1 members that possess similar, different, or even opposite physiological and pathophysiological implications. Consequently, only few potent and selective CK1δ inhibitors have been reported so far and structurally divergent approaches are urgently needed in order to establish SAR that might enable complete discrimination of CK1 isoforms and related p38α MAPK. In this study we report on design and characterization of optimized 4,5-diarylimidazoles as highly effective ATP-competitive inhibitors of CK1δ with compounds 11b (IC50 CK1δ = 4 nM, IC50 CK1ε = 25 nM), 12a (IC50 CK1δ = 19 nM, IC50 CK1ε = 227 nM), and 16b (IC50 CK1δ = 8 nM, IC50 CK1ε = 81 nM) being among the most potent CK1δ-targeting agents published to date. Inhibitor compound 11b, displaying potential as a pharmacological tool, has further been profiled over a panel of 321 protein kinases exhibiting high selectivity. Cellular efficacy has been evaluated in human pancreatic cancer cell lines Colo357 (EC50 = 3.5 µM) and Panc89 (EC50 = 1.5 µM). SAR is substantiated by X-ray crystallographic analysis of 16b in CK1δ and 11b in p38α.2017-03-24T00:00:00ZProtein binding site comparisonEhrt, Christianehttp://hdl.handle.net/2003/382922019-10-19T01:41:17Z2019-01-01T00:00:00ZTitle: Protein binding site comparison
Authors: Ehrt, Christiane
Abstract: The aim of the present study was the identification of novel hit compounds for the inhibition of trypanothione synthetase (TryS) from organisms of the genus Leishmania. They are the causative agents of the so-called neglected diseases. There is an urgent need for novel therapeutics for these diseases as the current treatment methods are not sufficiently reliable when compared to the medical management for diseases prevalent in developed high-income countries.
The basic idea of this work was to set up a structure-based drug repurposing workflow based on similarities between the ATP binding sites of TryS from Leishmania major and protein kinases. The latter enzymes are well characterised, and this approach benefits from the huge knowledge of drug-like small molecule inhibitors of protein kinases.
However, the establishment of such a workflow requires the reliable interplay of multiple software methods for in silico structure-based modelling. The chosen workflow includes the comparative modelling of the enzymes under investigation, MD simulation studies, an in-depth analysis of pocket properties, the comparison of binding sites of TryS and kinases, and a subsequent molecular docking of known inhibitors of protein kinases which are most similar to TryS with respect to the ATP binding site properties.
The breakneck developments in the field of in silico hit identification led to the emergence of a myriad of available methods to meet similar targets. Current state-of-the-art methods evolved for often applied structure-based methods such as molecular docking or pharmacophore searches. Unfortunately, methods for the prediction, analysis, and comparison of binding sites are less frequently applied. This led to the parallel development of numerous methods which differ in multiple aspects. This diversity necessitates reliable comparison and benchmark analyses to elucidate the most suitable approaches for a pre-defined scientific question. In consequence, a main part of the present work is dedicated to the comprehensive evaluation of developed software for the prediction and comparison of binding sites. The analyses shed light on the major strengths and restrictions of the methods under investigation. The results ensure that only the most reliable methods are chosen for the problem under investigation. For binding site prediction methods, we can pinpoint a restricted set of exceptionally reliable methods. The case is different for binding site comparison tools. We must finally conclude that the establishment of a consensus approach might be the most appropriate way to identify binding site similarities.
Besides the comparison of binding sites based on physicochemical and shape properties, an alternative approach was tested for its applicability for the presented project. Based on the observation that some less closely related proteins binding to similar scaffolds share a common arrangement of SSEs in the ligand binding sites, it was hypothesised that finding similar arrangements of SSEs in unrelated proteins might facilitate the search for novel promising scaffold for yet unexplored enzymes. This so-called “ligand-sensing cores” approach was adopted for the comparison of ATP binding sites of TryS and kinases.
However, the results for this case study indicate not only that it is difficult to pinpoint specific and unique secondary structure element arrangements in protein binding sites, but also that the success in establishing a novel method rises and falls with the availability of proper optimisation datasets and the reliability of secondary structure assignment methods. We tried to solve at least the latter part of the problem by developing the novel secondary structure assignment tool SCOT which classifies geometrically uniform helices and strands. But especially with respect to parameter optimisation, further developments of SSE comparison methods and the generation of suitable datasets will be necessary.
