Eldorado Collection:
http://hdl.handle.net/2003/260
2024-03-29T14:23:09ZDesign and synthesis of photoactivatable myristic acid analogues for UNC119 cargo interactions and target identification of autophagy inhibitors
http://hdl.handle.net/2003/38152
Title: Design and synthesis of photoactivatable myristic acid analogues for UNC119 cargo interactions and target identification of autophagy inhibitors
Authors: Kaiser, Nadine
Abstract: UNC119 is a chaperone protein, which regulates the trafficking of myristoylated proteins between cellular membranes. Even though these chaperones were extensively studied in the past two decades, only few of their interaction partners are known to date. In the course of this thesis three different photoactivatable myristic acid analogues (Pacman 1-3) were designed and synthesized to study this protein-myristate interaction. Exclusively Pacman-3-based probes covalently labeled UNC119 proteins. The photocrosslinking site of Pacman-3 probes within the hydrophobic pocket of UNC119 was characterized. The myristate analogues binding mode is similar to the native myristate moiety. Substrate recognition of Pacman-3 by N-myristoyl transferase (NMT) enzymes from different organisms was investigated. Pacman-3 was not incorporated into a peptide substrate by human NMT. Remarkably, NMT derived from the protozoan parasite Leishmania and Trypanosoma recognized Pacman 3 as a substrate. Conclusively, Pacman-3 can serve as a valuable tool to investigate the role of UNC119 protein in these parasites and to identify novel myristoyl-interaction partners. The second project of this thesis focused on autophagy. Autophagy is an essential biological process for the regulation of cellular homeostasis and energy supply. Modulators of autophagy can provide insight into the regulation of autophagic flux and unravel its role in various diseases. In order to identify novel autophagy modulators, a phenotypic screen was performed. Three structurally different potential inhibitors of autophagy were investigated in detail. The first compound was a representative of the oxazolidinone-scaffold, namely Autoxain. Initial experimental results indicated a similar mode of action as the antibiotics linezolid and tedizolid, which exert their antibacterial activity by inhibition of protein biosynthesis via the ribosome. The second small molecule was Autoquin, which prevents autophagosome-lysosome fusion. An affinity enrichment experiment suggested a similar mode of action to the known autophagy inhibitors salinomycin and ironomycin, which sequester iron in the lysosome. Autophagy plays a crucial role in maintenance of cellular iron homeostasis and novel tool compounds, which could shed light on this biological process are highly relevant. The autophagy inhibitor Authipyrin interferes with mitochondrial respiration by direct inhibition of complex I. Complex I activity is required for regular autophagic flux. Furthermore, mitophagy is frequently dysregulated in patients suffering from Parkinson’s disease. However, the exact mechanism underlying this interplay remains to be elucidated.; UNC119 ist ein Chaperon-Protein, welches den Transport myristoylierter Proteine zwischen zellulären Membranen reguliert. Obwohl dieses Chaperon in den vergangenen zwei Jahrzehnten intensiv erforscht wurde, sind bislang nur wenige Interaktionspartner bekannt. Im Verlauf dieser Dissertation wurden drei verschiedene photoaktivierbare Myristatanaloga entworfen und synthetisiert um diese Protein-Myristoyl Interaktion zu untersuchen. Ausschließlich Pacman-3 basierte Proben gingen eine kovalente Querverbindung mit UNC119 Proteinen ein. Charakterisierung der Lage der Photomarkierung durch Pacman-3 innerhalb der hydrophoben Tasche zeigte, dass der Bindungsmodus des Myristinsäureanalogs ähnlich zu dem der nativen Myristinsäure-Gruppe ist. Anschließend wurde die Substraterkennung von Pacman-3 durch N-Myristoyl Transferase (NMT) Enzyme aus unterschiedlichen Organismen untersucht. Pacman-3 wurde nicht durch die humane NMT auf das Peptidsubstrat übertragen. Bemerkenswerterweise erkannten NMTs, aus den parasitischen Protozoen Leishmania und Trypanosoma, Pacman-3 als Substrat. Daher könnte Pacman-3 als wertvolles Hilfsmittel dienen, um die Rolle von UNC119 in diesen Parasiten zu erforschen und neue Myristoyl-Interaktionspartner zu identifizieren. Autophagie ist ein essentieller biologischer Prozess für die Regulierung der zellulären Homöostase und Energieversorgung. Autophagie-Modulatoren sind äußert wertvolle Hilfsmittel, welche Einsicht in die Regulierung der Autophagie verschaffen und deren Rolle in verschiedenen Krankheiten entschlüsseln können. Um neue Autophagie-Modulatoren zu finden und zu charakterisieren wurde ein phänotypischer Screen durchgeführt. Drei strukturell unterschiedliche potentielle Autophagie Inhibitoren wurden genauer untersucht. Die erste Verbindung ist ein Stellvertreter des Oxazolidin-Gerüsts, genannt Autoxain. Erste experimentelle Ergebnisse wiesen auf ein ähnliches Wirkprinzip, wie das der Oxazolidin-basierten Antibiotika Linezolid und Tedizolid hin. Beide dieser Therapeutika üben ihre antibakterielle Wirkung durch die Inhibierung der Proteinbiosynthese durch das Ribosom aus. Die nächste Substanz war Autoquin, welche die Fusion des Autophagosoms mit dem Lysosom verhindert. Ein Experiment zur Affinitätsanreicherung wies auf ein ähnliches Wirkprinzip, wie die bekannten Autophagie-Inhibitoren Salinomycin und Ironomycin hin, welche Eisen im Lysosom anreichern. Autophagie spielt eine wichtige Rolle in der Erhaltung der zellulären Eisen-Homöostase und neue Hilfsmittel, welche diesen biologischen Prozess aufklären können, sind hochrelevant. Der Autophagie-Inhibitor Authipyrin beeinträchtigt die mitochondrielle Atmung durch die direkte Inhibierung von Komplex I. Komplex I Aktivität wird für den normalen Verlauf der Autophagie benötigt. Weiterhin weißt die Mitophagie häufig Fehlfunktionen in Patienten auf, welche unter Parkinson leiden. Allerdings ist der genaue Mechanismus, welcher dieser Erkrankung zugrunde liegt noch ungeklärt.2019-01-01T00:00:00ZSpatial unification of coupling interactions between EGFR and PTPs establishes a growth factor sensing network
http://hdl.handle.net/2003/38129
Title: Spatial unification of coupling interactions between EGFR and PTPs establishes a growth factor sensing network
Authors: Stanoev, Angel
Abstract: Cells continuously sense and respond to stimuli from the non-stationary environment. For this, they optimise processing of the perceived signals while maintaining continuous responsiveness. Cell surface receptors, such as the receptor tyrosine kinases, comprise the first layer of sensing. They translate the extracellular signal into internal activity using the protein interaction networks in which they are embedded.
The proto-oncogenic epidermal growth factor receptor (EGFR) is a receptor tyrosine kinase whose sensitivity to epidermal growth factor (EGF) and signalling duration determines cellular behaviour. In the canonical view, signal processing occurs through the ligand-induced dimer formation mechanism and subsequent trans-phosphorylation. However, it has been also established recently that signal amplification via the unliganded EGFR monomers through an autocatalytic mechanism enhances the phosphorylation response of EGFR.
In this thesis, I demonstrate how autocatalytic phosphorylation of EGFR in concert with the coupling interactions with the protein tyrosine phosphatases (PTPs) shape the response dynamics of EGFR. Single cell dose-response analysis revealed that a toggle switch between autocatalytically activated monomeric EGFR and the tumour suppressor PTPRG at the plasma membrane (PM) shapes the sensitivity of EGFR to EGF dose. As the system exhibits switch-like activation due to the bistable regime of operation, irreversible activation occurs as an adversary side effect. To ensure continuous growth factor sensing, the system is positioned outside of the bistable regime by the PM-localised PTPRJ, which negatively regulates EGFR phosphorylation. On the other hand, a spatially-distributed negative feedback with the ER-bound PTPN2 that is established by vesicular trafficking resets the phosphorylation state of monomeric EGFR on the plasma membrane. The distinct recycling route of the unliganded receptor, as opposed to the unidirectional degradation route towards the perinuclear area of the liganded receptor, enables it to repopulate the plasma membrane and thus maintain sensitivity to upcoming stimuli.
In this manner, the coupling interactions between EGFR and the PTPs on different membranes are spatially unified in a network that enables sensing of time-varying EGF signals. The signal processing capabilities of this network are optimised by the system organisation, as its parameters are poised at the criticality point, just outside the bistable regime of operation. In this region, the EGFR response is characterised by prolonged but reversible phosphorylation, enabling the cell to maintain a balance between preserving a transient memory of previous EGF stimulations, while still remaining responsive to upcoming stimuli.2018-01-01T00:00:00ZDistinct focal adhesion protein modules control the adhesion site segregation and cell migration behavior
http://hdl.handle.net/2003/37871
Title: Distinct focal adhesion protein modules control the adhesion site segregation and cell migration behavior
Authors: Imtiaz, Sarah
Abstract: Cell adhesion and migration require a tightly regulated organization of cytoskeleton and cell-matrix adhesion sites which are large protein complexes consisted of multiple components. To address the question how the core focal adhesion (FA) proteins mediate the adhesion segregation process to form fibrillar adhesions (FB) and how they regulate cell motility, a high-content imaging screen was employed using combinatorial RNAi for 10 FA proteins. This revealed distinct FA proteins directly influence the segregation of adhesion sites, suggesting the modular assembly and function of adhesion sites. We identified three distinct modules: signaling, actin-regulatory and adhesion building-segregating module. Signaling proteins such as FAK and p130CAS as well as actin-regulatory proteins (VASP, α-actinin-1, zyxin) control the localization of tensin-1 in FA, which is the hallmark of FB. Structural proteins (kindlin-2, ILK and talin-1) modulate the translocation of tensin-1 from focal adhesion to FB. Notably the same set of proteins, were associated with specific modes of migration. Signaling and actin-regulatory module is linked to enhance cell migration (amoeboid and lamellipodial modes), whereas the adhesion building-segregating module is related to impaired migration (confined mode). Taken together, this study shows that FA are composed of different functional modules that distinctly control different stages of the adhesion transformation process and the cell migration behavior.2017-11-01T00:00:00ZEntwicklung von Inhibitoren für Lipoproteintransporterproteine, Hh-Coaktivatoren und einer γ-selektiven C-Ferrier-Umlagerung
http://hdl.handle.net/2003/36930
Title: Entwicklung von Inhibitoren für Lipoproteintransporterproteine, Hh-Coaktivatoren und einer γ-selektiven C-Ferrier-Umlagerung
Authors: Hofer, Walter
Abstract: Krebs zeichnet sich durch eine Fehlregulierung entscheidender Prozesse in der Zelle aus. Eine der prominentesten Vertreter, die zur Deregulierung als Onkogene für wichtige Zellfunktionen wie Proliferation, Zellzyklus und Migration beitragen können, sind die Src Tyrosin Kinasen (SFKs). Neben der Dephosphorylierung als aktivierendes Prinzip, ist auch eine Plasmamembranverankerung von entscheidender Bedeutung für die Aktivität der SFKs. Ein wichtiger Faktor hierbei spielt UNC119, das myristoylierte Proteine, unter die auch die SFKs fallen, in der Zelle transportiert. In dieser Arbeit wurde ein UNC119-Inhibitor entwickelt, mit dem der Einfluss der UNC119-Inhibition auf insbesondere Src gezeigt werden konnte. Desweiteren wurde dieser Inhibitor als dual-selektiv für UNC119 und PDEδ erkannt, wobei damit zum ersten Mal damit die Inhibition der Plasmamembranverankerung von myristoylierten und, im Falle von PDEδ, prenylierten Proteinen gleichzeitig untersucht werden konnte.
Im zweiten Teil wurde der Hedgehog-Signalweg untersucht. Dieser ist unter anderem involviert in die Regeneration von Gewebe. Hierbei würde ein Coaktivator für das Studium von Regenerationsprozessen sinnvoll sein. Es wurde ein Dipeptid mit drei Stereogenen Zentren identifiziert. Dieser und andere auf der Struktur basierenden Diastereomere/Derivate stellten sich jedoch als biologisch instabil heraus, da wahrscheinlich die stereogenen Zentren in der Zelle isomerisieren können.
Weiterhin wurde in dieser Dissertation eine γ-selektive, vinyloge C-Ferrier-Umlagerung optimiert. Hierbei wurden acetylierte Glucalderivate mit einem TBS-geschützten Dioxinon und Zinktriflat als Katalysator erfolgreich umgesetzt. Ebenso war eine Hochskalierung der Reaktion erfolgreich, womit sich diese Reaktion als robust auszeichnet.2018-01-01T00:00:00ZGenetically encoded conformational probes for small GTPase activity
http://hdl.handle.net/2003/36844
Title: Genetically encoded conformational probes for small GTPase activity
Authors: Brand, Simone
Abstract: Small GTPases are guanosine nucleotide binding enzymes that exist in two states, being active in the guanosine-triphosphate- (GTP) and inactive in the guanosine-diphosphate- (GDP) bound state. Thus, these proteins act as binary molecular switches, allowing signaling exclusively in the GTP-bound state and function in a variety of cellular signaling processes, including cytoskeleton organization, membrane trafficking, nuclear transport, cell survival and proliferation.
Due to their localization to different cellular compartments as well as their nucleotide- and localization-dependent activity, small GTPases are attractive targets for the development of biosensors. Recently, a new type of FRET-based sensors for small GTPase activity was developed. These conformational probes for small GTPase activity (COSGA) allow for the direct detection of conformational changes within the target protein and thereby determining the activity state of the small GTPase.
The work presented in this thesis focused on the development of a second generation of COSGA probes to facilitate the preparation process and the application for cellular studies. To genetically encode the sensor design, stop codon suppression technique and intracellular fluorescence labeling were used. The first part of this work focused on the development of a genetically encoded Rab1b probe to establish the second generation sensor, whereas the aim of the second part was to apply the sensor design to Rheb. At the present time, no effector protein has been reported for Rheb, hindering the development of conventional probes to monitor Rheb activity spatiotemporally. Due to its role as an activator of mTORC1, a master regulator for cell metabolism, growth and proliferation, Rheb is a particularly interesting target. This work demonstrates the establishment of a genetically encoded Rheb sensor using the previously described conformational sensor design. This Rheb sensor allows visualization of spatiotemporal Rheb activity in living cells.2018-01-01T00:00:00ZSpatial distributed phosphatome determines EGFR phosphorylation response
http://hdl.handle.net/2003/36833
Title: Spatial distributed phosphatome determines EGFR phosphorylation response
Authors: Mhamane, Amit
Abstract: Autocatalytic activation of Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) at the plasma membrane increases the sensitivity of the cell to extracellular growth factors but can also generate spontaneous receptor activation in the absence of stimulation. As a mechanism to control EGFR phosphorylation at the plasma membrane, receptor endocytosis and vesicular trafficking relocalizes activated, phosphorylated EGFR to perinuclear compartments rich in Protein Tyrosine Phosphatases (PTPs), such as PTPN1, which dephosphorylate and inactivate the receptor. Although the role of few PTPs in regulating EGFR phosphorylation is known, it is unclear how PTPs that are spatially segregated in distinct cellular compartments, modulate EGFR autocatalytic activation and hence its downstream signaling. Through quantitative imaging of EGFR phosphorylation upon genetic perturbations of classical PTPs and EGFR-PTP interactions, we identified endoplasmic reticulum (ER) associated PTPN2 and plasma membrane associated receptor-like PTPRG/J as strong, direct negative regulators of EGFR. Using single cell measurements of phosphorylation of the EGFR downstream signaling tyrosine residue Y1068, we generated a spatial-temporal reactivity map to identify local phosphatase activity. By negatively regulating EGFR phosphorylation, we deduced the role of PTPN2/PTPRJ in determining signal duration: a function that is coupled to vesicular trafficking. Furthermore, by maintaining the plasma membrane density of EGFR due to its interaction with ligandless EGFR and dephosphorylation of EGFR at Y1045 - a cCbl-ubiquitin ligase binding site, PTPN2 participates in a spatially established negative-feedback that is mediated by vesicular recycling. Through its activity on ligandless EGFR at plasma membrane, PTPRG regulates the autocatalytic activity of EGFR and influences the responsiveness of a cell to EGF dose. Altogether our findings indicate that by spatially segregating PTPs with different functional relationships to EGFR, the cell is able to sense and respond to its environment.2017-01-01T00:00:00ZDynamic regulation of autocatalytic EGFR activation
http://hdl.handle.net/2003/36797
Title: Dynamic regulation of autocatalytic EGFR activation
Authors: Baumdick, Martin
Abstract: The dynamics of epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling emerge from its recursive interactions with protein tyrosine phosphatases (PTPs) and autocatalytic receptor activation thereby determining cellular behavior including proliferation, migration and differentiation. The autocatalytic activation of EGFR causes an amplification of EGFR phosphorylation in response to extracellular signals, but its trade-off is spontaneous activation at high receptor densities even in the absence of ligand. Structural and molecular dynamics studies identified an allosteric activation mechanism upon EGF-induced receptor activation, but the molecular basis of autocatalytic EGFR activation remains unclear. To better understand autocatalysis we developed a Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-based, conformational EGFR indicator (CONEGI) using genetic code expansion to monitor the conformational state of the tyrosine kinase domain (TKD) in living cells and relate it to EGFR activity. We show that EGFR monomers can adopt an active conformation that is stabilized upon Y845 phosphorylation. Since Y845 is an auto-phosphorylation site this creates a positive feedback loop generating an autocatalytic amplification mechanism. To counteract autonomous, autocatalytic EGFR activation in the absence of ligand, intrinsic and extrinsic safeguard mechanisms are required. Intrinsic auto-inhibitory structural features can be overcome by thermal conformational fluctuations allowing a sub-population of EGFR to adopt an active conformation. This autonomous, autocatalytic EGFR activity is counterbalanced by a spatial cycle that suppresses phosphorylation of Y845 on EGFR monomers by vesicular recycling through perinuclear areas with high PTP1B activity. EGF-binding induces receptor dimerization and phosphorylation of the c-Cbl docking Y1045 leading to receptor ubiquitination that targets EGFR for degradation in lysosomes. The re-routing regulates EGFR signaling response by the transit-time to late endosomes where it is switched-off by high PTP1B activity. This ubiquitin-mediated switch from a suppressive cycle to a unidirectional trafficking mode is a uniquely suited solution to suppress spontaneous activation while maintaining responsiveness to EGF.2017-01-01T00:00:00ZInvestigation of the properties of Acyl protein thioesterases and their role in Ras depalmitoylation
http://hdl.handle.net/2003/36355
Title: Investigation of the properties of Acyl protein thioesterases and their role in Ras depalmitoylation
Authors: Baumeister, Stefan
Abstract: Es konnte gezeigt werden, dass die Inhibition des Proteins Acyl Protein Thioesterase (APT) die Lokalisierung von palmitoylierten Ras Proteinen derart verändern kann, dass eine Reduzierung der onkogenen Ras Aktivität beobachtet wird. Die genaue physiologische Rolle von APT ist allerdings weiterhin unklar, da sowohl weitere palmitoylierte Proteine, als auch (Lyso-) Phospholipide und Prostaglandin Glycerin Ester als Substrate von APT beschrieben wurden.
Die hier vorliegende Arbeit liefert, durch Untersuchung der Interaktionen verschiedener Substrate, Liganden und Inhibitoren mit APT, neue Erkenntnisse bezüglich möglicher zellulärer Aufgaben von APT. Die gewonnenen Resultate helfen zu bestimmen, welche Substrate von APT bevorzugt werden, wie eine Substratspezifität erreicht wird und wie sich APT im Laufe der Evolution in verschiedenen eukaryotischen Spezies entwickelt hat.; It was shown that inhibition of the activity of Acyl Protein Thioesterase (APT) proteins by palmostatin B could change the localization of the palmitoylated oncogene Ras and lead to a down-regulation of Ras signaling. Besides this particular activity of APT several other protein targets of APT were described, some of them as specific substrates for one of the two isoforms. Furthermore, APT activity was also linked to non-protein substrates like (lyso-)phospholipids and prostaglandin glycerol esters. Still, the real physiological function of the conserved and ubiquitously expressed APT proteins remains elusive.