However, with respect to the target of this study, we could show that well-established methods for the comparison of protein binding sites are perfectly suitable to pinpoint similarities between the nucleotide binding sites of TryS and protein kinases. Known inhibitors of protein kinases with the most significant similarities to the target and structurally related compounds were investigated. Finally, we could propose promising molecules for addressing the ATP binding site of TryS which must now be evaluated experimentally for their potential to inhibit TryS from Leishmania.2019-01-01T00:00:00ZA benchmark driven guide to binding site comparison: an exhaustive evaluation using tailor-made data sets (ProSPECCTs)Ehrt, ChristianeBrinkjost, TobiasKoch, Oliverhttp://hdl.handle.net/2003/381062019-06-20T01:40:49Z2018-11-08T00:00:00ZTitle: A benchmark driven guide to binding site comparison: an exhaustive evaluation using tailor-made data sets (ProSPECCTs)
Authors: Ehrt, Christiane; Brinkjost, Tobias; Koch, Oliver
Abstract: The automated comparison of protein-ligand binding sites provides useful insights into yet unexplored site similarities. Various stages of computational and chemical biology research can benefit from this knowledge. The search for putative off-targets and the establishment of polypharmacological effects by comparing binding sites led to promising results for numerous projects. Although many cavity comparison methods are available, a comprehensive analysis to guide the choice of a tool for a specific application is wanting. Moreover, the broad variety of binding site modeling approaches, comparison algorithms, and scoring metrics impedes this choice. Herein, we aim to elucidate strengths and weaknesses of binding site comparison methodologies. A detailed benchmark study is the only possibility to rationalize the selection of appropriate tools for different scenarios. Specific evaluation data sets were developed to shed light on multiple aspects of binding site comparison. An assembly of all applied benchmark sets (ProSPECCTs–Protein Site Pairs for the Evaluation of Cavity Comparison Tools) is made available for the evaluation and optimization of further and still emerging methods. The results indicate the importance of such analyses to facilitate the choice of a methodology that complies with the requirements of a specific scientific challenge.2018-11-08T00:00:00ZStruktur-basiertes Design, Synthese und Evaluation von Sondenmolekülen und Wirkstoffkandidaten zur Adressierung der Proteinkinase AktUhlenbrock, Niklashttp://hdl.handle.net/2003/380952019-06-18T01:40:49Z2019-01-01T00:00:00ZTitle: Struktur-basiertes Design, Synthese und Evaluation von Sondenmolekülen und Wirkstoffkandidaten zur Adressierung der Proteinkinase Akt
Authors: Uhlenbrock, Niklas
Abstract: Krebs kommt aufgrund der stetig steigenden Anzahl an Neuerkrankungen und Todesfällen eine immer größer werdende Bedeutung in der Gesellschaft zu.1 In jüngerer Vergangenheit wurde die therapeutische Behandlung dieser Erkrankung durch den vielversprechenden Ansatz der sogenannten Präzisionsmedizin revolutioniert. Die Onkologie erlebt einen Wandel vom Einsatz klassischer unspezifischer Zytostatika hin zu einer Biomarker-adaptierten, zielgerichteten Adressierung onkogener Zielstrukturen.3 Die Proteinkinase Akt stellt eine dieser Zielstrukturen dar, die im Rahmen dieser Dissertation mithilfe kovalent-allosterischer Akt-Inhibitoren (CAAIs) adressiert wurde. Basierend auf der Entdeckung des CAAI Borussertib wurde zunächst dessen Synthese dahingehend optimiert, dass diese die Darstellung des Inhibitors im Gramm-Maßstab erlaubte, um Substanz-intensive weiter¬führende Studien umsetzen zu können. In KRas-ahängigen PDX-Modellen wurde daraufhin die in vivo-Wirksamkeit von Borussertib in Kombinations-therapie mit dem Mek-Inhibitor Trametinib validiert. Um eine weitere Entwicklung der CAAIs zu ermöglichen, wurden in einem Struktur-basierten Ansatz tiefere Einblicke über Derivatisierung und Strukturanalyse in die Struktur-Aktivitäts-Beziehungen gewonnen und der chemische Raum erweitert. Darüber hinaus wurden über verschiedene scaffold hopping-Ansätze vielver¬spre-chende Kandidaten mit großen Entwicklungspotenzial gewonnen. Zur Untersuchung der Konformations-abhängigen Funktionen der Proteinkinase Akt wurden funktionale Sonden in einem Struktur-basierten Ansatz entworfen, synthe¬tisiert und charakterisiert. Um weiterhin auch die Isoform-spezifischen Eigenschaften untersuchen zu können, konnten zudem auf Grundlage literaturbekannter Akt-Isoform-selektiver Inhibitoren neuartige CAAIs mit einem viel-ver¬sprechendem Selektivitätsprofil dargestellt werden.; Given the increasing number of new cases and the fact that nowadays one of two Germans will be faced with a diagnosis during lifetime, cancer takes on more and more increasing impor¬tance. However, since two decades of precision medicine revolutionized the treatment of cancer: the therapy undergoes a change from classical therapeutic cytostatic agents to a biomarker-driven treatment of oncogenic target structures. As a key player in the PI3K/Akt/mTOR-pathway, the protein kinase Akt reflects the signi¬ficance of protein kinases in cellular processes. In this thesis, Akt was targeted with covalent-allosteric Akt inhibitors (CAAIs). Within this work, the synthesis of the first-in-class CAAI borussertib was optimized regarding the suitability of synthesis in bulk scale. In KRas-dependent xenograft-models (PDX), the in vivo efficacy of borussertib in combination therapy with Mek inhibitor trametinib was validated. For further development of improved CAAIs, deeper insights into the structure-activity relationships were gained in a structure-based design approach by derivatization and structural elucidation. Thus, we replaced the hydrophobic 1,6-naphthyridinone scaffold using two different scaffold hopping strategies, novel candidates with high potential for further optimization were identified. To further investigate the conformation-dependent functions of the protein kinase Akt, functional probes were designed, synthesized and characterized. Furthermore, based on published isoform-selective inhibitors we developed novel CAAIs with an interesting selectivity profile.2019-01-01T00:00:00ZA novel interaction fingerprint derived from per atom score contributionsKoch, OliverJasper, Julia B.Humbeck, LinaBrinkjost, Tobiashttp://hdl.handle.net/2003/380232019-04-24T01:40:45Z2018-03-16T00:00:00ZTitle: A novel interaction fingerprint derived from per atom score contributions
Authors: Koch, Oliver; Jasper, Julia B.; Humbeck, Lina; Brinkjost, Tobias
Abstract: Protein ligand interaction fingerprints are a powerful approach for the analysis and assessment of docking poses to improve docking performance in virtual screening. In this study, a novel interaction fingerprint approach (PADIF, protein per atom score contributions derived interaction fingerprint) is presented which was specifically designed for utilising the GOLD scoring functions’ atom contributions together with a specific scoring scheme. This allows the incorporation of known protein–ligand complex structures for a target-specific scoring. Unlike many other methods, this approach uses weighting factors reflecting the relative frequency of a specific interaction in the references and penalizes destabilizing interactions. In addition, and for the first time, an exhaustive validation study was performed that assesses the performance of PADIF and two other interaction fingerprints in virtual screening. Here, PADIF shows superior results, and some rules of thumb for a successful use of interaction fingerprints could be identified.2018-03-16T00:00:00ZMorphological and intracellular response of the liver to bile acid-mediated toxicity in cholestasisDamle-Vartak, Amrutahttp://hdl.handle.net/2003/371982018-10-20T01:40:57Z2018-01-01T00:00:00ZTitle: Morphological and intracellular response of the liver to bile acid-mediated toxicity in cholestasis