This thesis provides new insights into possible physiological roles of APT and its isoforms by focusing on the interaction of different substrates, ligands and inhibitors with APT proteins. The results help to answer the question what kind of substrates APT prefers, how substrate specificity is achieved and how APTs might have evolved in the different eukaryotic species.2017-01-01T00:00:00ZFluoreszenzbasierte Analyse von RNA-Protein-Interaktionen
http://hdl.handle.net/2003/36334
Title: Fluoreszenzbasierte Analyse von RNA-Protein-Interaktionen
Authors: Roszyk, Laura2017-01-01T00:00:00ZEvaluierung der Lipidmuster S-acylierter Proteine und Azido-Ceramid Derivate zur proteomweiten Identifizierung neuer C16- Ceramid bindender Proteine
http://hdl.handle.net/2003/36333
Title: Evaluierung der Lipidmuster S-acylierter Proteine und Azido-Ceramid Derivate zur proteomweiten Identifizierung neuer C16- Ceramid bindender Proteine
Authors: Schulte-Zweckel, Janine
Abstract: Part 01: A Bioorthogonal Probe for Quantitative Profiling of Protein S-Acylation We have developed a chemical probe that enables the accurate and systematic identification of Sbound fatty acids. The analysis of the S-acylome in different cell lines as well as in an enriched N-Ras revealed that proteins are modified with fatty acids of various chain lengths and structures. These previously overlooked fatty acid modifications may have a key role in regulating protein localization and function. Hence, atomic force microscopy studies and FRET-based kinetics assays indicated that the unsaturated N-Ras presents an increased tendency toward clustering and higher insertion kinetic rate constants compared to that of its saturated counterpart. The technique could be also applied to investigate the role of CLN3 as a potential fatty acid desaturase. Indeed, overexpression of CLN3 results in all the cases in a significant increase in C16:1 levels. This effect was most marked for N-Ras compared to the whole S-acylome, which it may be explained by the substrate specificity of CLN3 or its particular subcellular localization. We are convinced that the developed methodology may strongly contribute to a better understanding of S-acylated proteins. Part 02: Azido-tagged Sphingolipids for the proteome-wide identification of novel C16-ceramidebinding proteins To generate a candidate list of ceramide-interacting proteins we applied two methods, a mass spectrometry-based proteomic approach and a proteome microarray. 214 and 127 protein candidates were identified respectively, and 24 were found in both data sets. We initially chose potential candidates for testing on the basis of its potential implication in ceramide-mediated pathways. Binding could be confirmed for: AIFm2, APP, BUD31, Gal-1 and Gal-3, mTOR and PPT1. The specificity of those proteins for ceramide species with different chain lengths has been also analysed using a pull-down and a competition assay, observing a dose-dependent decrease in the interaction of the lipid with the studied proteins. To further validate the binding of ceramide to the identified proteins we employed a cellular thermal shift assay. Treatment of cell lysates with C16-Cer resulted in a slighter stabilization of APP, BUD31 and PPT1 and an appreciable increase of melting point temperatures for the other investigated proteins. Finally, the direct interaction of C16-Cer was investigated in vitro using a DSF and recombinantly expressed proteins. AIFm2, BcL-xL, Gal-1 were selected and direct interaction with variable affinities could be proved in all the cases, whereas no binding could be observed when AIFm2 and Gal-1 were titrated with increasing concentrations of palmitic acid, or when C-16-Cer was tested against Son of Sevenless (SOS) protein as a negative control. Future experiments will be required to elucidate how ceramide binding affects protein activity, if it relies on the modulation of protein localization such as the targeting of LC3B to mitochondria, or if, in turn, it directly regulates protein function such as the activation of the protein phosphatase PP2A.2017-01-01T00:00:00ZMechanistic studies of Rab GTPase membrane targeting and cycling in cells
http://hdl.handle.net/2003/36331
Title: Mechanistic studies of Rab GTPase membrane targeting and cycling in cells
Authors: Li, Fu2017-01-01T00:00:00ZSmall molecule inhibition of lipidated proteins/cargo interaction and synthesis of a cinchona alkaloid-derived library as potent autophagy inhibitors
http://hdl.handle.net/2003/36314
Title: Small molecule inhibition of lipidated proteins/cargo interaction and synthesis of a cinchona alkaloid-derived library as potent autophagy inhibitors
Authors: Garivet, Guillaume2017-01-01T00:00:00ZThe effect of oncogenic HRas on the RTK-PTP reaction network
http://hdl.handle.net/2003/36195
Title: The effect of oncogenic HRas on the RTK-PTP reaction network
Authors: Stockert, Rabea2017-01-01T00:00:00ZDiscovery and target identification of small molecule autophagy inhibitors
http://hdl.handle.net/2003/36095
Title: Discovery and target identification of small molecule autophagy inhibitors
Authors: Robke, Lucas
Abstract: Pharmacologically active substances have been applied in medicine for at least 5300 years.Ever since, mankind has tried to enlarge the assortment of bio-active substances, in order to fight diseases and ultimately maintain health and quality of life. For thousands of years, but especially in the last century, drug discovery has been the scientific key driver for the progression of medicine.
One process that attracts notable attention due to its high potential for the development of new drugs is autophagy. Autophagy is a catabolic process which plays a crucial role in the development, differentiation, homeostasis and survival of cells. It mediates the degradation of cellular components especially under conditions such as starvation, and the misregulation of autophagy is implicated in various diseases, ranging from cancer to microbial infections and neurodegenerative diseases.
Small organic molecules still account for 90% of today’s pharmaceuticals and drug-like modulators of biological processes have proven to be valuable reagents and tools for chemical biology. However, to date only a few modulators of autophagy have been reported. Therefore the goal of this work was to identify and characterize new autophagy inhibitors. A cell-based assay was performed to identify inhibitors of autophagic flux. Based on hits from the cellular assay compound libraries were synthesized to provide information regarding structure-activity relationships. The identification of the targets of the inhibitors was achieved through affinity chromatography, mechanistic reasoning and the process of elimination. The examination of the targets’ roles in autophagy enlarged our understanding of the autophagic process and allowed us to evaluate their potential as new drug targets. Ultimately, the identified and characterized novel chemotypes for autophagy inhibition provide valuable tools to study their target protein’s function as well as the autophagic process more precisely. They can furthermore provide promising starting points for drug discovery focusing on cancer.2017-01-01T00:00:00ZKnock off and on: a novel approach to autophagy modulation
http://hdl.handle.net/2003/36093
Title: Knock off and on: a novel approach to autophagy modulation
Authors: Klewer, Laura Kristin2017-01-01T00:00:00ZIdentification and biological characterization of indoline-based autophagy inhibitors
http://hdl.handle.net/2003/36091
Title: Identification and biological characterization of indoline-based autophagy inhibitors
Authors: Rummelt, Marjorie A.
Abstract: Autophagy is a vital catabolic process involved in the degradation of cellular components, which plays an important role in cancer and neurodegenerative disorders. Due to their high complexity, the pathways regulating autophagy have not been fully elucidated. The development of specific autophagy modulators and the identification of their cellular targets can provide valuable insight into the regulation of this process and, ultimately, its role in disease.
Herein, a potent inhibitor of starvation-induced autophagy (IC50 = 520 +- 550 nM) was identified using a phenotypic screen. In a series of secondary assays, the compound was validated as an autophagy inhibitor. The structure–activity relationship for this compound class was derived from a synthesized compound collection of structural analogs and used for the preparation of a chemical probe for affinity-based proteomics ("pull-down"). Glutamate dehydrogenase (GDH) and calpain-1 were isolated by means of affinity-based proteomics but devalidated as targets of the inhibitor in various biophysical and biochemical assays. The ATP-gated ionotropic receptor P2X4 and the Ragulator component LAMTOR5 were the most promising targets determined by thermal proteome profiling and are currently under evaluation.Targets predicted using a computational approach based on chemical similarity included 5-hydroxytryptamine (5-HT) receptors and multiple kinases—rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF1) and related kinases, pyruvate kinase (PK), and abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1 (ABL1). Whereas no modulating effect on the predicted kinases was observed, the autophagy inhibitor was a potent antagonist of the G-protein-coupled serotonin receptor 5-HT6 (IC50 = 1 µM). However, as known antagonists of the receptor did not inhibit autophagy, 5-HT6 was considered an off-target. Given the strong antagonistic effect seen, G-protein-coupled receptors need to be further evaluated as potential targets of the identified inhibitor. The successful target identification of this potent inhibitor could help deliver further understanding of the complex mechanisms that regulate autophagy.; Autophagie ist ein lebensnotwendiger katabolischer Prozess, der am Abbau zellulärer Komponenten beteiligt ist und eine wichtige Rolle bei Krebs und neurodegenerativen Krankheiten spielt. Aufgrund der hohen Komplexität der Autophagie-regulierenden Signalwege konnten diese noch nicht vollständig entschlüsselt werden. Die Entwicklung spezifischer Autophagie-Modulatoren und die Identifizierung ihrer zellulären Zielproteine können einen wertvollen Einblick in die Regulierung von Autophagie und letztendlich ihre Rolle in Krankheiten gewähren.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde mittels phänotypischem Screening ein potenter Inhibitor von durch Aushungern induzierter Autophagie identifiziert (IC50 = 520 +- 550 nM). In einer Reihe sekundärer Assays wurde diese Verbindung als echter Autophagie-Inhibitor validiert. Die Struktur-Aktivitätsbeziehung für diese Verbindungsklasse wurde aus einer hergestellten Substanzkollektion abgeleitet, anhand derer eine chemische Sonde synthetisiert wurde. Glutamatdehydrogenase (GDH) und Calpain-1 wurden durch Affinitätschromatographie isoliert, allerdings anschließend in verschiedenen biophysikalischen und biochemischen Assays als Zielproteine des Autophagie-Inhibitors devalidiert. Mittels thermischem Proteomprofiling wurden der ATP-abhängige Ionenkanal P2X4 und die Ragulator-Komponente LAMTOR5 als vielversprechendste Zielproteine identifiziert und werden derzeit untersucht.
5-Hydroxytryptaminrezeptoren und mehrere Kinasen—rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF1) und verwandte Kinasen, Pyruvatkinase (PK) und abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1 (ABL1)—waren unter den Zielproteinen, die durch rechnergestützte Ansätze anhand von strukturellen Ähnlichkeiten vorausgesagt wurden. Während kein Effekt auf die PK beobachtet wurde, war der Autophagie-Inhibitor ein potenter Antagonist des G-Protein-gekoppelten Serotoninrezeptors 5-HT6 (IC50 = 1 µM). Da allerdings bekannte Antagonisten dieses Rezeptors Autophagie nicht inhibierten, wurde 5-HT6 als „Off-Target“ bezeichnet. Angesichts des beobachteten starken antagonistischen Effekts, müssen G-Protein-gekoppelte Rezeptoren genauer als mögliche Zielproteine des identifizierten Inhibitors untersucht werden. Die erfolgreiche Identifizierung des Zielproteins dieses Inhibitors könnte dazu beitragen, weitere Einsicht in die komplexen Autophagie-regulierenden Mechanismen zu ermöglichen2017-01-01T00:00:00ZIdentifizierung und Charakterisierung neurotropher Naturstoffderivate und kovalenter Kinesininhibitoren
http://hdl.handle.net/2003/36042
Title: Identifizierung und Charakterisierung neurotropher Naturstoffderivate und kovalenter Kinesininhibitoren
Authors: Förster, Tim
Abstract: Die Neugestaltung des neuronalen Netzwerkes ist essentiell für die Wiederherstellung der physiologischen Funktionen nach neuronaler Schädigung, weshalb die Erforschung neuartiger Therapeutika mit neurotrophen Eigenschaften von großer Bedeutung ist. In dieser Arbeit wurde ein Testsystem zur Identifizierung neuromodulatorischer Substanzen in der Neuroblastomzelllinie SH-SY5Y entwickelt. Durch Anwendung dieses Testsystems konnten neurotrophe Verbindungen auf Basis der Naturstoffe Militarinon A und (Iso-) Rhynchophyllin identifiziert werden. Da über die Wirkmechanismen neuroaktiver Pyridonalkaloide bisher wenig bekannt ist, geben die Ergebnisse neue Einblicke in die modulierten Prozesse von biologisch aktiven Vertretern dieser Substanzklasse. Ebenso konnten durch die neurotrophen Indolalkaloide weitere Erkenntnisse in Hinblick auf die neuropharmakologischen Eigenschaften dieser Moleküle gewonnen werden. Das Kinesin HSET gilt als vielversprechendes Zielprotein bei der Erforschung neuartiger Wirkstoffe zur Behandlung von Krebserkrankungen. HSET besitzt eine essentielle Funktion bei der zentrosomalen Gruppierung in Tumorzellen mit amplifizierten Zentrosomen, während in gesunden Zellen funktionell dominante Zentrosomen vorhanden sind. Daher besitzen Inhibitoren dieses Kinesins das Potential, spezifisch Tumorzellen zu attackieren. In dieser Arbeit wurde ein Sulfonylpyrimidin als erster kovalenter HSET-Inhibitor identifiziert, der weitere Möglichkeiten zur Entwicklung von Therapeutika gegen Tumorzellen mit amplifizierten Zentrosomen eröffnet.2017-01-01T00:00:00ZZellgängige Peptide zur Inhibition des Wnt/β-Catenin Signalweges
http://hdl.handle.net/2003/36038
Title: Zellgängige Peptide zur Inhibition des Wnt/β-Catenin Signalweges
Authors: Dietrich, Laura
Abstract: Der Wnt/β-Catenin Signalweg kontrolliert fundamentale Prozesse der Embryonalentwicklung sowie die Homöostase im adulten Gewebe. Fehlregulation durch konstitutive Aktivierung resultiert in übermäßiger Proliferation und fördert die Entstehung von Krebs. Die Inhibition des Signalweges ist sehr anspruchsvoll, da dieser durch Protein-Protein-Interaktionen (PPIs) reguliert wird, die nur schwer mit niedermolekularen Verbindungen moduliert werden können. Peptide weisen gute Bindungseigenschaften für flache und ausgedehnte Interaktionsflächen auf und bilden die Grundlage neuartiger Strategien zur Adressierung von PPIs. In dieser Arbeit wurde eine Strategie zur Optimierung der Bioverfügbarkeit eines stapled peptides zur Inhibition der β-Catenin/TCF-Interaktion entwickelt. Aus der vergleichenden Analyse mit bekannten zellgängigen Peptiden und stapled peptides wurde durch feine Nuancierung von Hydrophobizität, Nettoladung und Ladungsverteilung NLS StAx h erhalten. NLS StAx h inhibiert sowohl selektiv die Interaktion zwischen β Catenin und TCF, als auch spezifisch die Proliferation und Migration von Darmkrebszellen. In einem ex vivo Darmkrebsmodell wurde außerdem nachgewiesen, dass die mit Darmkrebs assoziierte abnormale Genexpression auf das Basallevel reduziert wurde. NLS-StAx-h ist damit die erste Verbindung, die eine gute zelluläre Aufnahme mit einer effizienten Hemmung der β-Catenin/TCF-Wechselwirkung kombiniert.2017-01-01T00:00:00ZIdentifizierung neuer PDE6D-Bindungspartner und Entwicklung eines phänotypischen Screens zur Identifizierung biologisch aktiver Indolochinolizine
http://hdl.handle.net/2003/36019
Title: Identifizierung neuer PDE6D-Bindungspartner und Entwicklung eines phänotypischen Screens zur Identifizierung biologisch aktiver Indolochinolizine
Authors: Küchler, Philipp Robert Felix
Abstract: Die Protein-Prenylierung ist eine posttranslationale Modifikation, die die Affinität von Proteinen gegenüber biologischen Membranen erhöht und Protein-Protein-Interaktionen (PPI) vermitteln kann. Das molekulare Chaperon PDE6D (Retinal rod rhodopsin-sensitive cGMP 3',5'-cyclic phosphodiesterase subunit delta) ist sowohl für die korrekte Membranlokalisation prenylierter kleiner GTPasen als auch für deren Solubilisierung im wässrigen Milieu des Zytosols verantwortlich. Für das farnesylierte Protoonkogen KRAS konnte ein PDE6D-abhängiger Transport an die Plasmamembran gezeigt werden. Die spezifische Inhibition dieser Interaktion mittels niedermolekularer Verbindungen führt zur Relokalisation von KRAS an das Endomembransystem, einhergehend mit einer verringerten Aktivierung des MAPK/ERK-Signalwegs und einer Wachstumsinhibition von KRAS-abhängigen Pankreastumorzellen. Aufgrund des Missverhältnisses zwischen der Größe des humanen Prenyloms (ca. 100 – 500 Proteine) und der Anzahl bekannter PDE6D-Bindungspartner wurde innerhalb dieser Arbeit eine affinitätschromatographische Strategie mit anschließender massenspektrometrischer Analyse entwickelt, mit deren Hilfe neue, bisher unbekannte prenylabhängige Bindungspartner PDE6Ds identifiziert werden konnten. Als neue Interaktoren konnten die RHO-GTPase CDC42, die kleine GTPase RAB23 sowie die Phosphodiesterase CNP nachgewiesen werden. Die Wechselwirkung mit allen drei Proteinen konnte durch Verwendung der PDE6D-Inhibitoren Deltarasin und Deltazinone 1 gestört und die Auswirkungen auf die subzelluläre Lokalisation der Proteine in Zellen untersucht werden. Weiterhin konnte als neuer Interaktor PDE6Ds die permanent farnesylierte Lamin A-Mutante Progerin identifiziert werden. Die seltene genetische Störung Hutchinson-Gilford Progeria Syndrom (HGPS) wird in ca. 90% der Fälle durch eine heterozygote de novo Mutation hervorgerufen, die in der Folge zur Expression des dominant negativen Genprodukts Progerin führt. Ursächlich für den durch die Progerinexpression hervorgerufenen Phänotyp ist die im Unterschied zum Wildtyp-Protein permanente Farnesylierung, die Auswirkungen auf die Morphologie und Integrität des Zellkerns hat. Durch die Untersuchung von Prenylierungsmutanten konnte die prenylabhängige Interaktion zwischen Progerin und PDE6D sowohl in Zelllysat als auch – mittels PLA-Technologie (proximity ligation assay) – in Zellen nachgewiesen werden. Weiterhin konnte die Progerin-PDE6D-Interaktion durch Deltarasin und Deltazinone 1 inhibiert werden. Neben den Auswirkungen einer Störung dieser Interaktion mittels niedermolekularer Verbindungen wird in der vorliegenden Arbeit auch die Bindungsspezifität PDE6Ds gegenüber prenylierten Cargoproteinen unter Berücksichtigung der hier erhaltenen Ergebnisse diskutiert. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Identifikation biologisch aktiver Naturstoffderivate, die humane Zellen während der Zellteilung arretieren. Die Akkumulation von Mutationen in Krebszellen führt zu unplanmäßigen Teilungsvorgängen und genomischer Instabilität. Diverse therapeutische Strategien zur Adressierung des Zellzyklus in Krebszellen wurden bereits untersucht. Viele dieser Strategien konnten jedoch nicht den gewünschten therapeutischen Erfolg einhergehend mit geringen zytotoxischen Effekten auf gesunde Zellen erreichen. Die Wirkungsweise der meisten Zellzyklus-adressierenden Substanzen beruht dabei auf der Aktivierung des Spindelkontrollpunkts (SAC, spindle assembly checkpoint). Die chronische Aktivierung des Kontrollpunkts und die damit einhergehende Arretierung der Zelle in der Metaphase durch chemische Agenzien bestimmt dabei zwei mögliche Schicksale für die Zelle; Entweder die Zelle teilt sich trotz aktiviertem Kontrollpunkt in Tochterzellen in einem Vorgang, der als „mitotic slippage“ bezeichnet wird und eventuelle Aneuploidien zur Folge haben kann, oder die Zelle stirbt einen apoptotischen Zelltod während der Mitose. Innerhalb der Abteilung „Chemische Biologie“ (MPI Dortmund) wurde mithilfe eines vorwärts gerichteten chemisch-genetischen Ansatzes das biologisch aktive Indolochinolizin Centrocountin-1 entwickelt, das über Interaktion mit den Zielproteinen Nucleophosmin (NPM) und Exportin-1 (CRM1) zu einer Aktivierung des Spindelkontrollpunkts und einem vermehrten apoptotischen Zelltod führt. In dieser Arbeit konnte ein zellbasierter phänotypischer Screen entwickelt werden, der zur Identifizierung neuer aktiver Centrocountin—1-Derivate verwendet wurde. Mittels automatischer Mikroskopie und anschließender Quantifizierung der gewonnenen Bilddaten konnte aus einer kleinen Bibliothek an Centrocountin-Derivaten das Pyridoisochinolizin a528 als potenteste Substanz identifiziert werden. Folgeversuche zeigten eine zweifache Erhöhung des mitotischen Index im Vergleich zu Centrocountin-1 und stärkere Auswirkungen auf die Proliferation von HeLa-Zellen als die Ursprungssubstanz. Des Weiteren wurde im Rahmen dieser Arbeit der Wirkmechanismus der Centrocountine weiter erörtert. Aufgrund der diversen Funktionen von NPM hinsichtlich Chaperonaktivität, DNA-Reparatur, Ribosomenbiogenese und Zentrosomen-Integrität ergeben sich verschiedene Möglichkeiten eines Einflusses von Centrocountin-1. In diesem Zusammenhang konnte neben einem Einfluss von Centrocountin-1 auf die Oligomerisierung von NPM auch die aus RNAi-Studien bekannte Häufung von DNA-Schäden in NPM-defizienten Zellen ausgeschlossen werden. Störungen des CRM1-abhängigen Transports von FOXO3 bestätigen vorherige Ergebnisse zu einem Einfluss von Centrocountin-1 auf den Kernexportfaktor CRM1. In dieser Arbeit werden die gewonnenen Ergebnisse in Hinblick auf den potentiellen Wirkmechanismus der Centrocountine diskutiert.2017-01-01T00:00:00ZSystems analysis of the spatial regulation of oncogenic Ras signalling
http://hdl.handle.net/2003/36018
Title: Systems analysis of the spatial regulation of oncogenic Ras signalling
Authors: Heinelt, Kaatje Friederike
Abstract: Ras (Rat sarcoma) isoforms are small GTP-binding proteins that play a major role in the signalling networks controlling cell growth and survival. The Kras isoform is of particular interest as in many severe kinds of cancer the presence of oncogenic Kras mutations is associated with a poor prognosis. Kras is associated with the plasma membrane due to its farnesyl moiety and a polybasic motif and functions as a signalling hub. If Kras gets lost from the plasma membrane due to spontaneous dissociation or endocytosis, it will equilibrate over the extensive endomembrane system inside the cell. With Kras no longer present at the plasma membrane, its activation and the following activation of subsequent pathways can no longer take place. However, to remain on the plasma membrane, Kras has to be constantly enriched there. This enrichment must be actively maintained in the cell by an energy-driven mechanism involving the solubilising factor PDEδ. Consequently, inhibition or down-modulation of PDEδ results in mislocalisation of Kras, making PDEδ an interesting target for anti-cancer drug development. In 2013 a small molecule, Deltarasin, was identified as a potent inhibitor of PDEδ causing a redistribution of Kras from the plasma membrane towards endomembranes when applied to cells. This work investigates whether small molecule PDEδ inhibitors such as Deltarasin affect (K) Ras localization in space and time. It demonstrates that PDEδ inhibition causes Ras relocalisation from the plasma membrane towards the endomembranes in different human cancer cell lines and in murine small intestine organoids, which express endogenous levels of oncogenic Kras. Nonetheless, it has been shown that Deltarasin has certain side effects, e.g. it becomes cytotoxic at higher concentrations. Hence, a new PDEδ inhibitor, Deltazinone 1, which is supposed to be less cytotoxic in comparison to Deltarasin, was synthesized. In order to determine whether it represents a viable alternative to Deltarasin, its ability to relocalise Kras in a panel of cancer cell lines was tested and it was indeed possible to mislocalise Kras with this inhibitor in Kras-dependent PancTuI cells. Deltazinone 1 and Deltarasin both had a demonstrable effect on cell growth/survival, respectively. In this way it appears that PDEδ constitutes a valid target for the pharmacological therapy of Kras-dependent tumours. This work demonstrates that two specific PDEδ inhibitors with completely different lead structures are capable of mislocalising Kras to endomembranes. In sum, it demonstrates that the availability of PDEδ is essential to ensure (K) Ras localization at the plasma membrane in Kras-dependent cancer cells and thus that the survival of those cells are ultimately dependent on PDEδ.2017-01-01T00:00:00ZSpatial-temporal regulation of EGFR phosporylation by protein tyrosine phosphatases
http://hdl.handle.net/2003/36007
Title: Spatial-temporal regulation of EGFR phosporylation by protein tyrosine phosphatases
Authors: Fengler, Sven
Abstract: The activity of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and its interactions with protein tyrosine phosphatases (PTPs) is what determines growth factor signaling. Due to its intrinsic autocatalytic properties, EGFR can undergo autonomous ligand independent activation. EGFR in this case, cycles between the plasma membrane (PM) and recycling endosomes where PTPs dephosphorylate the receptor to avoid spurious receptor signals. EGF-induced receptor dimerization results in a robust trans-phosphorylation of tyrosine residues that allows stable binding of signaling effectors. The majority of EGFR at the PM is internalized and undergoes degradation in lysosomal compartment. After internalization, the EGFR encounters PTPs at different cellular locations, which thereby regulate the signal duration of the receptor. Moreover, specific dephosphorylation of phosphotyrosines that are required for ubiquitin ligase (Cbl) binding reduces the receptor ubiquitylation and thereby its degradation rate. Due to their dephosphorylation activity, PTPs were thought as negative regulators of RTK signalling, but it has been shown that PTPs also promote receptor phosphorylation by activating cytosolic kinases that in turn phosphorylate RTKs (Julien et al., 2011). To understand the spatial-temporal regulation of EGFR phosphorylation by PTPs, we used CA-FLIM (Grecco et al., 2010). This method allowed us to quantify the phosphorylated fraction of EGFR in cells, upon perturbation of PTP expression by siRNAs or cDNAs. Upon opposing perturbations, we identified several PTPs that have indicated either a negative or positive effect on EGFR phosphorylation. Classification of the temporal phosphorylation profiles of EGFR discovered 5 functional groups of PTPs acting at early and/or late time points after EGF stimulation. PTPs within each group showed differences in their regulatory influence highlighting individual impact in EGF signaling. Predominantly cytosolic PTPs regulated early EGFR phosphorylation, whereas receptor-like PTPs (RPTPs) induced a transient response profile. Analysis of the spatial-temporal phosphorylation profile of EGFR upon PTPRA, PTPN1 or PTPN2 expression showed an almost abolished axial phosphorylation of EGFR that might promote receptor recycling. In contrast, we identified a positive regulatory function of MTM1, DUSP7 and PTPN21 that was further validated using multi-parametric single cell information. These PTPs induced an early amplification of receptor phosphorylation near the PM. Our results strongly suggest that MTM1 and PTPN21 inhibit the degradation pathway and thereby enhancing the phosphorylated fraction of internalized EGFR. In summary, the presented work provides novel insights about when and where PTPs regulate EGFR phosphorylation and how this could affect cellular responses.2017-01-01T00:00:00ZFluorescent sensors for the small GTPase switch
http://hdl.handle.net/2003/35959
Title: Fluorescent sensors for the small GTPase switch
Authors: Voß, Stephanie
Abstract: Kleine GTPasen regulieren eine Vielzahl an hoch dynamischen Prozessen, welche von Signaltransduktion und Cytoskelettorganisation bis zum nuklearen und vesikulären Transport reichen. Sie erfüllen ihre regulatorische Rolle indem Sie als molekulare Schalter agieren, die zwischen einer aktiven, GTP-gebunden Form und einer inaktiven, GDP-gebundenen Form hin- und herwechseln. Der Wechsel zwischen der aktiven und der inaktiven Form geht mit einer Konformationsänderung der Proteinstruktur einher und wird durch GTPase-aktivierende Proteine (GAPs) und Guaninnukleotidaustauschfaktoren (GEFs) gesteuert. Zudem weisen die meisten GTPasen eine charakteristische subzelluläre Lokalisation auf und zirkulieren zwischen verschiedenen Zellkompartimenten.
Aufgrund ihrer Schlüsselrolle in komplexen zellulären Vorgängen sind GTPasen ein beliebtes Ziel für die Entwicklung von Biosensoren, die einen Einblick in die zeitlichen und räumlichen Aspekte ihrer Aktivität ermöglichen. Die meisten der bisher etablieren Sensoren basieren auf der spezifischen Bindung einer modifizierten Effektordomäne an die aktivierte GTPase. Ein Nachteil dieser Strategie ist, dass zunächst für jede GTPase eine passende Effektordomäne identifiziert und optimiert werden muss und daher einmal etablierte Sensoren nicht einfach auf andere GTPasen übertragen werden können. Zudem erfordern konventionelle Sensorkonstrukte häufig die Modifikation der Proteintermini, was die native Lokalisation der GTPase beeinträchtigen kann.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein neuartiger Ansatz zur Entwicklung von GTPase-Sensoren verfolgt, der auf alle GTPasen übertragbar ist und nur eine minimale Modifikation der Proteine erfordert. Der Sensor basiert auf einem intramolekularen Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) Paar, das es ermöglicht die Konformationsänderung der GTPase im Zuge des Nukleotidaustausches direkt auszulesen. Das Sensordesign wurde zunächst auf Rab1 und später auf KRas angewandt.
Der Erhalt der nativen Funktionalität von Rab1 im Sensorkonstrukt wurde zunächst durch die eingehende Charakterisierung der Interaktion mit dem GEF DrrA, dem GAP TBC1D20 und den Effektorproteinen OCRL und LidA überprüft. Anschließend wurde in Zellstudien der Anteil an aktivem Rab1 im Cytoplasma und am Golgi quantifiziert. Der für KRas entwickelte Sensor offenbarte ein polarisiertes Aktivitätsprofil von KRas in COS7 Zellen mit geringerer Aktivität an der freien Zellkante. Zudem zeigte der KRas Sensor, dass EGF Stimulation zu einem globalen Anstieg der intrazellulären KRas-Aktivität führt.
Ergänzend wurde der dynamische Austausch von Rab1 zwischen Cytoplasma und Golgi durch Fluorescence Recovery after Photobleaching (FRAP)-Studien und Experimente mit photoaktivierbarem GFP quantifiziert. Die Versuche weisen darauf hin, dass der Übergang von Rab1 zwischen Cytoplasma und Golgimembran eng mit der Fähigkeit verknüpft ist zwischen aktivem und inaktivem Zustand zu wechseln.; Small GTPases regulate a variety of highly dynamic biological processes ranging from signal transduction, cytoskeleton rearrangement and gene expression to nuclear and vesicular transport. They exert their regulatory role by acting as molecular switches, cycling between an active GTP-bound and an inactive GDP bound form. The switching between the active and the inactive state involves distinct conformational changes in the GTPase structure and is tightly regulated by guanine nucleotide exchange factors (GEFs) and GTPase-activating proteins (GAPs). Most small GTPases exhibit a characteristic subcellular localization and cycle between different cellular compartments. This spatial cycle constitutes an additional level of regulation.
Due to their key role in highly dynamic processes, GTPases have been a popular target for the development of biosensors that provide insight into the spatiotemporal aspects of their functioning. Most GTPase sensors rely on an indirect signal read out, generated through binding of an engineered effector domain to the activated, GTP-bound GTPase. However, the versatility of this approach is limited. It requires a suitable effector domain, which has to be identified and optimized for each target GTPase. Moreover, these conventional sensor designs often involve modification of the protein’s termini, affecting native GTPase functioning and localization.
In the course of this thesis a new GTPase activation sensor that avoids the aforementioned drawbacks of conventional designs was established. By employing Förster energy transfer (FRET) between a N-terminal fluorescent protein and an organic dye, the intrinsic conformational change of the GTPase-fold can be used as the primary indicator for GTPase activation. The sensor design was first applied to Rab1 and later extended to KRas.
Retained native behavior and sensitivity of Rab1 in the sensor constructs was assessed by monitoring their interaction with GEFs, GAPs and effector proteins. In cellular studies, using fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), the ratio of active to inactive Rab1 in the cytoplasm and on the Golgi was quantified. Rab1 was found to be mostly active in the cytoplasm and largely inactive when localized on the Golgi, suggesting that the Golgi organelle serves as the terminal of the Rab1 functional cycle. The KRas sensor revealed polarized KRas activity at the plasma membrane with lower KRas activity at the cell edges. Upon EGF-stimulation the sensor indicated a global increase in activated KRas.
The work based on the GTPase activation sensor in this thesis is complemented with an analysis of the dynamics of Rab1 trafficking between the cytoplasmic pool and the Golgi organelle. Using fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and photoactivation experiments, the effect of impaired Rab1 function on Rab1’s spatial cycling was assessed. These experiments indicate, that the ability to cycle between its active and inactive state is essential for sustained Rab1 trafficking between cytoplasm and Golgi.2017-01-01T00:00:00ZThe spatial organization of MAPK activity
http://hdl.handle.net/2003/35932
Title: The spatial organization of MAPK activity
Authors: Karajannis, Lisa Sophia2014-01-01T00:00:00ZStructural and biochemical characterization of the lid-loop of acyl protein thioesterase
http://hdl.handle.net/2003/35704
Title: Structural and biochemical characterization of the lid-loop of acyl protein thioesterase
Authors: Porfetye, Arthur Thomas2016-01-01T00:00:00ZDevelopment of stereoselective routes to natural product inspired compound collections via Lewis acid and -base catalysis
http://hdl.handle.net/2003/34842
Title: Development of stereoselective routes to natural product inspired compound collections via Lewis acid and -base catalysis
Authors: Danda, Adithi
Abstract: Natural product inspired compound collections embody structural scaffolds derived from biologically relevant and prevalidated fractions of chemical structure space explored by nature. These structural scaffolds are also referred to as privileged given the fact that the number of structural motifs of protein and natural products is limited. The probability that compound libraries inspired by natural products, will be biologically relevant is high and is also a viable guiding principle for the identification of small molecules for chemical biology and medicinal chemistry research.
The present work addresses the synthesis of compound libraries inspired by natural product scaffolds. The thesis is divided into two main parts; the first part describes the synthesis of the indoloquinolizine scaffold and related analogs like the harmicine scaffold via a two-step reaction sequence, which involves a Pictet-Spengler cyclization step followed by a Au(I) catalyzed intramolecular hydroamination reaction, yielding the desired indole derived scaffolds. In the second part a synthetic methodology involving an asymmetric [4+2] annulation between electron deficient cyano chromones and α-allene esters was developed, which offered an easy stereoselective access to the optically active tetrahydroxanthone scaffold.2015-01-01T00:00:00ZStructural basis for reversible, oxidative inhibition of PTEN phosphatase activity
http://hdl.handle.net/2003/34841
Title: Structural basis for reversible, oxidative inhibition of PTEN phosphatase activity
Authors: Lee, Chang Uk2016-01-01T00:00:00ZBiochemical studies of spindle assembly checkpoint components
http://hdl.handle.net/2003/34833
Title: Biochemical studies of spindle assembly checkpoint components
Authors: Breit, Claudia Verena2015-01-01T00:00:00ZMolecular dissection of the spindle and kinetochore associated Astrin/SKAP complex
http://hdl.handle.net/2003/34352
Title: Molecular dissection of the spindle and kinetochore associated Astrin/SKAP complex
Authors: Friese, Alexandra2015-01-01T00:00:00ZZelluläre Volumenregulation als adaptiver Schutzmechanismus vor tiefen Temperaturen und Etablierung des Vasopressins als biologisch aktives Kryoprotektivum
http://hdl.handle.net/2003/33626
Title: Zelluläre Volumenregulation als adaptiver Schutzmechanismus vor tiefen Temperaturen und Etablierung des Vasopressins als biologisch aktives Kryoprotektivum
Authors: Azer, Lale2014-09-22T00:00:00ZBedeutung der Vitrifikation für die Kryokonservierung und Kryofixierung
http://hdl.handle.net/2003/33573
Title: Bedeutung der Vitrifikation für die Kryokonservierung und Kryofixierung
Authors: Hübinger, Jan
Abstract: Vitrifikation nennt man den Vorgang, bei dem Wasser beim sehr schnellen Abkühlen in eine amorphe Phase mit einer sehr hohen Viskosität übergeht unter Umgehung der kristallinen Phase. Dieses vitrifizierte Wasser verhält sich wie ein Feststoff. In der Biologie gibt es zwei Methoden bei denen dieser Vorgang angewandt wird. Einerseits die Kryofixierung als Präparation für die Elektronenmikroskopie und andererseits die Kryokonservierung lebender Zellen und Gewebes. Beide Methoden erfordern das Arretieren physiologischer und molekularer Vorgänge. Dies wird durch tiefkalte Temperaturen erreicht. Wasser, als Grundbestandteil biologischer Materie, gefriert bei diesen Temperaturen normalerweise zu kristallinem Eis. Bei der Kryofixierung würden die Eiskristalle die zu untersuchende Struktur artifiziell verändern und bei der Kryokonservierung geht man davon aus, dass intrazelluläres Eis letal ist. Während für die Kryofixierung hauptsächlich der Abkühlvorgang optimiert worden ist, wurde für die Kryokonservierung die Zusammensetzung des Mediums durch Kryoprotektiva verändert, um eine Reversibilität des Arrests zu erreichen. In dieser Arbeit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass Methoden der Kryofixierung, nach signifikanten Anpassungen der Protokolle, auch für die Kryokonservierung verwendet werden können. Eine der getesteten Methoden, das self-pressurized rapid freezing, führte dabei zu ebenso hohen Überlebensraten wie das beste getestete, etablierte Kryokonservierungsprotokoll und es hat gegenüber diesem den Vorteil, dass es trotz größerer Probe deutlich platzsparender arbeitet und sowohl die Probe als auch die Außenwelt durch die geschlossene Bauweise vor Kontaminationen geschützt ist. Außerdem konnte mit Hilfe kryoelektronenmikroskopischer Untersuchungen gezeigt werden, dass Vitrifikation weder notwendig noch ausreichend für das Überleben von Zellen ist. Aufgrund der hierbei erzielten hohen räumlichen Auflösung, konnte eindeutig nachgewiesen werden, dass Eiskristallbildung sowohl intra- als auch extrazellulär toleriert werden kann, wenn entsprechende Kryoprotektiva verwendet werden. Dies widerlegt die bisherige Annahme, dass intrazelluläre Eiskristalle immer letal sind. Des Weiteren wird hierdurch nahegelegt, dass ein zusätzlich aktiver Mechanismus zur Kryoprotektion bestehen muss, als bloße Verhinderung der Eiskristallbildung. Die Ergebnisse zeigen jedoch auch, dass Eiskristallwachstum für optimale Überlebensraten begrenzt werden muss. Überraschend war, dass Vitrifikation in sogenannten Vitrifikations-protokollen für die Kryokonservierung nicht notwendigerweise stattfindet, wodurch jedoch Vitrifikation als Konzept für die Kryokonservierung nicht ausgeschlossen ist. Zudem konnte anhand geschrumpfter, adhärenter Zellen gezeigt werden, dass Kryokonservierung ohne intrazelluläre Kryoprotektiva generell möglich ist. Daraus lässt sich schließen, dass es theoretisch möglich sein müsste, auch voll hydrierte Zellen reversibel zu kryofixieren, wenn entsprechend hohe Abkühl- und Aufwärmraten erzielt werden könnten, um diese komplett zu vitrifizieren.2014-08-15T00:00:00ZDie Bedeutung der zellulären Volumenregulation bei der Kryo-Arretierung biologischer Systeme
http://hdl.handle.net/2003/33572
Title: Die Bedeutung der zellulären Volumenregulation bei der Kryo-Arretierung biologischer Systeme
Authors: Christmann, Jens