Authors: Damle-Vartak, Amruta2018-01-01T00:00:00ZDesign, Synthese und zelluläre Charakterisierung von Inhibitoren onkogener und Wirkstoff-resistenter Mutanten der ErbB-FamilieLategahn, Jonashttp://hdl.handle.net/2003/371212018-09-07T01:41:03Z2018-01-01T00:00:00ZTitle: Design, Synthese und zelluläre Charakterisierung von Inhibitoren onkogener und Wirkstoff-resistenter Mutanten der ErbB-Familie
Authors: Lategahn, Jonas
Abstract: Nicht-kleinzelliger Lungenkrebs (NSCLC) ist die häufigste Ursache für Krebs-bezogene Todesfälle weltweit.[1] Die Behandlung von NSCLC hat jedoch in den letzten zehn Jahren eine Revolution erfahren: Die Identifizierung von prädiktiven Biomarkern und ein detailliertes Verständnis von deren biochemischen und molekularen Eigenschaften erlaubte die Entwicklung von zielgerichteten, spezifischen Inhibitoren der mutierten Onkoproteine. Diese sogenannte Präzisionsmedizin stellt einen alternativen Behandlungsansatz zur zytotoxischen Chemotherapie dar und führte bei entsprechend behandelten Patienten zu einer deutlichen Verbesserung der Überlebensraten und der Lebensqualität.[2,3] Während die mittlere Überlebensrate im Jahr 2000 noch bei acht Monaten nach Diagnose lag, konnte diese so auf bis zu 30 Monate im Jahr 2014 gesteigert werden.[4,5] Die Entstehung von Resistenzen gegen die Behandlung mit zielgerichteten Therapeutika ist allerdings unumgänglich und erfordert die stetige Aufklärung der Resistenzmechanismen, sowie die Entwicklung neuer Wirkstoffe.[6]
Im Rahmen dieser Arbeit wurden Inhibitoren von mutierten Varianten der ErbB-Rezeptor-Tyrosinkinasen EGFR und Her2 evaluiert und weiterentwickelt. Diese Zielproteine spielen eine entscheidende Rolle bei der Entstehung von Lungenkrebs und können mit niedermolekularen Wirkstoffen inhibiert werden. Dazu wurden Viabilitäts-Assays für elf Krebs-Zelllinien etabliert und erlaubten in Kombination mit biochemischen Aktivitäts-basierten Assays die Bewertung mehrerer Serien an Inhibitoren der ErbB-Kinasen. Zusätzliche Informationen zu den Bindungscharakteristiken konnten durch Komplexstrukturen mit den jeweiligen Zielproteinen, sowie durch Auswertung der Bindungskinetiken erhalten werden.
[1] J. Ferlay, I. Soerjomataram, R. Dikshit, S. Eser, C. Mathers, M. Rebelo, D. M. Parkin, D. Forman, F. Bray. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. Int. J. Cancer 2015, 136, E359-386.
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[3] S. O. Dolly, D. C. Collins, R. Sundar, S. Popat, T. A. Yap. Advances in the Development of Molecularly Targeted Agents in Non-Small-Cell Lung Cancer. Drugs 2017, 77, 813-827.
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Authors: Kaitsiotou, Helena
Abstract: Die Verwendung von kleinen organischen Molekülen gegen Rezeptor-Tyrosinkinasen (RTKs) hat sich in der modernen Krebstherapie als wertvolle Therapie-Strategie erwiesen. Die Assoziation von Krebs mit der Dysregulation von Signalwegen, die mit RTKs verbunden sind, ist ein Schlüsselelement in der gezielten Krebstherapie. Die Tyrosinkinase Stammzellenfaktorrezeptor KIT ist ein Beispiel für eine klinisch relevante RTK. KIT ist ein Zielprotein in der Therapie von gastrointestinalen Stroma-tumoren (GIST) und chronischer myeloischer Leukämie (CML). Erworbene Resistenzmutationen innerhalb der katalytischen Domäne verringern jedoch die Wirksamkeit und sind die häufigste Ursache für eine fehlgeschlagene Therapie. In der vorliegenden Arbeit sollte das strukturbasierte Design und die Synthese einer fokussierten Substanzbibliothek zur Adressierung klinisch relevanter KIT Mutationen sowie die anschließende biochemische und zelluläre Charakterisierung dieser Substanzen erfolgen, um Wirkstoffresistenzen in KIT-abhängigen Krebserkrankungen zu überwinden. Als strukturelle Basis für das rationale Inhibitordesign wurde das Grundgerüst des derzeit effektivsten zugelassenen Inhibitors Ponatinib herangezogen, um Optimierungsstudien hinsichtlich einer erhöhten Potenz, insbesondere für die Sekundärmutation V654A, einer verbesserten Selektivität und damit einer verringerten Toxizität durchzuführen. Insbesondere sollte dabei die Möglichkeit zur Optimierung der Selektivität zu der strukturell verwandten Kinase VEGFR2 