Abstract: Während der Kryo-Konservierung von Zellen, die klassischerweise mit einem langsamen Einfrieren verbunden ist, verlieren Zellen massiv an Wasser. Teilweise sind bei tiefen Temperaturen nur noch 5% des osmotisch aktiven Volumens vorhanden. Dieses Verfahren stellt somit eine deutlich Dysbalance für den Wasserhaushalt von Zellen dar. Volumenregulation ist für Zellen eine essentielle Funktion, um sich an Änderungen der intra-oder extrazellulären Osmolarität anzupassen. Sie dient der Regulation des Wasserhaushaltes und ist kritischer Bestandteil von Prozessen wie der Proliferation oder auch der Apoptose. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Volumenregulation von HeLa-Zellen eingehend charakterisiert. Dazu wurden mittels FCS-Messungen die Geschwindigkeiten, des Zell-Schrumpfens und Schwellen, sowie des RVI bestimmt. Neben den generellen Prozessen der Volumenregulation wurden noch zwei Hauptvermittler des RVI in HeLa-Zellen, der HICC und NHE1, ebenfalls in einer temperaturabhängigen Weise untersucht. Darüber hinaus wurde, in einer Kooperation, das molekulare Korrelat des HICCs in HeLa Zellen identifiziert und ein Aktivierungsmechanismus untersucht. Der Vergleich, insbesondere der Aktivierungsenergien zwischen ungefrorenen und gefrorenen Zellen brachte neue Erkenntnisse über die Notwendigkeit von Volumenregulation für eine erfolgreiche Kryo-Konservierung. Es stellte sich heraus, dass der RVI und die HICC-Aktivierung nach dem Frieren von Zellen eine deutlich niedrigere Aktivierungsenergie aufwiesen. Diese Ergebnisse deuten auf eine Beteiligung des HICCs bei der Volumenregulation von Zellen nach deren Frieren hin. Die Volumenregulation nach dem Frieren ist ein integraler Bestandteil einer Adaptation an den vorhergegangenen Wasserverlust. Darüber hinaus konnte ein Verfahren für die Kryo-Konservierung von adhärenten Zellen etabliert werden. Als Konsequenz dieser Erkenntnisse wurde Vasopressin, ein Stimulanz von HICC-Kanälen, als neue Form der Kryo-Protektion etabliert. Eine Behandlung von Zellen vor dem Frieren mit diesem Hormon, führte zu höheren Überlebensraten und besserem Wachstum der Zellen nach dem Frieren. Dieser Effekt wurde durch eine Stimulation des RVI, insbesondere durch eine Stimulation des HICCs, vermittelt. Es konnte gezeigt werden, dass Viskosität scheinbar ein wichtiger Parameter in der Wahrnehmung von Volumenänderungen der Zelle sein kann. Durch die artifizielle Änderungen der Viskosität kam es zu einer Aktivierung des HICCs in HeLa Zellen. Ebenso zeigte sich nach dem Frieren von Zellen eine Hysterese in deren Viskosität, mit einer zweifachen Erhöhung nach der Rückkehr zu 35°C. Es kann angenommen werden, dass diese erhöhte Viskosität wenigstens ein Signal für die gesteigerte Volumenregulation nach dem Frieren ist. Die erhaltenen Ergebnisse und Konzepte zum Frieren von Zellen führten zu der Entwicklung und Etablierung von zwei neuen Verfahren zur Fixierung von Zellen für die Mikroskopie. So wurde ein langsames Gefrierprotokoll für das adaptive Frieren von Zellen zur anschließenden superresolutions-Mikroskopie entwickelt, welches einen reversiblen Arrest und ein zweite Mikroskopie nach Behandlung der Zellen erlaubte. Ein vom Fraunhofer Institut in St. Ingbert entwickeltes Gerät zum Schock-Frieren von Zellen wurde erfolgreich zur ultraschnellen Arretierung von Zellen mit anschließender Fluoreszenz-Lebenszeit-Mikroskopie verwendet. Dabei konnte gezeigt werden, dass diese Variante des Frierens weder die molekulare Interaktion noch die räumliche Lokalisation des EGF-Rezeptors beeinträchtigt.2014-08-15T00:00:00ZChemische Biologie von Membranproteinen: Synthese und Modifikation des Transducers NpHtrII aus dem Photorezeptor-Komplex von Natronomonas pharaonis
http://hdl.handle.net/2003/33062
Title: Chemische Biologie von Membranproteinen: Synthese und Modifikation des Transducers NpHtrII aus dem Photorezeptor-Komplex von Natronomonas pharaonis
Authors: Dittmann, Marc
Abstract: In dieser Arbeit wird die chemische Synthese der Membrandomäne des archaebakteriellen Transducerproteins NpHtrII unter Ausnutzung der Nativen Chemischen Ligation (NCL) beschrieben. Durch die Etablierung einer Synthese werden die Voraussetzungen für eine chemische Modifizierung des NpHtrII geschaffen, um sowohl den Einbau eines chemisch synthetisierten Photoschalters als auch die Inkorporation von Reportergruppen für spektroskopische Methoden zu ermöglichen. Diese Modifikationen werden zusätzliche bio-physikalische Untersuchungen erlauben und so helfen, weitere Kenntnisse über die Funktion des NpHtrII auf molekularer Ebene zu erhalten.2014-04-29T00:00:00ZLateral organization of cell matrix proteins on the nano-scale
http://hdl.handle.net/2003/33001
Title: Lateral organization of cell matrix proteins on the nano-scale
Authors: Mondry, Justine
Abstract: Cellular anchors are large accumulations of a multitude of multi-functional proteins and are known as focal adhesion sites. In this work, the spatial organization of a subset of cell-matrix proteins was analyzed, using the superresolution microscopy technique PALM. It was demonstrated, that all cellmatrix proteins form distinct areas of varying densities inside single focal adhesions. Highly dense protein accumulations can contain up to several tens of molecules and can span a diameter of more than hundred nanometers. However, no recognizable structure or polarity could be observed for such large protein accumulations. In order to study the temporal alterations and formation of such highly dense protein accumulations, the dynamic behavior of the adhesion receptor β3-integrin was analyzed. It was shown, that force inhibition can induce structural rearrangements, also leading to the redistribution of the density inside adhesion sites. However, force inhibition did not cause the complete disassembly of dense β3-integrin domains. Therefore, it is suggested that force can modulate the dense areas, but is not the initial inducer. Instead, it seems that an initial formation of dense domains occurs already in the very beginning of focal adhesion development, followed by a gradual immobilization of β3-integrin and thus leading to the formation of new adhesion sites. It was observed that the seed for some dense domains can be planted already in early maturation stages with the potential to increase its size upon adhesion expansion. Dense domains could even have a particular signaling function, as it was shown that the signaling protein FAK is primarily recruited to delimited areas inside focal adhesions, which could represent dense domains.2014-03-25T00:00:00ZEvaluation of the phage display protocol for target identification of small molecules
http://hdl.handle.net/2003/32885
Title: Evaluation of the phage display protocol for target identification of small molecules
Authors: Tran, Thi Ngoc Tuyen
Abstract: Currently, the phage display is the potential method for target identification of small molecules. Thus, the first objective of this thesis was to establish a cDNA phage display protocol for affinity isolation of target proteins binding to small molecules of interest as an alternative to the affinity-based approach. For that reason we generated a cDNA phage display library using HeLa cells, which are usually used for phenotypic studies and for target identification using affinity chromatography in our group. This approach was applied different molecules including melophlin A, CD 267, tubulexin A. and glutathione (GSH) as control. Preincubation the library with streptavidin-biotin or streptavidin-PEG-biotin or inactive compound before biopanning step was employed to reduce on-specific binding. In parallel, specific elution approaches was employed to elute proteins and identified one known hit of GSH. The binders identified by phage display were not identical with the binders identified using affinity purification in the case of melophlin A, CD 267 and tubulexin A. Even though we could succeed in establishing a protocol with the optimal conditions determined. However, there is unlikely to get the same hits of affinity purification for melophlin A, CD 267 and tubulexin A.
A separate study focused on the biological evaluation of hit compounds from phenotypic high content screening that monitors changes in cytoskeleton and DNA. Molecules interfering with microtubule dynamics are among the most successful therapeutics for the treatment of cancer. Despite the availability of many tubulin targeting agents, cells can become resistant towards the drugs. Hence, there is high demand for the identification of new anti-tubulin agents that are able to overcome anti-tubulin drug resistance. Within this work, the aim was to further validate the effects of tubulexin A and podoverin A and characterize their mode of action. Tubulexin A and the natural product podoverin A are potent inducers of a G2/M cell cycle arrest and apoptosis. Tubulexin A is the most active compound identified from tetrahydropyran library. Base on target validation showed that tubulexin A inhibits tubulin polymerization by targeting the vinca alkaloid binding site of tubulin and also bind to the protein CAS. Further validation of the effects of those compounds on tubulin polymerization, the cell cycle, and their binding to CAS was done by biophysical measurements, binding assays, tubulin polymerization assays, immunofluorescence and life time imaging, binding assays, and affinity chromatographic methods. Results showed that CAS binds to tubulexin A independent from tubulin. Additionally, tubulin polymerization is inhibited in a synergistic manner in the presence of both, tubulexin A and CAS in vitro. Based on results of overcome vinblastine-resistance, tubulexin A can become a promising antimitotic drug for cancer treatment with the dual mode of action of the tubulexin A and CAS. For the natural product podoverin A is the most active mitosis modulator in natural product library. This compound is a potential target for further study on natural product as mitosis modulator to use for anticancer drugs, also used as natural product scaffold for synthesis library.
The third aim of this thesis is discovery new CAS inhibitors as mitosis modulators. Despite the high relevance of CAS as a target in cancer, there is no small molecule targeting CAS published yet. Therefore, additional focus of this work was to discover further compounds that bind to CAS which might interfere with CAS function and thus might inhibit growth of cancer cells. A reverse chemical genomics-approach was chosen in collaboration with the group of Prof. Osada (RIKEN-Wako-Japan). This strategy is based on a chemical array screening. After chemical array screening of approximately 25,000 compounds, 263 potential hit compounds have been obtained. Further validation the hit compounds was based on phenotypic changes and specific function of the target using immunofluorescence and life time imaging, biophysical methods for the determination of the binding affinity, as well as studies on the interaction of the hit compounds with DNA and tubulin polymerization in vitro. The most interesting compound R89 was further validated on HeLa cells and we found that this compound inhibited cell proliferation. Result showed that R89 has effect on mitosis by formation of multipolar mitotic spindles and caused chromosome congression defects and also induces nuclear accumulation of RANBP1. Thus R89 is an interesting mitosis modulator to study for anticancer drugs.2014-02-27T00:00:00ZTIRF-anisotropy microscopy: homo-FRET and single molecule measurements
http://hdl.handle.net/2003/31290
Title: TIRF-anisotropy microscopy: homo-FRET and single molecule measurements
Authors: Gelléri, Márton
Abstract: Lichtmikroskopie wird durch die Beugung von Licht auf eine Auflösung von etwa der halben Wellenlänge des Lichtes begrenzt. Neuere Methoden der Fluoreszenzmikroskopie umgehen diese Beugungsgrenze, indem die Position einzelner fluoreszierender Moleküle mit einer Genauigkeit bestimmt wird, die weit über der Auflösungsgrenze konventioneller Lichtmikroskopie liegt. Um diese Auflösung zu erreichen, wird eine Bildfolge von fluoreszierenden Molekülen aufgenommen, die zu einem hochauflösenden Mikroskopiebild rekonstruiert wird. Die erhöhte Auflösung kann dann benutzt werden um die räumliche Verteilung von Proteinen in Zellen auf einer Submikrometerskala zu untersuchen. Um die räumliche Organisation von Plasmamembranproteinen zu untersuchen, wurden in der vorliegenden Arbeit Lokalisationsmikroskopie mit Polarisationsmessungen und interner Totalreflexionsmikroskopie (englisch: total internal reflection fluorescence microscopy, TIRF microscopy) kombiniert. Das entwickelte Mikroskop wurde sowohl in Ensemble-Messungen eingesetzt um die Proteinorganisation mittels Förster Resonanz Energietransfer (FRET) auf der Nanometerebene zu untersuchen, als auch in Einzelmolekülmessungen um molekulare Orientierungen zu betrachten. TIRF Mikroskopie wurde mit Fluoreszenzanisotropiemessungen kombiniert um die räumliche Verteilung der kleinen GTPase Ras und ihren aktiven Mutanten zu untersuchen. In Ensemble-Messungen führt FRET zu einer Depolarisation des emittierten Fluoreszenzsignals, so dass Distanzen auf der Nanometerskala untersucht werden können. Es konnte gezeigt werden, dass Anisotropiemessungen sowohl in konventioneller Weitfeldanregung als auch in TIRF-Anregung durch den hohen Hintergrund beeinträchtigt und dadurch Rückschlüsse auf die Proteinorganisation erschwert werden. Anisotropiemessungen wurden auch auf Einzelmolekülebene durchgeführt. Auf Einzelmolekülebene entspricht die Messung der Polarisation einer Messung der zweidimensionalen Orientierung der Moleküle. Stufenweises Bleichen von Molekülen zeigte, dass Polarisationsmessungen die Detektion von homo-FRET in Einzelmolekülmessungen erlauben. Photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM) wurde mit Polarisationsmessungen kombiniert. Der Einfluss der Photoselektion wurde für eine typische Probe untersucht, indem die Polarisation des Anregungslichtes gedreht wurde und die Verteilung der Orientierungen der Moleküle bestimmt wurde. Es konnte gezeigt werden, dass die Polarisation des Anregungslichtes einen Einfluss auf Einzelmolekülmessungen hat. Für eine nichtzufällige Verteilung der Fluorophore kann dieser Einfluss zu falschen Rückschlüssen führen.2013-12-10T00:00:00ZSignaltransfer des SRII/HtrII Komplexes und strukturelle und funktionelle Untersuchung der HAMP Domäne aus Natronomonas pharaonis
http://hdl.handle.net/2003/30427
Title: Signaltransfer des SRII/HtrII Komplexes und strukturelle und funktionelle Untersuchung der HAMP Domäne aus Natronomonas pharaonis
Authors: LI, Lin2013-07-17T00:00:00ZRegulation of septin filament formation and cholesterol production by DHCR7
http://hdl.handle.net/2003/30305
Title: Regulation of septin filament formation and cholesterol production by DHCR7
Authors: Yashar, Sadian
Abstract: Elektronenmikroskopie (EM) ist eine hervorragende Methode um die Struktur von Proteinkomplexen in
ihrer nativen Umgebung zu studieren. In dieser Arbeit verwendeten wir zum einen
Einzelpartikelelektronenmikroskopie und Elektronenktomographie um die Struktur von Septinfilamenten
und deren Interaktion mit anderen Proteinen zu untersuchen. Zum anderen züchteten wir
zweidimensionale Kristalle der Dehydrocholesterinreduktase DHCR7, um in Zukunft deren Struktur
elektronenkristallographisch bestimmen zu können.
Septine gehören zur Familie der GTPasen und bilden große Polymere, deren Untereinheiten aus nichtpolaren
Multimeren bestehen. Die Polymere wiederum bilden Filamente, die im Knospungshals von
sprossenden Hefen zu finden sind. Die Rekrutierung der Septine zum Knospungshals ist abhängig von
dem Signalprotein Cdc42p und zwei seiner Effektoren, Gic1 und Gic2. Die Septinfilamente lagern sich
auf der Oberfläche von Membranen an und bilden dadurch zum einen ein Gerüst und zum anderen eine
Diffusionsbarriere für Proteine. Obwohl man weiß, dass Gic-Proteine direkt mit Septinen interagieren,
sind die strukturellen Gegebenheiten und die Signifikanz dieser Bindung bislang unbekannt.
In dieser Arbeit konnten wir zeigen, dass Gic1 an der Bindungsfläche zwischen den Septinen Cdc10-
Cdc10 bindet und dabei bis zu sechs Septin-Filamente zu einem flexiblen Septin-Gic-Komplex verbindet.
Die Bindung von Cdc42p(GDP) an die ersten 29 Aminosäuren von Cdc10 induziert die Dissoziierung der
Septinfilamente. Cdc42p(GppNHp) hingegen interagiert nicht mit Septinen, sondern bindet direkt an
Gic1. Interessanterweise führen hohe Konzentrationen von Cdc42p(GppNHp) dabei zu einer
Dissoziierung des Septin-Gic-Komplexes. Ebenso haben wir den Effekt von GTP auf die Filamente selbst
untersucht. GTP ersetzt GDP in Cdc11 und verursacht eine Konformationsänderung an der
Bindungsfläche von Cdc11-Cdc11 was zu einer Dissoziierung der Septinfilamente führt. Die vorliegende
Studie liefert ein Modell für den durch Cdc42p, GTP und Gic1 gesteuerte Auf- und Abbaus von
Septinringen während des Zellzyklus.
Die Dehydrocholesterinreduktase DHCR7 reduziert im letzten Schritt der Cholesterin-Biosynthese die
C7-C8-Doppelbindung von 7-Dehydrocholesterin unter Verbrauch von NADPH. Eine Fehlfunktion der
DHCR7 führt beim Menschen zu dem Smith-Lemli-Opitz Syndrom (SLOS). Eine atomare Struktur der
DHCR7, die es bislang nicht gibt, würde die mechanistischen Grundlagen der enzymatischen Funktion
des Proteins erklären und Aufschlüsse über dessen Fehlsteuerung im Krankheitsfall geben.
Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich deshalb mit der Isolierung, Aufreinigung und zweidimensionalen
Kristallisation der menschlichen Dehydrochlosterinreduktase-7 und deren bakteriellen Homologe aus
Coxiella burnettii und Plesiocystis pacifica.
Für DHCR-7 aus Coxiella burnettii konnten kleine zweidimensionale gezüchtet werden, die allerdings in
Zukunft verbessert werden müssen, um sie elektronenkristallographisch zu analysieren. Um die Funktion
der Reduktase in vivo zu studieren, wurde die DHCR-7-katalysierte Umwandlung von Ergosterol zu
Brassicasterol mit Hilfe von Gaschromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie (GC-MS)quantifiziert. Des Weiteren zeigte eine Lokalisationsstudie in HEK293-Zellen, dass DHCR7 neben dem ER auch im Golgi-Apparat lokalisiert ist.2013-05-07T00:00:00ZSynthese von Guanosinnukleotidanaloga
http://hdl.handle.net/2003/30150
Title: Synthese von Guanosinnukleotidanaloga
Authors: Wiegandt, David2013-04-19T00:00:00ZStruktur-Funktions-Beziehungen der humanen Septine
http://hdl.handle.net/2003/30101
Title: Struktur-Funktions-Beziehungen der humanen Septine
Authors: Zent, Eldar2013-03-19T00:00:00ZMechanismen der reversiblen enzymatischen Adenylylierung von Rab‐Proteinen
http://hdl.handle.net/2003/29883
Title: Mechanismen der reversiblen enzymatischen Adenylylierung von Rab‐Proteinen
Authors: Müller, Matthias Philipp
Abstract: Including more than 60 members in humans, Rab proteins constitute the largest subfamily of the Raslike
superfamily of small GTPases which act as molecular switches and can exist in a GDP‐bound
(inactive) and a GTP‐bound (active) conformation. The conversion between these states is carried out by
regulatory factors: GTPase activating proteins (GAPs) stimulate GTP hydrolysis and guanine nucleotide
exchange factors (GEFs) catalyze the GDP‐GTP exchange. Rab proteins interact with effector proteins
only in the active state, thereby regulating vesicular trafficking in eukaryotic cells. For this purpose, the
activity and the intracellular localization of Rab proteins need to be tightly regulated. In order to ensure
their own survival, some intracellular pathogens have developed intriguing strategies for manipulation
of intracellular vesicular transport processes and in particular of the Rab proteins involved. A prominent
example of an intracellular pathogen that manipulates Rab proteins for its own benefit is Legionella
pneumophila. In particular, the Legionella protein DrrA (defect in Rab recruitment A) was identified in
the recent past as a protein that manipulates the intracellular localization and activity of Rab1. At the
beginning of this work, structural studies on this protein showed the presence of an additional,
previously uncharacterized domain possessing adenylyltransferase activity towards Rab1. The
characterization of this enzymatic activity was the central subject of this work.
Within this work, the x‐ray crystal structure of adenylylated Rab1 was solved. This structure showed that
Rab1 was specifically modified on a tyrosine residue in the functionally important switch II region.
Further studies of the effects of this modification showed that the interaction of Rab1‐AMP with GAPs
and the human effector Mical‐3 are drastically inhibited, whereas the interaction with the GEF domain
of the Legionella protein DrrA and the Legionella effector protein LidA are not significantly inhibited.
Characterisation of the enzyme kinetics of DrrA and the recently identified deadenylylating enzyme SidD
showed that Rab1:GTP is the preferred substrate of adenylylation by DrrA while SidD possesses a
significantly lower substrate specificity towards the active or inactive conformation of Rab1. This work
includes the first description and characterization of adenylylation as a posttranslational modification of
Rab proteins. In the context of the current literature, the results of this work allowed the proposal of a
model in which adenylylation temporarily inhibits deactivation of Rab1 by GAPs and thus the extraction
of Rab1 from the Legionella containing vacuolar (LCV) membrane by GDI and Rab1 is entrapped at the
LCV membrane. At a later stage of infection, deadenylylation by SidD allows for deactivation and
extraction by GDI.; Rab‐Proteine bilden mit mehr als 60 Mitgliedern im Menschen die größte Unterfamilie der Superfamilie
Ras‐ähnlicher kleiner GTPasen, welche als molekulare Schalter in einer GDP‐gebundenen (inaktiven) und
einer GTP‐gebundenen (aktiven) Konformation vorliegen können. Die Konversion der Aktivitätszustände
erfolgt durch regulatorische Faktoren: GTPase aktivierende Proteine (GAPs) stimulieren die GTPHydrolyse
und Guaninnukleotidaustauschfaktoren (GEFs) katalysieren den GDP‐GTP‐Austausch. In der
aktiven Konformation interagieren Rab‐Proteine mit Effektorproteinen und regulieren den vesikulären
Transport in eukaryotischen Zellen. Um vesikuläre Transportwege zum eigenen Vorteil zu nutzen haben
einige intrazellulär lebende Pathogene erstaunliche Methoden zur Manipulation von Rab‐Proteinen
entwickelt. Ein prominentes Beispiel eines solchen Pathogens ist Legionella pneumophila und
insbesondere das Legionellenprotein DrrA (engl.: defect in Rab recruitment A), welches die intrazelluläre
Lokalisation und den Aktivitätszustand von Rab1 manipuliert. Strukturelle Untersuchungen vor Beginn
dieser Arbeit offenbarten eine weitere funktionelle Domäne von DrrA, welche Adenylyltransferase‐
Aktivität gegenüber Rab1 besitzt. Die Charakterisierung dieser Aktivität war zentrales Thema dieser
Arbeit.
Die innerhalb dieser Arbeit bestimmte Röntgenkristallstruktur des adenylylierten Rab1 zeigte, das Rab1
spezifisch an einem Tyrosin im Bereich des funktionell wichtigen switch II modifiziert wird.
Weiterführende Untersuchungen offenbarten starke inhibitorische Effekte der kovalenten Modifizierung
auf die Interaktion von Rab1 mit GAPs und dem humanen Effektorprotein Mical‐3, wohingegen die
Interaktionen mit der GEF‐Domäne von DrrA und dem Legionellen Effektorprotein LidA nicht signifikant
gestört sind. Enzymkinetische Untersuchungen von DrrA und dem kürzlich identifizierten
deadenylylierenden Enzym SidD zeigten, dass die aktive Konformation von Rab1 das bevorzugte Substrat
der Adenylylierung durch DrrA ist, wohingegen SidD beide Aktivitätszustände von Rab1 gleichermaßen
als Substrat akzeptiert. Diese Arbeit umfasst die erste Beschreibung und Charakterisierung der
Adenylylierung als posttranslationale Modifikation eines Rab‐Proteins. Im Kontext der aktuellen
Literatur erlaubten die Ergebnisse dieser Arbeit die Erstellung eines Modells, in dem eine Deaktivierung
von Rab1 durch GAPs und somit eine Extraktion von der Membran der Legionellen enthaltenden
Vakuole (LCV) durch GDI temporär durch die kovalente Modifikation unterbunden wird und Rab1 an der
LCV‐Membran arretiert wird. Erst durch das deadenylylierende Enzym SidD wird zu einem späteren
Zeitpunkt der Infektion eine Deaktivierung und Extraktion wieder ermöglicht.2013-01-29T00:00:00ZMembranlokalisation von Rab-Proteinen durch RabGEFs
http://hdl.handle.net/2003/29882
Title: Membranlokalisation von Rab-Proteinen durch RabGEFs
Authors: Blümer, Julia
Abstract: Insgesamt mehr als 60 humane Rab-Proteine lokalisieren an spezifischen Organellen und
regulieren den intrazellulären vesikulären Transport. In der inaktiven GDP-gebundenen Form existieren Rabs im Zytosol im Komplex mit dem Solubilisierungsfaktor GDI, der die
C-terminalen hydrophoben Geranylgeranylreste gegen das wässrige Milieu des Zytosols
abschirmt, wobei der Prenylanker Voraussetzung für die reversible Membranassoziation von Rab:GTP nach Aktivierung durch ein GEF ist.
Rab-Proteine koordinieren als molekulare Schalter die Teilschritte vesikulärer Transportprozesse wie Abschnürung, Transport, Andocken und Fusion des Vesikels. Sowohl die Signalweiterleitung
durch spezifische Interaktion mit Effektorproteinen als auch die Aktivierung und Deaktivierung durch GEFs bzw. GAPs ist im mechanistischen Detail bereits sehr gut verstanden. Gegenstand langjähriger Diskussion ist dagegen der zelluläre Mechanismus der spezifischen Lokalisation der 60 unterschiedlichen Rab-Proteine an ihre jeweilige Zielmembran. Neuere Untersuchungen haben mittels biochemischer Verfahren anhand des Legionellenproteins DrrA gezeigt, dass GEFs durch die Rab-Aktivierung GDI aus dem hochaffinen
Rab:GDP:GDI-Komplex prinzipiell freisetzen können. Somit ist eine spezifische
Membranrekrutierung von Rab-Proteinen durch membranständige GEFs denkbar. Die vorliegende Arbeit untersucht mittels zellbiologischer Ansätze die Rolle von GEFs hinsichtlich der spezifischen Membranlokalisation von Rab-Proteinen und korreliert die erhaltenen
Ergebnisse mit biochemischen Analysen. Das endosomale Rab5 und sein GEF Rabex-5
wurden dabei als initiales Modellsystem gewählt. Die artifizielle mitochondriale Fehllokalisation von Rabex-5 bewirkt die spezifische Rekrutierung von Rab5A. Diese Rekrutierung ist sowohl von der Fähigkeit das Substrat Rab5A zu erkennen als auch von der enzymatischen Aktivität des GEFs abhängig. Weiterhin konnte mittels gezielt gewählter Rab5-Mutanten gezeigt werden, dass die GDI-vermittelte Extraktion des Rabs für die anschließende spezifische Lokalisation des Rabs durch das GEF essentiell ist. Zusätzlich führt eine verminderte
GEF-Aktivität durch Einführung von Punktmutationen gleichermaßen zu einer Reduktion der GDI-Freisetzungsaktivität und korreliert darüber hinaus mit der verminderten Fähigkeit das Rab-Protein effizient an Organellen zu rekrutieren. Dies verdeutlicht die signifikante Korrelation
dieser drei vermeintlich unabhängigen Prozesse. Die Bedeutung von GEFs für die spezifische Rekrutierung von Rabs konnte durch die systematische Ausweitung des experimentellen Systems auf die GEFs DrrA und Rabin8 und ihre Substrate Rab1 bzw. Rab8 zusätzlich untermauert werden. Die zellbiologische und biochemische Analyse der erwähnten GEFs und ihrer Rab-Substrate lässt somit den Schluss zu, dass die GEF-vermittelte Rab-Lokalisation ein genereller Mechanismus zur spezifischen subzellulären Rekrutierung von Rab-Proteinen an eine distinkte Organellenmembran darstellt.2013-01-29T00:00:00ZDevelopment of site specific labeling strategies for protein modification and synthesis of Rab probes
http://hdl.handle.net/2003/29842
Title: Development of site specific labeling strategies for protein modification and synthesis of Rab probes
Authors: Long, Yi
Abstract: Die Entwicklung von Methoden für die chemische Ligation von synthetischen kleinen
Molekülen oder Peptiden, Proteinen ist eine aktuelle Grenze in der chemischen Biologie.
Exprimierte Protein-Ligation (EPL) war äußerst nützlich für die Synthese von verschiedenen
Proteinen in der Vergangenheit. Insbesondere das Konzept der EPL elegant zeigt den Nutzen
der Kombination der Felder der synthetischen organischen Chemie und Molekularbiologie,
um komplexe physiologische und biochemische Fragen anzugehen. Die vorliegende Studie an
zwei Facetten einzuführen: 1) herzustellen mehrere universale Strategien, um die EPLTechnologie
für eine ortsspezifische Proteinmodifikation und Immobilisierung erstrecken; 2)
Anpassung der EPL Methodik auf die Halbsynthese Rab Proteine Sonden, die mehrere
wichtige Funktionen ausüben während vesikulären Transport in eukaryotischen Zellen.
Erstens haben wir eine einfache, effiziente und leichte Strategie für die ortsspezifische
Immobilisierung von Proteinen an Oberflächen durch Ligation an Oxyamingruppe
Proteinmikroarrays erzeugen. In unserer Strategie die Proteine werden zunächst leicht mit
Oxyamingruppe Gruppen am C-Terminus modifiziert und anschließend immobilisiert auf
Keton-beschichtete Objektträger. Diese Immobilisierung Strategie effizient verläuft bei
neutralen Bedingungen (pH 7,0), und ist besonders mild zur Immobilisierung von Proteinen
im Vergleich zu anderen Methoden. Darüber hinaus ermöglicht diese Strategie die direkte
Immobilisierung von exprimierten Proteinen aus rohem Zelllysaten ohne vorherige Reinigung.
Die produzierten Protein Biochips können für die Untersuchung von Protein-Protein-
Wechselwirkungen, wie durch Rab-REP und PKA-Antikörper-Wechselwirkung Studien
gezeigt verwendet werden. Unsere Strategie erweitert das Repertoire der Immobilisierung von
Proteinen Methoden und bietet eine alternative Möglichkeit, um die verschiedenen
Anforderungen für die Immobilisierung von Proteinen erfüllen.
Zweitens haben wir das Prinzip der Verwendung von zwei chemoselektive Reaktionen auf
ortsspezifisch kennzeichnen ein einzelnes Protein in einer Eintopfreaktion. Wir entwickelten
einen allgemeinen, einfache und effiziente Strategie für die N-und C-terminalen zweifarbige
Kennzeichnung für das Protein unter Verwendung Rab7 native chemische Ligation und Oxim
veranschaulicht. Das Verfahren ist kostengünstig und einfach durchzuführen. Die
Reaktionsbedingungen sind biokompatibel und mild genug für die Protein-Modifikationen.
Die Strategie hier vorgestellte könnte ein allgemeines Verfahren zur Erzeugung doppelt
markierte Proteine, die ebenfalls könnte eine Vielzahl von Anwendungen zum Studium
Proteinfunktionen am einzigen Molekül und zellulärer Ebene. Wir haben gezeigt, das das
gebildete Protein-Sonde verwendet werden, um Protein-Umfaltung und Protein-ProteinWechselwirkungen
durch FRET-Untersuchungen zu untersuchen. Diese Studie führt zu der
Erkenntnis, dass sowohl BIP als auch GppNHp kann GTPase helfen, falten, und deshalb
darauf, einen Weg zu GppNHp-gebundenen GTPase, wie sie durch erfolgreiche Semisynthese
eines RhoA-GG Protein angegeben.
Drittens haben wir das Prinzip einer FRET-Strategie für die Überwachung GEF-vermittelten
Nukleotid-Austausch mit Website-spezifisch markierten GEF und GTPase-Proteine.
Verwendung NCL und Oxim bereiteten wir N-terminalen Cumarin-markierten GEFs und Cterminalen
fluoresceinmarkierten GTPasen. Wir konstruierten die Cumarin-GEF:GTPase-
Fluorescein-Komplex, der eine signifikante intermolekulare FRET-Effekt zeigte. GTPase
Interaktion: das FRET-Signal wurde durch Bindung von GDP oder GTP und erlaubt den
direkten Nachweis des GEF gestört. Transient kinetische Studien zur FRET Signaländerung
bezogen wurden verwendet, um die Aktivität und GEF Nukleotidbindung überwachen. Die
Untersuchungen führten zu einer konsistenten Rückschluss auf die GEF Mechanismus mit
allosterischen Wettbewerb zwischen GDP / GTP und GEF die Interaktion mit einer GTPase.
Die vorgestellte Strategie könnte hier eine allgemeine Methode, die für andere GEFs und
GTPasen ist, und kann eröffnen einen neuen Weg für die Identifizierung von GEF-Inhibitoren
und für das Studium GEF-Mechanismen.
Viertens stellten wir eine allgemeine Strategie mit Tandem EPL und klicken Chemie
ortsspezifisch installiert hydrophoben Gerger Modifikationen in Proteine. Das zweistufige
Ligation ist quantitativ, wodurch die Reinigung des Proteins wesentlich ligierten facile. Der
Ansatz ergab korrekt gefaltete und funktionelle geranylgeranyliert Rab GTPasen, wie durch
ihre Fähigkeit, mit REP sowie interagieren, um die zweite Gruppe in Gerger Prenylierung
akzeptieren abgeleitet werden könnten. Die Ligation kann eröffnen einen neuen Weg zur
Herstellung von Lipoproteinen, die in verschiedenen biologischen Studien verwendet werden.
Schließlich haben wir ein einfaches Verfahren von Oxim Ligierung, um eine Reihe von
PEGyliertem Rab-Protein-Sonden für Prenylierung und Lokalisationsstudien produzieren. Der
Ersatz von Rab C-terminalen Region mit einer unnatürlichen PEG-Gruppierung nicht stören
Rab Prenylierung in vitro und in vivo. Diese Ergebnisse den Mechanismus aufgeklärt Rab
Prenylierung, dh es besteht keine Spezifität in Rab C-Terminus hypervariablen Regionen vor
und nach dem Motiv für CIM Rab Prenylierung erforderlich. Mit diesen Reihe von Sonden
Rab wir weiter untersucht, ob das Problem, dass die C-terminalen hypervariablen Bereich
nach Rab Targeting beiträgt. Wir fanden, dass die Membran Targeting-Mechanismen für die
Rab-Proteine Familie komplizierter als in früheren schlagen sind. Für Rab1 und Rab5, werden
die C-terminalen hypervariablen Regionen nicht an die Membran-Targeting beitragen.
Allerdings ist die Ersetzung der C-terminalen Sequenz mit chemischen Linker in mehreren
Rab Proteine tatsächlich stören ihrer Membran-Targeting, was bedeutet, dass in diesen Rab-
Proteine der C-terminalen hypervariablen Region ist wichtig für biologische Funktion. Diese
Arbeit stellt ein Beispiel für chemische Werkzeuge verwendet werden, um einheimische
biomolekularen Funktionen anzufechten, was zu einem besseren Verständnis der Rab
Prenylierung und Targeting-Mechanismen.; The development of methods for the chemical ligation of synthetic small molecules or
peptides to proteins is a current frontier in chemical biology. Expressed protein ligation (EPL)has been extremely useful for the synthesis of various proteins in the past. In particular the concept of EPL elegantly demonstrates the usefulness of combining the fields of synthetic organic chemistry and molecular biology in order to address complex physiological and biochemical questions. The present study aimed at two facets: 1) establish several universal strategies to extend the EPL technology for site-specific protein modification and immobilization; 2) adapt the EPL methodology to the semi-synthesis of Rab proteins probes, which exert many important functions during vesicular transport in eukaryotic cells. Firstly, we developed a facile, efficient and mild strategy for the site-specific immobilization
of proteins on surfaces by means of oxyamine ligation to generate protein microarrays. In our strategy the proteins are first readily modified with oxyamine groups at the C-terminus and then immobilized on ketone-coated slides. This immobilization strategy proceeds efficiently at neutral conditions (pH 7.0), and is exceptionally mild for protein immobilization in comparison to other methods. Furthermore, this strategy enables the direct immobilization of
expressed proteins from crude cellular lysates without prior purification. The produced protein biochips can be used for the study of protein-protein interactions, as indicated by Rab-REP and PKA-antibody interaction studies. Our strategy expands the repertoire of protein immobilization methods and provides an alternative means to meet the various requirements for protein immobilization. Secondly, we presented the principle of using two chemoselective reactions to sitespecifically label a single protein in a one-pot reaction. We developed a general, facile and efficient strategy for N- and C-terminal dual-color labeling exemplified for the Rab7 protein using native chemical ligation and oxime ligation. The method is low in cost and easy to carry
out. The reaction conditions are biocompatible and mild enough for protein modifications. The strategy presented here could be a general method for generating dual-labeled proteins, which could also have a wide range of applications for studying protein functions at the single molecule and cellular level. We have shown the the produced protein probe can be used to
study protein refolding and protein-protein interactions by FRET studies. This study leads to the finding that both GDP and GppNHp can help GTPase to refold, and therefore point out a way to produce GppNHp-bound GTPase as indicated by successful semisynthesis of a RhoAGG
protein. Thirdly, we presented the principle of a FRET strategy for monitoring EF-mediated
nucleotide exchange using site-specifically labeled GEF and GTPase proteins. Using NCL
and oxime ligation, we prepared N-terminal coumarin-labeled GEFs and C-terminal fluorescein-labeled GTPases. We constructed the coumarin-GEF:GTPase-fluorescein complex, which showed a significant intermolecular FRET effect. The FRET signal was disrupted by binding of GDP or GTP and allowed direct detection of the GEF:GTPase interaction. Transient kinetic studies based on the FRET signal change were used to monitor the GEF activity and nucleotide binding. The studies led to a consistent conclusion on the
GEF mechanism involving allosteric competition between GDP/GTP and GEF’s interaction with a GTPase. The strategy presented here could be a general method that is applicable to other GEFs and GTPases, and may open up a new avenue for the identification of GEF inhibitors and for studying GEF mechanisms. Fourthly, we presented a general strategy using tandem EPL and click chemistry to sitespecifically
install hydrophobic GerGer modifications into proteins. The two-step ligation is
quantitative, which makes the purification of ligated protein much facile. The approach
yielded correctly folded and functional geranylgeranylated Rab GTPases, as could be inferred by their ability to interact with REP as well as to accept the second GerGer group in prenylation. The ligation strategy may open up a new avenue for production of lipoproteins that are used in various biological studies. Finally, we have used a facile method of oxime ligation to produce a series of PEGylated Rab protein probes for prenylation and localization studies. The replacement of Rab Cterminal region with an unnatural PEG moiety did not perturb Rab prenylation in vitro and in vivo. These results further elucidated the mechanism of Rab prenylation, i.e. there is no specificity required in Rab C-terminus hypervariable regions before and after the CIM motif for Rab prenylation. Using this series of Rab probes, we further investigated the issue that whether the C-terminal hypervariable region contributes to Rab targeting. We found that the
membrane targeting mechanisms for Rab-family proteins are more complex then previous
propose. For Rab1 and Rab5, the C-terminal hypervariable regions do not contribute to the membrane targeting. However, the replacement of C-terminal sequence with chemical linkers in several Rab proteins indeed disrupt their membrane targeting, implying that in these Rab proteins the C-terminal hypervariable region is important for biological function. This work
provides an example of chemical tools can be used to challenge native biomolecular functions, leading to better understanding the Rab prenylation and targeting mechanisms.2012-12-21T00:00:00ZSpatially resolved fluorescence correlation spectroscopy
http://hdl.handle.net/2003/29812
Title: Spatially resolved fluorescence correlation spectroscopy
Authors: Göllnitz, Thimo-Christian2012-12-05T00:00:00ZZelluläre Volumenregulation als Qualitätsparameter der Kryokonservierung sowie zur Identifizierung der molekularen Bestandteile des hyperton aktivierten Kationen Kanals
http://hdl.handle.net/2003/29600
Title: Zelluläre Volumenregulation als Qualitätsparameter der Kryokonservierung sowie zur Identifizierung der molekularen Bestandteile des hyperton aktivierten Kationen Kanals
Authors: Plettenberg-Halac, Sandra2012-08-30T00:00:00ZCharakterisierung und Stabilisierung von 14-3-3-Protein-Protein- Wechselwirkungen
http://hdl.handle.net/2003/29558
Title: Charakterisierung und Stabilisierung von 14-3-3-Protein-Protein- Wechselwirkungen
Authors: Molzan, Manuela
Abstract: Auf der Suche nach neuen PPI-Stabilisatoren müssen PPIs von Interesse zunächst umfassend
charakterisiert werden. Es gilt auÿerdem zu überprüfen, ob eine Stabilisierung
der untersuchten PPI pharmakologisch sinnvoll ist.
In der vorliegenden Arbeit wurden die Wechselwirkungen von 14-3-3-Proteinen mit
MLF1 und C-RAF mit biochemischen und strukturbiologischen Methoden charakterisiert.
Um zu überprüfen, ob eine Stabilisierung dieser Wechselwirkungen pharmakologisch
sinnvoll ist, wurde überdies mit zellbiologischen Methoden der physiologische Effekt
dieser Wechselwirkungen untersucht.