untersucht werden. Ausgehend von publizierten Kristallstrukturen wurden computerchemische Methoden zur Generierung von MD Simulationen der Mutanten V654A und T670I verwendet, um eine differenzierte Analyse ihrer strukturellen Konformationen durchzuführen und die erhaltenen Informationen in das strukturbasierte Inhibitordesign einfließen zu lassen. Die Analyse aller experimentell ermittelten Daten erlaubte die Identifizierung wichtiger Strukturmotive und Substitutionsmuster für das Inhibitordesign, die essentiell für eine erfolgreiche Inhibition der KIT Varianten sind. Der zweite Teil dieser Arbeit beinhaltet die Untersuchung der Möglichkeit, KIT irreversibel zu adressieren, um die Verweilzeit und damit Effizienz von potentiellen Inhibitoren zur Zielkinase zu maximieren und eine Verbesserung des Selektivitätsprofils dieser zu erreichen. Zusammenfassend konnten durch die Nutzung strukturbasierter Methoden Inhibitoren für unterschiedliche klinisch relevante KIT-Mutanten entwickelt werden.2018-01-01T00:00:00ZDevelopment of synthesis methodology for DNA-encoded librariesKlika Škopić, Matejahttp://hdl.handle.net/2003/367842018-03-02T02:40:51Z2017-01-01T00:00:00ZTitle: Development of synthesis methodology for DNA-encoded libraries
Authors: Klika Škopić, Mateja2017-01-01T00:00:00ZStrukturbiologische Untersuchungen von KinaseinhibitorenBührmann, Mikehttp://hdl.handle.net/2003/363392018-01-20T02:40:49Z2017-01-01T00:00:00ZTitle: Strukturbiologische Untersuchungen von Kinaseinhibitoren
Authors: Bührmann, Mike
Abstract: The main function of protein kinases is widely considered the activation of their substrates by catalytic phosphotransfer from adenosine-5‘-triphosphate (ATP), explaining the central role of kinases in cellular signaling cascades. Recently, more and more functions independent from this catalytic mechanism were described, that are involved in several biological processes, e.g., by regulation or localization of their substrates via protein-protein interactions or the formation of multi-enzyme complexes, respectively. This is usually realized by addressing alternative binding regions distant from the enzyme’s active site. Hence, the discovery of corresponding binding pockets and the development of small molecules capable of modulating scaffolding functions are of great interest in current scientific research.
In the present work, the structure-based design and organic synthesis of 2-arylquinazolines, which were identified as ligands of a lipophilic binding pocket (LiPoLis) in p38α mitogen-activated protein kinase (MAPK), is described. Since the function of this pocket is not fully understood yet, the LiPoLis were thought to aid in elucidating its biological role. The generated compounds were characterized applying several biophysical methods to determine their affinity towards the enzyme and the suggested binding mode was validated by means of protein crystallography. Concluding these studies, the ligands were shown to positively address the lipophilic pocket (LP) but exhibiting a very low affinity, making them unsuitable to serve as molecular probes in biological systems. Consequently, electrophile-decorated LiPoLis were designed to target cysteine mutants of p38α MAPK, forming a covalent bond within the LP to maximize the residence time at the enzyme. Employing mass spectrometric analysis, specific ligand-protein pairs were identified and in tandem measurements and via co-crystallization, the introduced cysteines were verified as the actual labeling positions.
Therefore, it could be shown that the thus found ligands exhibit a favorable reactivity and accordingly irreversible modifications of the target enzyme, rendering them suitable to be used in future studies to dissect the biological function of the described binding pocket in p38α MAPK.
In another part of this thesis, various complex crystal structures of diverse ATP-competitive p38α MAPK inhibitors could be solved and were discussed, significantly contributing insightful results with respect to the underlying scientific questions.2017-01-01T00:00:00Z