Basierend auf der im Vorfeld dieser Arbeit gelösten Röntgenkristallstruktur des Komplexes
aus 14-3-3e und MLF1(29-42)pS34 wurde die MLF1/14-3-3-Wechselwirkung mittels
ITC untersucht. Der erhaltene KD-Wert für das WT-MLF1-Peptid lag erwartungsgemäÿ
im niedrigen mikromolaren Bereich. Die Untersuchung verschiedener MLF1-Mutanten
zeigte, dass neben dem pS34 nur das F33 einen signifikanten Beitrag zur Bindung an
14-3-3-Proteine leistet. Weiterhin wurde durch den Einsatz von GFP-MLF1-Fusionsproteinen
die subzelluläre Lokalisation des humanen MLF1-Proteins in HEK293T-Zellen
auf eine direkte 14-3-3-Abhängigkeit untersucht, wie sie von Winteringham et al. (2006)
für murines MLF1 in Cos-7-Zellen beobachtet wurde. Es zeigte sich jedoch, dass die
subzelluläre Lokalisation von humanem MLF1 in HEK293T-Zellen nicht direkt 14-3-3-
abhängig ist und der von Winteringham et al. (2006) vorgeschlagene Mechanismus zur
Regulation von murinem MLF1 durch 14-3-3-Proteine nicht direkt auf das humane Homolog
übertragbar ist.
Die S259-vermittelte C-RAF/14-3-3-Wechselwirkung wurde im Vorfeld dieser Arbeit
bereits intensiv mit strukturbiologischen, biochemischen und zellbiologischen Methoden
charakterisiert. Daher wurde in der vorliegenden Arbeit der physiologische Effekt
von Mutationen der 14-3-3-Bindestelle um S259, wie sie in Noonan- und LEOPARDSyndromen
gefunden wurden, untersucht. Es konnte nachgewiesen werden, dass diese
Mutationen aktivierend auf den RAS-RAF-MEK-ERK-Signalweg wirken. Diese Auswirkung
konnte bereits für die anderen, in Noonan-und LEOPARD mutierten Gene,
PTPN11, SOS1 und KRAS, gezeigt werden (Tartaglia et al., 2001; Carta et al., 2006;
Schubbert et al., 2006; Roberts et al., 2007; Tartaglia et al., 2007). Es zeigte sich weiterhin,
dass die eingesetzten, C-terminal verkürzten C-RAF-Mutanten keinen Einfluss auf
die subzelluläre Lokalisation der endogenen C-RAF-Proteine hatten. Dieses Ergebnis bekr
äftigt die These, dass C-RAF-Proteine über ihren C-terminalen Bereich dimerisieren
(Weber et al., 2001; Rushworth et al., 2006).
Die biochemische Untersuchung der S233-vermittelten C-RAF/14-3-3-Wechselwirkung
zeigte, dass 14-3-3-Proteine sowohl über S233 als auch gleichzeitig über S233 und S259
an C-RAF binden können. Die S233-vermittelte Bindung ist dabei deutlich schwächer
als die S259-vermittelte Bindung. Eine gleichzeitige Bindung über S233 und S259 wirkt
synergistisch und erhöht die Affinität deutlich. Die Messung der Bindungsstöchiometrie
(N) von 14-3-3? an das C-RAF(229-264)pS233,pS259-Diphosphopeptid über ITC und FP
ergab einen Wert von N ˜ 1 bezogen auf ein 14-3-3-Dimer. Die strukturbiologische Untersuchung
legte eine Bindung des C-RAF(229-264)pS233,pS259-Diphosphopeptids an ein
14-3-3?-Dimer in einer cis-Konformation nahe, wobei eine Bindung an zwei Dimere in
trans nicht ausgeschlossen werden kann. Zellbiologische Untersuchungen zeigten, dass
GFP-C-RAF300?C sowohl über die S259- als auch die S233-vermittelte 14-3-3-Wechselwirkung
in unstimulierten Zellen im CP gehalten wird. Eine Störung dieser Wechselwirkung
hat eine Translokation des GFP-C-RAF300?C-Proteins zur Folge und führt zu
einer Co-Lokalisation mit H-RAS an der PM.
Aufgrund der durch die Charakterisierung der C-RAF/14-3-3-Wechselwirkung gewonnenen
Erkenntnisse erscheint eine Stabilisierung der gleichzeitig über S233- und
S259-vermittelten C-RAF/14-3-3-Wechselwirkung pharmakologisch sinnvoll. Es wurde
daher nach einem möglichen Stabilisator gesucht. Der bisher einzige bekannte Stabilisator
von 14-3-3-Protein-Wechselwirkungen, FCA (Ottmann et al., 2007a), hatte jedoch
keinen stabilisierenden Effekt auf die S233- und S259-vermittelte C-RAF/14-3-3-
Wechselwirkung. Da das strukturell verwandte Molekül CNA an einen Komplex aus
einem C-RAF(255-265)pS259,M265A-Peptid und dem pflanzlichen 14-3-3c binden kann
(Ottmann et al., 2009), wurde es auf seine stabilisierende Wirkung hin untersucht. CNA
stabilisiert demnach sowohl die S233- und die S259-vermittelte als auch die über beide
14-3-3-Bindestellen gleichzeitig vermittelte C-RAF/14-3-3-Wechselwirkung. Auf die aktivierende
S621-vermittelte C-RAF/14-3-3-Wechselwirkung hat es keinen Einfluss, was
durch FP und strukturbiologische Methoden belegt werden konnte.
Zusammengefasst konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass die Stabilisierung
der MLF1/14-3-3-Wechselwirkung pharmakologisch nicht sinnvoll ist. Die
Stabilisierung der S233- und S259-vermittelten C-RAF/14-3-3-Wechselwirkung dagegen
kann als pharmakologisch sinnvoll eingestuft eingestuft werden und ein erster Stabilisator,
CNA, wurde identifiziert und sowohl biochemisch als auch strukturbiologisch
charakterisiert. Die Untersuchungen zeigten, dass CNA die S233- und S259-vermittelten
C-RAF/14-3-3-Wechselwirkungen sowohl einzeln als auch gleichzeitig stabilisieren kann,
aber auf die aktivierende, S621-vermittelte C-RAF/14-3-3-Wechselwirkung keinen Ein-
fluss hat.2012-07-19T00:00:00ZStrukturelle und biophysikalische Untersuchungen der regulatorischen Domäne von humanem Nalp1
http://hdl.handle.net/2003/29555
Title: Strukturelle und biophysikalische Untersuchungen der regulatorischen Domäne von humanem Nalp1
Authors: Hahne, Gernot
Abstract: Das 166 kD schwere Protein Nalp1 gehört zur Familie der Nod-ähnlichen Rezeptoren
(NLR), die eine wichtige Rolle im angeborenen Immunsystem spielen. Als intrazelluläre
Rezeptoren erkennen sie Pathogene, die bereits in die Zelle eingedrungen sind. Nach der
Aktivierung durch Pathogen-assoziierte molekulare Strukturen setzen die Nod-ähnlichen
Rezeptoren über einen bislang wenig erklärten Mechanismus Entzündungsreaktionen in
Gang.
Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Kristallstruktur der LRR-Domäne von humanem
Nalp1 bis zu einer Auflösung von 1.65 Å aufgeklärt werden. Diese Kristallstruktur liefert die
erste dreidimensionale Beschreibung der regulatorischen Domäne eines Nod-ähnlichen
Rezeptors. Die Struktur zeigt, dass die LRR-Domäne von Nalp1 aus sechs vollständigen
Leucin-reichen Wiederholungen besteht, die aus insgesamt sieben α-Helices und sieben
β-Strängen geformt werden. Durch den geometrischen Vergleich mit LRR-Domänen anderer
Proteine konnte die LRR-Domäne von Nalp1 der RI-ähnlichen Unterfamilie von LRR
Proteinen zugeordnet werden.
Unter Verwendung unterschiedlicher biophysikalischer Methoden wurde untersucht,
ob Muramyldipeptid (MDP) an die isolierte LRR-Domäne von humanem Nalp1 bindet. In der
Literatur ist MDP als Pathogen-assoziierte molekulare Struktur beschrieben worden, die
in vitro den Rezeptor aktiviert. Ligandenbindungsstudien über Isothermale Titrationskaloriemetrie,
Fern-UV CD Spektroskopie sowie Fluoreszenz- und Polarisationsspektroskopie
zeigten keine Interaktion zwischen MDP und der LRR-Domäne von humanem Nalp1.
Aus den Ergebnissen dieser Arbeit kann für den Aktivierungsmechanismus des
humanen Nalp1 gefolgert werden, dass die LRR-Domäne des Rezeptors alleine nicht
ausreichend ist für die Bindung des Liganden.2012-07-19T00:00:00ZPeptidinhibitoren der Transpeptidase Sortase A aus Staphylococcus aureus und Untersuchungen zur Ovothiol A-Biosynthese in Erwinia tasmaniensis
http://hdl.handle.net/2003/29475
Title: Peptidinhibitoren der Transpeptidase Sortase A aus Staphylococcus aureus und Untersuchungen zur Ovothiol A-Biosynthese in Erwinia tasmaniensis
Authors: Braunshausen, Andrea
Abstract: Sortase A Inhibitoren: Sortase A (SrtA) aus Staphylococcus aureus ist eine membranverankerte Transpeptidase, welche Vorläufermoleküle oberflächenassoziierter Virulenzfaktoren anhand des Motivs LPXTG erkennt und an der Zelloberfläche verankert. In der vorliegenden Arbeit wurden dem LPXTG-Motiv ähnelnde zyklische Peptidsequenzen hinsichtlich ihrer Interaktion mit SrtA charakterisiert. Ein besonderes Augenmerk lag dabei auf der Relevanz der Peptidzyklisierung für diese Interaktion. Die untersuchten Peptidsequenzen wurden eindeutig als SrtA-Inhibitoren klassifiziert. Es wurden hierzu in vitro Methoden zur Ermittlung der Kd-Werte (10 -94 nM), thermodynamischen Bindungsparameter (ΔH = 10,2 kcal/mol, -TΔS = 0,3 kcal/mol), Bindungsstöchiometrien (N = 1), IC50-Werte (0,4 – 3,7 µM) und des Inhibitionsmechanismuses (langsam reversibel) entwickelt. Zudem wurde ein Flüssigkultur-Assay zur Quantifizierung der in vivo-Bindung der Peptidinhibitoren an S. aureus-Zellen etabliert. Es wurde gezeigt, dass die in vitro Eigenschaften der Untersuchten SrtA-Inhibitoren unbeeinflusst von der Peptidzyklisierung sind. Die in vivo Bindungsaffinität wird hingegen von einer vorhandenen Peptidzyklisierung erhöht.
Ovothiol A-Biosynthese: Die Ovothiol A-Biosynthese in E. tasmaniensis beruht auf drei enzymatischen Schritten, einer Synthese, einer ß-Elimination und einer Methylierung (Vogt et al., 2001). In der vorliegenden Arbeit wurden die Produkte eines Ovothiol A Sulfoxidsynthase Gens (OvoA) und eines Ovothiol A ß-Lyase Gens (OvoB) aus E. tasmaniensis charakterisiert. Dem Motiv His170-X3-His174-X-Glu176 der OvoA konnte die Funktion der Eisenkoordination zugewiesen werden. Hierzu wurden die Enzymmutanten OvoAH170A, OvoAH174A und OvoAE176A hergestellt und gezeigt, dass sie jeweils einen vollständigen Aktivitätsverlust aufweisen. Ergänzend wurde die Relevanz des in OvoA konservierten Arg183 untersucht. Hierzu wurden die Mutanten OvoAR183A und OvoAR183K hergestellt. OvoAR183A zeigte einen vollständigen Aktivitätsverlust und OvoAR183K einen erheblichen Aktivitätsverlust. Vermutlich sind an Position 183 also positive Ladungen erforderlich. Für OvoB wurden die Umsatzraten für diverse Substrate bestimmt. Das von OvoA gelieferte Intermediat wurde mit der höchsten Effizienz von OvoB umgesetzt. Es lässt sich schließen, dass es sich bei dem untersuchten Enzym um die gesucht ß-Lyase der Ovothiol A-Biosynthese handelt und diese jedoch eine geringe Substratspezifität aufweist.2012-06-12T00:00:00ZDynamic chromatin association of RCC1 during the cell cycle
http://hdl.handle.net/2003/28351
Title: Dynamic chromatin association of RCC1 during the cell cycle
Authors: Bierbaum, Martin
Abstract: Ein räumlicher Aktivitätsgradient des kleinen G-Proteins Ran ist ein bedeutender Kontrollmechanismus
von grundlegenden zellulären Prozessen wie dem Transport zwischen
Kern und Cytoplasma, dem Aufbau des mitotischen Spindelapparats und der Bildung
der Kernhülle. Die Entstehung dieses Gradienten verlangt eine räumliche Trennung
der entgegenwirkenden enzymatischen Aktiviäten des Ran-spezifischen Guaninnukleotid-
Austauschfaktors RCC1 und des Ran-spezifischen GTPase aktivierenden Proteins Ran-
GAP. Die Interaktion von RCC1 mit Chromatin ist eine Vorraussetzung hierfür, indem
sie RCC1 von dem sich im Cytoplasma befindlichen RanGAP trennt. Darüber hinaus beein
usst die Chromatininteraktion möglicherweise die enzymatische Aktivität von RCC1
und bewirkt eine räumliche Kopplung der Reaktion zwischen Ran und RCC1 an Chromatin.
Die Regulation der Chromatininteraktion von RCC1 ist deswegen ein potentieller
Mechanismus, die Aktivierung von Ran in Abhängigkeit des Zellzyklus zu regulieren.
Um diese Hypothese zu überprüfen, wird in der vorliegenden Arbeit eine Untersuchung
der kinetischen Eigenschaften der Chromatininteraktion von RCC1 durchgeführt.
Die Messung der Mobilität von RCC1 auf molekularer Ebene durch Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie
(FCS) erlaubt Rückschlüsse auf den Mechanismus der Chromatininteraktion.
Ein Vergleich der Verteilung von RCC1 zwischen Chromatin und Zytoplasma
und der durch FCS gemessen Mobilität zeigt, dass an Chromatin gebundenes RCC1
zwei verschiedene Mobilitätszustände einnehmen kann. Es kann unterschieden werden
zwischen RCC1, das in einem eindimensionalen Prozess entlang der Chromatinfaser diffundiert,
und RCC1, das für einen kurzen Zeitraum an spezifischen Stellen gebunden ist.
Die quantitative Analyse der FCS-Messungen ermöglicht eine Bestimmung der Di usionkonstante
des mobilen Zustands sowie der Dissoziationsrate des gebundenen Zustands.
Durch Messung der Mobilität von Ran wird gezeigt, dass die Interaktionskinetik zwischen
Ran und Chromatin mit der Reaktionskinetik zwischen Ran und RCC1 korreliert.
Weiterhin stärken Messungen der Interaktion von Ran und RCC1 mittels Fluoreszenzkreuzkorrelationsspektroskopie
(FCCS) die Hypothese, dass die Reaktion zwischen beiden
Proteinen an Chromatin gekoppelt ist. Insbesondere weisen die hier vorgestellten Ergebnisse darauf hin, dass der binäre Komplex zwischen Ran und RCC1, ein wichtiges
enzymatisches Intermediat, an Chromatin gebunden ist.
Der Vergleich zwischen Mobilitätsmessungen während der Interphase und während der
Zellteilung demonstriert eine zellzyklusabhängige Regulation der Chromatininteraktion
von RCC1. Diese äu ert sich in einer verringerten Dissoziationsrate des fest gebundenden
Zustands von RCC1. Des Weiteren kann während der Zellteilung eine verringerte
Interaktion zwischen RCC1 und Ran gemessen werden. Hieraus wird abschlie end die
Hypothese abgeleitet, dass durch eine Regulation der Bindungseigenschaften des fest gebundenen
Zustands von RCC1 eine Verringerung der Reaktionsrate zwischen Ran und
RCC1 erreicht wird.2011-06-16T00:00:00ZDevelopment of a FRET-Based Fluorescent Biosensor for ERK2 Activity
http://hdl.handle.net/2003/28350
Title: Development of a FRET-Based Fluorescent Biosensor for ERK2 Activity
Authors: Klüßendorf, Thies
Abstract: Die dynamischen Eigenschaften von biologischen Systemen sind das Ergebnis der
zugrundliegenden dynamischen Wechselbeziehungen der individuellen Komponenten. Die
Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK)-Kaskade ist ein evolutionär konserviertes Signalweiterleitungsmodul,
das das Schicksal von Zellen wie Wachstum oder Differenzierung
reguliert. Die Aktivierung von Extracellular Signal-Regulated Kinase 2 (ERK2) folgt einer
komplexen zeitlichen und räumlichen Dynamik, die eine wichtige Rolle für bestimmte
nachgeordnete Signaleffekte spielt. Eine der Hauptherausforderungen für das Verständnis
von MAPK Signalweiterleitung und der Mechanismen, die Signalweiterleitung innerhalb der
Zelle ermöglichen, ist der Mangel an Methoden um Kinase-Aktivität mit hoher zeitlicher und
räumlicher Auflösung in lebenden Zellen zu erfassen. Während traditionelle, biochemische
Methoden auf Messungen von Durchschnittswerten aus einer Vielzahl von Zellen begrenzt
sind, haben bereits veröffentlichte, auf FRET basierende Biosensoren für ERK2-Aktivität
mehrere schwere Nachteile wie die nur indirekte Ermittlung von ERK2-Aktivität über die
Phosphorylierung eines Substrats oder über eine Konformationsänderung, einen niedrigen,
dynamischen Messbereich und ungenügende räumliche Auflösung (Fujioka et al., 2006;
Sato et al., 2007; Harvey et al., 2008a). Deshalb wurde in der vorliegenden Arbeit eine
Methode entwickelt, um ERK2-Aktivität in einzelnen Zellen mit hoher zeitlicher und
räumlicher Auflösung und einem grossen dynamischen Messbereich sichtbar zu machen
und zu quantifizieren.
Der direkteste Ansatz um Kinase-Aktivität in lebenden Zellen zu messen ist die
Sichtbarmachung von kurzlebigen Enzym-Substrat (ES) Wechselwirkungen. Die Bildung
eines ES-Komplexes kann über die Messung von Förster-Resonanzenergietransfer/
Fluoreszenzlebenszeiten (FRET/FLIM) zwischen einer Donor-markierten Kinase und
einem Akzeptor-markierten Substratpeptid nachgewiesen werden (Yudushkin et al., 2007).
Allerdings sind FLIM-Methoden auf ein grossen Anteil an Donormolekülen angewiesen, die
FRET eingehen (d.h. einen hohen Anteil an Enzym im Komplex mit seinem Substrat) und
kurze Peptide aus bekannten ERK2-Substraten haben KM-Werte in einem Bereich von 100
μM - 1 mM. Es ist deshalb schwierig, ausreichend hohe Substratkonzentration innerhalb
von Zellen zu erreichen.
In einem Versuch, die lokale Substratkonzentration zu erhöhen, wurde das Substratpeptid
über einen flexiblen Peptidlinker mit ERK2 verbunden. Der Aufbau von ERK2 Activity
Sensor 4 (EAS4) sollte prinzipiell auf alle Kinasen anwendbar sein. Er basiert auf der reversiblen
Bindung und Phosphorylierung eines kurzen Substratpeptids durch die untersuchte
Kinase. Die Bindung des Substratpeptids im aktiven Zentrum der Kinase verursacht eine
umfassende Konformationsänderung von EAS4, die über eine Änderung des FRET-Signals
erfasst werden kann, das durch Anhängen eines FRET-Paares fluoreszierender Protein
erzielt wird. Deshalb ist dieser neu entwickelte, auf FRET basierende, fluoreszierende
ERK2-Biosensor der Erste, der direkte Kinase-Aktivität in Raum und Zeit anzeigt, indem
kurzlebige ES-Wechselwirkungen sichtbar gemacht werden. EAS4 zeichnet sich ausserdem
durch einen dynamischen Messbereich und eine räumliche Auflösung aus, die zuvor
veröffentlichten ERK2 Biosensoren überlegen ist. Zusätzlich konnte mit Hilfe von EAS4
gezeigt werden, dass Heregulin (HRG)-vermittelte, anhaltende ERK Aktivität in MCF-7
Zellen vornehmlich im Zytosol zu finden ist, während HRG-vermittelte ERK2-Aktivität im
Zellkern sowie EGF-vermittelte ERK2-Aktivität transient ist. Dies zeigt das Potential von
EAS4 für die weitere Untersuchung von biologischen Fragestellungen.2011-06-16T00:00:00ZUntersuchungen zum Einfluss der GPI-Verankerung auf das Faltungsverhalten des Prion Proteins
http://hdl.handle.net/2003/27587
Title: Untersuchungen zum Einfluss der GPI-Verankerung auf das Faltungsverhalten des Prion Proteins
Authors: Schumacher, Miria C.
Abstract: Viele eukaryontische Oberflächenproteine sind mit einem GPI-Anker modifiziert. Inzwischen sind mehr als 200 dieser posttranslational veränderten Proteine bekannt. Ein wichtiges Beispiel ist das Prion Protein, dem Auslöser der Prion-Erkrankung. Die Missfaltung des zellulären Prion Proteins (PrPC) in seine pathogene Isoform PrPSc spielt eine zentrale Rolle bei der Pathogenese von BSE oder Creutzfeld-Jakob. Die Verankerung des Proteins auf der Außenseite der Zelle mittels GPI-Anker stellt eine wichtige Komponente für die Infektiösität der Erkrankung dar.
Da die Isolation von homogen GPI-verankerten Prion Protein bis jetzt nicht möglich ist, wurden die meisten Transmissionsexperimente mit rekombinant hergestellten Prion Proteinen ohne GPI-Verankerung oder heterogenen Proteinpräparationen aus mammalischen Zelllinien durchgeführt. Um einen Zugang zu homogen GPI-verankertem, rekombinant hergestelltem Prion Protein zu erhalten, wurde in der vorliegenden Arbeit Saccharomyces cerevisiae als Modellsystem benutzt. Durch die Verwendung hefespezifischer Signalsequenzen für den ER-Import und die GPI-Verankerung, erhält man posttranslational modifiziertes Protein (GFP-GPI und PrP-GPI).
Daraus ließ sich eine allgemeine Methode zur Isolation eines GPI-verankerten Peptids mit N-terminalem Cystein etablieren. Dieser Baustein wurde für die GPI-Verankerung eines in E. coli exprimierten Prion Proteins (recPrP) unter Verwendung der Expressed Protein Ligation (EPL) genutzt. Die in Hefe exprimierten Proteine (GFP-GPI bzw. PrP-GPI) wurden mit TEV-Protease gespalten und das entstandene GPI-Peptid mittels Covalent Capture Beads aufgereinigt. Durch MALDI-MS wurde die Struktur des GPI-Ankers bestimmt. Das erhaltene GPI-Synthon konnte anschließend erfolgreich an ein Testpeptid ligiert werden. Die Modifikation eines rekombinant in E. coli exprimierten Prion Proteins war durch EPL nicht möglich.
Mit Hilfe des Prozesses des Protein Trans-Spleißens wurde das recPrP jedoch in vivo mit einem GPI-Anker modifiziert und stabil auf die Plasmamembran von Hefezellen, sowie murinen Neuroblastomazellen übertragen. Der anschließende Nachweis mit Immunofluoreszenz zeigte dabei die Lokalisation des Proteins auf der Außenseite der Zellen und entsprach somit dem Lokalisationsmuster des PrPC.
Der Einfluss der GPI-Verankerung, sowie des N Terminus auf das Aggregationsverhalten des Prion Proteins (PrP-GPI) wurde untersucht. Hierbei konnte ebenfalls die Verankerung des Proteins auf der Außenseite der Plasmamembran mittels Immunofluoreszenz, sowohl in Hefezellen als auch in N2a Zellen, nachgewiesen werden. Um zu verifizieren, dass es sich um eine Verankerung des Proteins auf der Zellaußenseite mittels GPI-Anker handelt, wurden N2a-Zellen mit phosphatidyl-inositolspezifischer Phospholipase C inkubiert. Dies führte zu einer Freisetzung der Proteine von der Zelloberfläche in das Medium und lieferte den Beweis für die Membranverankerung durch den GPI-Anker.
Durch die Bodipy®-Markierung am freien Cystein des PrP-GPI war es ebenfalls möglich, die Internalisierung des Proteins in N2a-Zellen nachzuweisen. Hierbei zeigte sich bereits nach fünf Minuten eine Aufnahme des GPI-verankerten Proteins von der Außenseite der Zelle ins Zellinnere.
Ein weiterer Teil der Arbeit befasste sich mit der biophysikalischen Charakterisierung der Umfaltung des PrP-GPI. Unter Verwendung von DLS, GFC und ThT-Test konnte gezeigt werden, dass der pH-Wert des eingesetzten Puffers die Bildung von Oligomeren und Fibrillen beeinflusst. So war die Oligomerisierung des PrP-GPI bei einem pH-Wert des Puffers = 5 gegenüber der Fibrillenbildung begünstigt. Hierbei konnte kein Einfluss des GPI-Ankers auf den Aggregationsprozess festgestellt werden. Allerdings zeigte das PrP-GPI (23-231) im Gegensatz zu PrP ohne N-Terminus (90-231) die Ausbildung mehrerer oligomerer Spezies.
Die semisynthetische Darstellung des Prion Proteins mit einem nativen GPI-Anker, sowie die Expression von hmPrP in S. cerevisiae mit den bekannten posttranslationalen Modifikationen (N-Glykane und GPI-Verankerungen) bieten die Möglichkeit, die PrPC-PrPSc-Konversion in neuronalen Maus-Zellen (N2a-Zellen) genauer zu charakterisieren. So kann unter anderem der Einfluss der GPI-Verankerung auf die Umfaltungsreaktion durch die Verwendung der semisynthetischen Methoden, unabhängig von der Seitenketten-Glykosylierung untersucht werden. Ferner können die so dargestellten Proteine chemisch modifiziert werden, um die Internalisierung des PrP-GPI und die Umfaltungsreaktion von endogenem PrPC in vivo zu analysieren.2011-01-25T00:00:00ZEtablierung von Testverfahren zur Evaluation niedermolekularer Modulatoren des Wnt-Signalwegs und anderer biologischer Prozesse
http://hdl.handle.net/2003/27364
Title: Etablierung von Testverfahren zur Evaluation niedermolekularer Modulatoren des Wnt-Signalwegs und anderer biologischer Prozesse
Authors: Ellinger, Bernhard2010-08-10T00:00:00ZStrukturelle und funktionelle Untersuchungen zur Regulation des Transkriptionsfaktors P-TEFb
http://hdl.handle.net/2003/27345
Title: Strukturelle und funktionelle Untersuchungen zur Regulation des Transkriptionsfaktors P-TEFb
Authors: Vollmuth, Friederike2010-08-09T00:00:00ZCharacterization of the Sensory Rhodopsin II / Transducer II complex from Halobacterium salinarum
http://hdl.handle.net/2003/27284
Title: Characterization of the Sensory Rhodopsin II / Transducer II complex from Halobacterium salinarum
Authors: Kim, Young Jun
Abstract: Motile bacteria respond to a variety of external stimuli by modulating the
rotational direction of their flagella. Flagella driven motility is a necessity for
coping with changing environments such as the decrease or increase of
specific signaling molecules (chemotaxis), changes in the salinity (osmotaxis),
temperature (thermotaxis), light intensity (phototaxis) and oxygen (aerotaxis)
(1-3). Based on well-known chemotactic mechanisms in E. coli, signal transfer
models of the events derived from chemoreceptor activation, achieve
remarkable sensitivity, gain, dynamic range, and feedback control through the
transmembrane signaling domain(4-10). Most of our knowledge on
chemotaxis transducers is derived from the membrane-bound chemoreceptor
proteins of bacteria (11,12). E. coli apparently evolved in an environment
where sugars and amino acids served as energy sources. Therefore
receptors to sense such substances are found in its inner membrane. Some
ligands interact directly with the receptors in periplasmic space, such as
serine with Tsr or aspartate with Tar, while ligand binding triggers a structural
rearrangement of the binding protein, which allows the subsequent interaction
with the receptor. Maltose, for example, is sensed by Tar through interaction
with the maltose binding protein(13,14).2010-07-01T00:00:00ZUntersuchung Naturstoff-basierter Substanzklassen als chemische Modulatoren für biolobische Prozesse mit Hilfe des vorwärts-, sowie rückwärtsgerichteten chemisch-genetischen Ansatzes
http://hdl.handle.net/2003/27169
Title: Untersuchung Naturstoff-basierter Substanzklassen als chemische Modulatoren für biolobische Prozesse mit Hilfe des vorwärts-, sowie rückwärtsgerichteten chemisch-genetischen Ansatzes
Authors: Warburg, Karin2010-05-12T07:33:29ZSynthetic and structure-activity studies of the 20S proteasome inhibitor Syringolin A
http://hdl.handle.net/2003/27129
Title: Synthetic and structure-activity studies of the 20S proteasome inhibitor Syringolin A
Authors: Clerc, Jérôme2010-05-03T14:05:37ZBiologie-orientierte Synthese (BIOS) von naturstoffabgeleiteten Substanzbibliotheken und deren biologische Evaluierung
http://hdl.handle.net/2003/27015
Title: Biologie-orientierte Synthese (BIOS) von naturstoffabgeleiteten Substanzbibliotheken und deren biologische Evaluierung
Authors: Wilk, Wolfram2010-03-31T09:28:08ZAssessment of Pseudomonas quinolone signal response protein PqsE and preliminary functional annotation of hypothetical protein PA0803 from Pseudomonas aeruginosa
http://hdl.handle.net/2003/27005
Title: Assessment of Pseudomonas quinolone signal response protein PqsE and preliminary functional annotation of hypothetical protein PA0803 from Pseudomonas aeruginosa
Authors: Yu, Shen2010-03-30T11:47:10ZSelektive Markierung von cysteinhaltigen Domänen und Proteinen mit ESR-Sonden
http://hdl.handle.net/2003/26992
Title: Selektive Markierung von cysteinhaltigen Domänen und Proteinen mit ESR-Sonden
Authors: Lausecker, Kester
Abstract: Die Markierung von Proteinen mit physikalischen Sonden ist eine technische Herausforderung. Hierzu wurden eine Vielzahl teils aufwendiger Methoden entwickelt. Die derzeitige Standardmethode zur ESR Markierung von Proteinen ist das site directed spin labeling (SDSL). In dieser Arbeit wurde eine Alternative zum SDSL entwickelt. Als Methode zur Markierung wurde eine Kombination aus Festphasensynthese von Peptide und chemischer Ligation (NCL & EPL) verwendet. Der notwendig kompatible ESR Marker wurde entwickelt und in guten Ausbeuten synthetisiert. Der ESR Marker konnte in Peptide eingebracht und in den biologischen Systemen RBD/Ras und HtrII/SRII verwendet werden.; Labeling of proteins with biophysical probes is a technical challenge. A large number of methods have been developed recently. The standard method for EPR labeling of proteins is site directed spin labeling (SDSL). An alternative for SDSL is shown here. The methods of choice for labeling of peptides are solid phase peptide synthesis and chemical ligation methods (NCL & EPL). A compatible EPR probe was synthesized in good yields. The EPR label was incorporated in peptides and the biological systems RBD/Ras and HtrII/SRII.2010-03-16T11:56:17ZSynthese und biophysikalische Evaluierung von H- und K-Ras-Proteinen sowie Arbeiten zur Aufklärung des Protein-Acylierungskreislaufes
http://hdl.handle.net/2003/26639
Title: Synthese und biophysikalische Evaluierung von H- und K-Ras-Proteinen sowie Arbeiten zur Aufklärung des Protein-Acylierungskreislaufes
Authors: Koch, Sebastian2010-02-02T13:28:57ZBiaryl ether formation on peptides to access bridged cyclopeptide natural product scaffolds
http://hdl.handle.net/2003/26625
Title: Biaryl ether formation on peptides to access bridged cyclopeptide natural product scaffolds
Authors: Kilitoglu, Bahar2010-01-19T14:11:53ZKommunikation zwischen Signalwegen: Regulatoren und Effektoren von G Proteinen der RAS-Superfamilie
http://hdl.handle.net/2003/26517
Title: Kommunikation zwischen Signalwegen: Regulatoren und Effektoren von G Proteinen der RAS-Superfamilie
Authors: Gasper-Schönenbrücher, Raphael2009-11-10T11:30:03ZSimilarity in chemical and protein space
http://hdl.handle.net/2003/26470
Title: Similarity in chemical and protein space
Authors: Wetzel, Stefan2009-10-27T11:29:06ZDesign and synthesis of activity-based probes(ABPs), adaption of activity-based protein profiling (ABPP) for plant proteomes studies
http://hdl.handle.net/2003/26434
Title: Design and synthesis of activity-based probes(ABPs), adaption of activity-based protein profiling (ABPP) for plant proteomes studies
Authors: Wang, Zhe Ming2009-09-29T12:43:39ZBiochemische Untersuchungen zur Regulation der Translriptionselongation durch Hexim und 7SK snRNA
http://hdl.handle.net/2003/26398
Title: Biochemische Untersuchungen zur Regulation der Translriptionselongation durch Hexim und 7SK snRNA
Authors: Czudnochowski, Nadine2009-09-11T10:20:16ZDevelopment of a Hetero-Diels-Alder reaction to synthesize 3-hydroxypyridines and its application toward the total synthesis of nosiheptide
http://hdl.handle.net/2003/26214
Title: Development of a Hetero-Diels-Alder reaction to synthesize 3-hydroxypyridines and its application toward the total synthesis of nosiheptide
Authors: Lu, Jin-Yong2009-07-06T09:27:03ZProtein prenylation reactions as tools for site-specific protein labeling and identification of prenylation substrates
http://hdl.handle.net/2003/26210
Title: Protein prenylation reactions as tools for site-specific protein labeling and identification of prenylation substrates
Authors: Nguyen, Thi Thanh Uyen2009-07-01T10:42:02ZStudies on the structure and function of phenazine modifying enzymes PhzM and PhzS involved in the biosynthesis of pyocyanin
http://hdl.handle.net/2003/26205
Title: Studies on the structure and function of phenazine modifying enzymes PhzM and PhzS involved in the biosynthesis of pyocyanin
Authors: Gohain, Neelakshi2009-06-29T09:48:19ZSynthese und Struktur-Wirkungs-Beziehung von Brunsvicamid-Analoga
http://hdl.handle.net/2003/26188
Title: Synthese und Struktur-Wirkungs-Beziehung von Brunsvicamid-Analoga
Authors: Walther, Thilo2009-06-09T12:02:37ZSynthese einer Kollektion von 3-Acyltetramsäuren und Identifizierung der Zielproteine von Melophlin A
http://hdl.handle.net/2003/26185
Title: Synthese einer Kollektion von 3-Acyltetramsäuren und Identifizierung der Zielproteine von Melophlin A
Authors: Knoth, Tanja2009-06-03T10:26:22ZSupramolecular multivalency
http://hdl.handle.net/2003/26101
Title: Supramolecular multivalency
Authors: Müller, Marion K.2009-05-06T10:21:01ZAufbau von 5-Ring-Heterozyklen durch Aza-Witting-Ringschlüsse
http://hdl.handle.net/2003/26074
Title: Aufbau von 5-Ring-Heterozyklen durch Aza-Witting-Ringschlüsse
Authors: Riedrich, Matthias2009-04-01T10:11:48ZTotalsynthese von Jaspakinolid und Analoga
http://hdl.handle.net/2003/26073
Title: Totalsynthese von Jaspakinolid und Analoga
Authors: Tannert, René2009-04-01T10:11:21ZSemisynthesis of light switchable human STAT6 variants and their characterization
http://hdl.handle.net/2003/26059
Title: Semisynthesis of light switchable human STAT6 variants and their characterization
Authors: Lahiri, Sunanda2009-03-20T13:14:52ZAnalyse der Membranbindung von HIV-1 Nef SF2
http://hdl.handle.net/2003/25981
Title: Analyse der Membranbindung von HIV-1 Nef SF2
Authors: Gerlach, Holger2009-01-08T09:22:45ZUntersuchung der Struktur und Funktion von Sieben-Helix-Membranrezeptoren
http://hdl.handle.net/2003/25842
Title: Untersuchung der Struktur und Funktion von Sieben-Helix-Membranrezeptoren
Authors: Martell, Swetlana2008-11-18T10:32:00ZSynthese und Konformationsanalyse von Stevastelin C3 Analoga als Phosphataseinhibitoren
http://hdl.handle.net/2003/25827
Title: Synthese und Konformationsanalyse von Stevastelin C3 Analoga als Phosphataseinhibitoren
Authors: Bisek, Nicola2008-11-04T11:28:14ZStructural studies of the Rab prenylation mechanism and of RabGGTase in complex with inhitors
http://hdl.handle.net/2003/25778
Title: Structural studies of the Rab prenylation mechanism and of RabGGTase in complex with inhitors
Authors: Guo, Zhong2008-08-25T13:45:01ZThe School of Hard Nox: Characterization of human Nox1 and cyclized Rab7
http://hdl.handle.net/2003/25773
Title: The School of Hard Nox: Characterization of human Nox1 and cyclized Rab7
Authors: Woo, Tammy T.
Abstract: Deliberate enzymatic production of superoxide (O2.-) was originally thought to be restricted to the membrane-associated multi-subunit NADPH Oxidase in phagocytic cells, which use superoxide as a precursor to secondary reactive oxygen species (ROS) to destroy engulfed pathogens as a part of innate immunity. Recent discovery in nonphagocytic tissues of an entire family of proteins (Nox) homologous to the catalytic subunit of the phagocytic NADPH Oxidase has led to the recognition of the role of ROS in normal cellular signaling, with an increasing awareness of the pathological consequences when this signaling becomes dysregulated. These Nox proteins normally produce low-level, intracellular superoxide, although many factors can stimulate their activity. Nox1 has emerged as a key oxidase in the vasculature with the discovery that factors which promote vascular disease additionally stimulate its activity. Knowledge of the three-dimensional structure of the holoenzyme or of the cytosolic domain, which catalyzes the first electron transfer step, could aid in the design of specific inhibitors as novel therapeutics. In this work, methods were developed to produce recombinant human Nox1 suitable for structure determination by X-ray crystallography. Investigations to promote the heterologous expression of recombinant full-length human Nox1 in E. coli did not result in observable overexpression. In contrast, four constructs containing the cytosolic domain of human Nox1 were solubly expressed in low amounts. Expression and purification protocols were developed for these constructs. Of these, an N-terminally His-tagged truncated human Nox1 containing residues 290-564 was found to possess an intrinsic NADPH-dependent diaphorase activity of 0.95 mol reduced NBT/min/mol protein. This activity is similar in magnitude to that of a longer construct of the phagocytic homologue, and is higher than Nox1 activity measured in vivo. The purified truncated human Nox1 required high ionic strength conditions for stability, and incubation with phagocytic regulatory proteins slightly enhanced its intrinsic activity. This active truncated human Nox1 would be suitable for future structure determination studies. Protein backbone cyclization is a method to increase the inherent stability of a target protein, and may also be a useful tool to aid in the crystallization of proteins through stabilization of flexible loops. To evaluate the potential of this application, Rab7 GTPase (residues 7-185) was cyclized, characterized, crystallized in both GDP- and GTP-bound forms, and the corresponding structures were determined. Cyclization did not significantly alter the secondary structure of Rab7, but increased its thermal stability by 3.7°C. Cyclized Rab7 demonstrated similar GTPase activity and effector association-dissociation kinetics as an equivalent linear Rab7 construct. Cyclized Rab7*GDP crystallized readily and diffracted to significantly higher resolution than uncyclized Rab7*GDP. Crystal contacts involving residues from the linker used for cyclization stabilized the Switch I loop, which is disordered in Rab7*GDP structures, such that its structure could be determined. Cyclized Rab7*GppNHp was also crystallized, but these crystals were found to be pseudomerohedrally twinned with a high twinning fraction. In contrast to the stabilization seen in the cyclized Rab7*GDP structure, the final model of cyclized Rab7*GppNHp contained several regions of flexibility, including the Switch II loop, which is visible in other active Rab7 structures. These structures indicate that the N- and C- termini normally point in opposite directions. The linker used for cyclization may not be long enough to allow the protein to adopt this conformation, generating a strained conformation that affects other regions of the protein, like Switch II. In general, protein backbone cyclization can be a useful method to aid in the crystallization of proteins in which the N- and C-termini lie in close proximity to each other.; Bisher wurde angenommen dass die gezielte enzymatische Produktion von Superoxid (O2.-) ausschließlich in der membran-assoziierten NADPH-Oxidase in Phagozyten stattfindet. Diese verwenden Superoxid als Vorstufe sekundärer reaktiver Sauerstoff-Spezies (ROS), um im Rahmen der angeborenen Immunantwort umhüllte Pathogene zu zerstören. Die in letzter Zeit in nicht-phagozytischem Gewebe entdeckte ´"Nox" Protein-Familie, welche homolog ist zur katalytischen Untereinheit der phagozytischen NADPH-Oxidase, hat zu der Erkenntnis geführt dass ROS auch außerhalb von Phagozyten als Signalmoleküle eine wichtige Rolle spielen. Damit einher ging auch ein Verständnis für die pathologischen Konsequenzen einer Fehlregulation von ROS. Nox-Proteine produzieren normalerweise kleine Mengen intrazellulares Superoxid, obwohl viele verschiedene Faktoren diese Aktivität stimulieren können. Mit der Erkenntnis dass viele Herzkreislauferkrankungen verursachende Faktoren auch die Aktivität von Nox1 stimulieren können, wurde in Nox1 eine der wichtigsten NADPH-Oxidasen des Gefäßsystems erkannt. Die Kenntnis der dreidimensionalen Struktur des ganzen Enzyms Nox1 oder seiner cytosolischen Domäne, welche den ersten Elektronübergang katalysiert, würde die Entwicklung spezifischer Inhibitoren als potentielle neuartige Medikamente unterstützen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zur Strukturaufklärung mit Hilfe der Röntgenstrukturanalyse ein Expressionsprotokoll und ein Reinigungsprotokoll für die rekombinante Proteinerzeugnung des menschlichen Nox1s (hNox1) entwickelt. Untersuchungen der Expression des Volllängenproteins hNox1 in E. coli zeigten keine nennenswerte Protein-Produktion. Im Gegensatz wurden vier Konstrukte der zytosolischen Domäne in niedrigen Mengen löslich exprimiert. Eines dieser Konstrukte, welches einen N-terminalen Hexahistidin-Tag und die Aminosäurereste 290-564 einschließt, zeigte eine Aktivität von 0,95 mol reduziertes NBT/min/mol Protein. Diese Aktivität ist vergleichbar mit der Aktivität eines längeren verkürzten Konstrukts des phagozytischen Homologs, und größer als die für Nox1 in vivo gemessene Aktivität. Dieses gereinigte, verkürzte Konstrukt von hNox1 benötigte zur Stabilisierung Puffer mit einer hohen Ionenstärke. Die Inkubation mit phagozytischen zytosolischen Regulator-Proteinen führte zu einer leichten Erhöhung der intrinsischen Aktivität. Dieses aktive verkürzte Konstrukt könnte sich gut für zukünftige Röntgenstrukturanalysen eignen. Proteinzyklisierung ist eine Methode, die inhärente Stabilität eines Proteins zu erhöhen. Dadurch kann auch die Kristallisation eines Proteins ermöglicht werden, da z.B. flexible Bereiche des Proteins stabilisiert werden können. Um das Potential dieser Methode zu validieren, wurde die kleine GTPase Rab7 (Aminosäurereste 7-185) zyklisiert, charakterisiert, und in Komplex mit GDP und GTP kristallisiert. Die Zyklisierung verändert die Sekundärstruktur von Rab7 nicht bedeutsam, jedoch erhöht sich dadurch die thermische Stabilität des Proteins um 3,7°C. Zyklisiertes Rab7 hat eine mit linearem Rab7 vergleichbare GTPase-Aktivität und Assoziations/Dissoziations-Kinetik für Effektormoleküle. Zyklisiertes Rab7 hat die Kristallisation und Diffraktion von Rab7*GDP erheblich verbessert. Neue Kristallkontakte, welche Aminosäurereste des zur Zyklisierung verwendeten Linker-Bereichs involvieren, stabilisieren den normalerweise ungeordneten Switch I Bereich so weit dass die Kristallstruktur dieses Bereichs aufgeklärt werden konnte. Zyklisiertes Rab7*GppNHp wurde auch kristallisiert, aber die erhaltenen Kristalle waren hochgradig pseudomerohedral verzwillingt. Im Gegensatz zum zyklisierten Rab7*GDP zeigt die Kristallstruktur von zyklisiertem Rab7*GppNHp viele flexible Bereiche, welche auch den normalerweise sichtbaren Switch II Bereich einschließen. In Strukturen von aktivem Rab7 zeigt der N- und C-Terminus in entgegengesetzte Richtungen. Der zur Zyklisierung verwendete Linker scheint jedoch zu kurz zu sein um eine vergleichbare energetisch günstige Konformation zu ermöglichen. Dadurch wird eine weniger günstige Konformation erzwungen, in der einige Bereiche des Proteins wie Switch II eine hohe Flexibilität aufweisen. Allgemein kann Proteinzyklisierung als eine sehr nützliche Methode zur Unterstützung der Kristallisation von Proteinen eingesetzt werden, in denen der N- und C-Terminus in enger räumlicher Nähe zueinander liegen.2008-08-21T11:27:32ZChemisch-biologischer Ansatz für die Protein-Semisynthese und biologische Evaluierung des N-Ras Zyklus
http://hdl.handle.net/2003/25765
Title: Chemisch-biologischer Ansatz für die Protein-Semisynthese und biologische Evaluierung des N-Ras Zyklus
Authors: Gerauer, Marc Philippé2008-08-12T10:51:12ZIdentification of RabGGTase inhibitors and mechanistic studies of Rab GTPase prenylation and recycling using fluoresvent sensors
http://hdl.handle.net/2003/25741
Title: Identification of RabGGTase inhibitors and mechanistic studies of Rab GTPase prenylation and recycling using fluoresvent sensors
Authors: Wu, Yaowen2008-07-09T08:36:07ZDynamik eines magnetisch getriebenen granularen Gases und Untersuchung des Fluktuationstheorems
http://hdl.handle.net/2003/25157
Title: Dynamik eines magnetisch getriebenen granularen Gases und Untersuchung des Fluktuationstheorems
Authors: Schmick, Malte2008-04-02T08:46:30ZStructural studies on mammalian septins
http://hdl.handle.net/2003/24954
Title: Structural studies on mammalian septins
Authors: Sirajuddin, Minhajuddin2008-01-21T10:06:59ZUntersuchungen zur Rolle von Acyl Protein Thioesterase (APT1) bei der Acylierung von Ras-Isoformen
http://hdl.handle.net/2003/24827
Title: Untersuchungen zur Rolle von Acyl Protein Thioesterase (APT1) bei der Acylierung von Ras-Isoformen
Authors: Pendzialek, Dirk2007-11-08T13:43:16ZGranulare Medien und stochastische Resonanz in Zwei-Kammer-Systemen
http://hdl.handle.net/2003/24732
Title: Granulare Medien und stochastische Resonanz in Zwei-Kammer-Systemen
Authors: Viridi, Sparisoma2007-09-26T13:02:35ZEntwicklung eines Fluoreszenzspektrometers zur Untersuchung von intermediären Zuständen in der Röntgenkristallographie
http://hdl.handle.net/2003/24290
Title: Entwicklung eines Fluoreszenzspektrometers zur Untersuchung von intermediären Zuständen in der Röntgenkristallographie
Authors: Klink, Björn2007-05-10T12:08:06ZStrukturelle und biochemische Einblicke in Mechanismen des Nukleotidaustauschs von Rab-Proteinen
http://hdl.handle.net/2003/23542
Title: Strukturelle und biochemische Einblicke in Mechanismen des Nukleotidaustauschs von Rab-Proteinen
Authors: Itzen, Aymelt2007-03-07T14:11:47ZBiochemische und strukturbiologische Untersuchungen der Regulation eukaryotischer Transkriptionselongation
http://hdl.handle.net/2003/23303
Title: Biochemische und strukturbiologische Untersuchungen der Regulation eukaryotischer Transkriptionselongation
Authors: Schulte, Antje2007-02-23T11:12:06ZStereoselektive Synthese von α, β -ungesättigten δ-Laktonen an der festen Phase und Protein-Modifikation durch Palladium-Katalyse
http://hdl.handle.net/2003/23302
Title: Stereoselektive Synthese von α, β -ungesättigten δ-Laktonen an der festen Phase und Protein-Modifikation durch Palladium-Katalyse
Authors: Leßmann, Torben
Abstract: Die Arbeit beschreibt die Synthese naturstoffabgeleiteter Verbindungen am polymeren Träger und Palladium-katalysierte Kreuzkupplungsreaktionen an Peptiden und Proteinen.
Naturstoffe mit einer α,β-ungesättigten -Lakton-Einheit weisen eine Vielzahl biologischer Ak-ti--vitäten auf, z.B. Phosphatase-Inhibtion, Cytotoxizität gegen Krebszellen oder Modulation des Cytoskeletts. Diese Eigenschaften machen Verbindungen dieses Typs zum Aus-gangs-punkt für die naturstoffabgeleitete Synthese.
In einem Ansatz konnten die Zielverbindungen ausgehend von einfachen, polymer-gebundenen Aldehyden durch iterativen Einsatz des Brownschen Allylborans und einer ab-schlie-ßenden Ringschlussmetathese in hoher Enantio- und Diastereoselektivität erhalten werden. Auf diese Weise ließ sich die in Naturstoffen häufig angetroffene 1,3-Diol-Untereinheit stereochemisch variabel an der festen Phase synthetisieren. Der beschriebene Weg bewährte sich in der Synthese aller Diastereomere von Naturstoffgrundgerüsten wie z.B. Cryptocarya Diacetat. Die Zielverbindungen konnten nach bis zu 14 Stufen am polymeren Träger nach einem Aufreinigungsschritt erhalten werden.
Ein zweiter Weg zu Verbindungen mit einer α,β-ungesättigten -Lakton-Einheit beruht auf ei-ner enantioselektiven oxa-Diels-Alder-Reaktion von polymergebundenen Dienen mit Gly-oxal-säureethylester. Diese Reaktion wurde in der vorliegenden Arbeit ausgiebig untersucht, besonders im Hinblick auf Katalysatoren, die auf Kupfer(II)-haltigen Lewis-Säuren basierten.
Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Möglichkeit untersucht, Palladium-katalysierte Kreuz-kupplung-sreaktionen an Proteinen mit geeigneten funktionellen Gruppen durchzuführen. Am Bei-spiel der Sonogashira-Reaktion konnte gezeigt werden, dass Übergangsmetall-Katalyse unter wässrig-neutralen Bedingungen an peptidischen Substraten möglich ist. Der Transfer der Reaktionsbedingungen auf vollständige Proteine, die mit einem Aryliodid funktionalisiert worden waren, erbrachte jedoch die gewünschten Produkte nur in geringer Ausbeute.2007-02-21T14:46:12ZTowards elucidation of the phenazine biosynthesis pathway of Pseudomonas with the structural and functional analysis of the enzymes PhzA, B, G and BcepA
http://hdl.handle.net/2003/23288
Title: Towards elucidation of the phenazine biosynthesis pathway of Pseudomonas with the structural and functional analysis of the enzymes PhzA, B, G and BcepA
Authors: Ahuja (Niki), Ekta Gyan2007-02-20T09:20:25ZStudien zur Olefinmetathese und deren Anwendung in der Synthese mittlerer Ringe
http://hdl.handle.net/2003/23229
Title: Studien zur Olefinmetathese und deren Anwendung in der Synthese mittlerer Ringe
Authors: Müller, Christoph2007-01-17T13:36:38ZStructural and biophysical characterisation of the small GTPase Rab6a and its effectors BicaudalD2, p150 glued and PIST
http://hdl.handle.net/2003/23219
Title: Structural and biophysical characterisation of the small GTPase Rab6a and its effectors BicaudalD2, p150 glued and PIST
Authors: Bergbrede, Tim2007-01-12T13:40:12ZSynthese und Konformationsanalyse von Biphenomycin-Analoga
http://hdl.handle.net/2003/23150
Title: Synthese und Konformationsanalyse von Biphenomycin-Analoga
Authors: Arve, Lars2006-12-20T10:38:02ZBiochemische und biophysikalische Charakterisierung der Regulation und Aktinpolymerisation des humanen Formins FHOD1
http://hdl.handle.net/2003/23113
Title: Biochemische und biophysikalische Charakterisierung der Regulation und Aktinpolymerisation des humanen Formins FHOD1
Authors: Schönichen, André
Abstract: Formine nehmen eine bedeutende Rolle bei dem Auf- und Abbau des Aktinzytoskelettes ein. Dabei binden sie über ihre Formin-Homologie 2- (FH2-) Domäne direkt an Aktin und katalysieren die Aktinfilamentbildung am stumpfen Ende. Diaphanous-autoregulierte Formine sind Effektoren der Rho-GTPasen und werden so durch äußere Signale zur Nukleierung der Aktinpolymerisation aktiviert. Ein Mitglied dieser Proteinfamilie ist das humane FHOD1-Protein, dessen genaue Funktion und Aufgabe bei der Formierung des Aktinzytoskeletts noch weitgehend unerforscht ist. Zum Verständnis der molekularen Eigenschaften dieses ubiquitär exprimierten Formins sind die autoregulatorischen Motive und der Mechanismus der Aufhebung des autoinhibierten Zustandes sowie der Mechanismus der Nukleierung der Aktinpolymerisation von großem Interesse.
Diese Studie fokussierte auf die Charakterisierung der biochemischen Aspekte bei FHOD1. Für die Analyse in vitro gelang es zunächst, verschiedene Fragmente von FHOD1 rekombinant aus E.coli herzustellen. Mit Hilfe eines GST-Pulldown-Experiments und Westernblot-Analysen mit fünf unterschiedlich langen C-terminalen FHOD1-Fragmenten wurde zunächst gefunden, dass die C-terminalen 61 Aminosäuren (1104-1164) für die Interaktion mit der N-terminalen FH3-Domäne (1-377) und damit der Autoinhibition ausreichend sind. In einem nächsten Schritt wurden die drei DAD-Konsensusmotive mutiert und der Effekt in vivo durch Betrachten des Phänotyps und der Transkriptionstransaktivierung mittels eines Luziferase-Experiments analysiert. Dabei stellte sich heraus, dass das erste hydrophobe Konsensusmotiv, das sich direkt C-terminal von der FH2-Domäne an Position 1053 befindet, auf die Autoinhibition keinen Einfluss hat. Vielmehr zeigte die Mutation des zweiten hydrophoben (Position 1108) sowie des basischen Motivs (Position 1126) innerhalb der letzten 61 Aminosäuren die Bildung von Aktinstressfasern. Besonders deutlich war dieses Ergebnis bei gleichzeitiger Mutation beider Motive. Die Stimulation der Transkription vom SRE hingegen war weniger deutlich, was auf einen möglichen schrittweisen Aktivierungsmechanismus hindeutet. Bei der Untersuchung der Bindung an FHOD1-(1-377) und DAD-Fragmenten mit der Wildtypsequenz und den Mutationen mittels isothermaler Titrationskalorimetrie (ITC) kam heraus, dass die letzten 61 Aminosäuren mit einer Dissoziationskonstanten von 1,4 µM bindet und sowohl das hydrophobe als auch das basische Motiv allein noch den FHOD1-N-Terminus (1-377) im unteren mikromolaren Bereich bindet. Nur eine Doppelmutante mit der Mutation beider Motive zeigte keine Interaktion mit dem N-Terminus.
Mittels analytischer Gelfiltration wurde die molekulare Dispersion der FHOD1-FH3-Domäne (1-377) und des Komplexes aus der FH3-Domäne mit dem DAD-Fragment (1104-1164) untersucht. Ein erstes Ergebnis war hier, dass die FH3-Domäne in einem Monomer-Dimer-Gleichgewicht vorliegt, das sich durch reduzierende Bedingungen der monomere Anteil erhöhen lässt, so dass vermutet wird, dass die Dimerisierung über Disulfidbrückenbildung erfolgt. Ferner vergrößert die Interaktion mit der DAD das Volumen der FH3-DAD-Domäne nur geringfügig. Dies ist ein Hinweis darauf, dass die DAD als unstrukturiertes Peptid auf der FH3-Domäne bindet, bzw. in eine konkave Bindungsoberfläche hineinfaltet.
Untersuchungen mit zweidimensionaler, heteronuklearer NMR-Spektroskopie zeigten schließlich, dass die DAD ein zum größten Teil unstruktiertes Polypeptid ist, mit einem geringen -helikalen Anteil. Durch Titration der FH3-Domäne zu der 15N-markierten DAD konnte die Bindungsregion weiter eingegrenzt werden, da bei Bindung nicht alle Resonanzsignale verschwanden. Diese Studie zeigte, dass sich die interagierende Region der DAD von Position 1106 bis 1144 erstreckt und damit das hydrophobe sowie das basische Konsensusmotiv enthält.
Zur Untersuchung der Aktivierung von FHOD1 durch eine kleine GTPase in vitro wurde die Bindung von Rac1 in der Triphosphatform mit den FHOD1-Fragmenten (1-377) oder (411-573) zunächst mittels isothermaler Titrationskalorimetrie untersucht. Dabei konnte für keines dieser Fragmente eine eindeutige Interaktion gemessen werden. Eine weitere Untersuchung durch analytischer Gelfiltration bei der C-terminal verkürztes Rac1 (1-184) sowohl in der Di- als auch in der Triphosphatform verwendet wurde, ergab, dass es nicht an das FHOD1-Fragment (411-573) bindet, jedoch mit dem N-Terminus (1-377) Oligomere bildet, was auf eine potentielle Interaktion hindeutet.
In einem Aktinpolymerisationsexperiment wurde rekombinant aus E.coli gereinigte FH2-Domäne (614-1096) sowie aus dem eukaryotischen Bacoluexpressionssystem gereinigtes natives FHOD1-Volllängenprotein untersucht. Dabei konnte beobachtet werden, dass die FH2-Domäne und das Volllängenprotein die Aktinpolymerisation nicht nukleieren, sondern vielmehr inhibieren und sich ähnlich wie capping-Proteine verhalten. Damit wurde gezeigt, dass das FHOD1-Fragment (614-1096) und autoinhibiertes FHOD1 Aktin binden können. In letzteren Fall konnte auch bei Zugabe der drei GTPasen Rac1, RhoA und Cdc42 bzw. eines DAD-Peptids keine Aufhebung der Polymerisationsinhibierung erreicht werden. Dieser Befund deutet auf die Notwendigkeit eines weiteren Kofaktors zur Nukleierung der Aktinpolymerisation hin.
Ein zweites Projekt beschäftigte sich mit dem Transkriptionsinhibitor Hexim1, der die Transkriptionselongation durch den P-TEFb-Komplex (bestehend aus der Kinase Cdk9 und dem Zyklinprotein CyclinT1) hemmt. Es konnte hier die C-terminale CyclinT1-bindende Domäne von Hexim1 (255-359) rekombiant dargestellt und uniform heteronuklear mit stabilen Isotopen markiert werden. In Kooperation mit Dr. Sonja Dames vom Biozentrum wurde die Struktur dieser Domäne aufgeklärt, die eine dimere zweigeteilte coiled-coil-Struktur besitzt. Dabei ist das C-terminale zweite coiled-coil-Segment 319-348 ein nahezu ideales, stabiles coiled-coil, während das erste Segment (284-313) Abweichungen von der idealen Konsensussequenz eines parallelen coiled-coils aufweist und flexibler ist. Die beiden Segmente sind durch einen sieben Aminosäure-langen Linker unterbrochen. N-terminal des ersten coiled-coil-Segments befindet sich eine weitere Helix (276-281), die durch drei Aminosäuren mit dem ersten coiled-coil-Segment verbunden ist. Durch NMR-Titrationexperimente von 15N-markiertem Hexim1 mit unmarkiertem CyclinT1 (1-292)-Molekül konnte die Bindungsregion für CyclinT1 bestimmt werden. Diese befindet sich auf dem ersten coiled-coil-Segment sowie auf der vorausgehenden Helix und stimmt gut mit dem Bereich höchster Konservierung überein. ITC-Bindungsstudien, analytische Gelfiltration und Fluoreszenzexperimente mit verschiedenen Hexim1-Fragmenten und CyclinT1 (1-272) zeigten, dass ein CyclinT1 (1-272) ein Hexim1-Dimer bindet.2006-12-01T13:33:35ZEntwicklung eines gegen HIV-1 Nef SF2 gerichteten Inhibitors
http://hdl.handle.net/2003/22991
Title: Entwicklung eines gegen HIV-1 Nef SF2 gerichteten Inhibitors
Authors: Breuer, Sebastian2006-10-11T13:14:32ZIn vivo und in vitro Expression von Membranproteinen am Beispiel archae- und eubakterieller Rhodopsine
http://hdl.handle.net/2003/21522
Title: In vivo und in vitro Expression von Membranproteinen am Beispiel archae- und eubakterieller Rhodopsine
Authors: Kalmbach, Rolf
Abstract: The completion of the human genome project and the development of sensitive high-throughput assay techniques initiated a dramatic acceleration in the pace of biological research. An essential prerequisition for further progress will be the establishment of effective and selective methods for the expression of the gene products in their functional state.
In this work the cell-free protein biosynthesis of integral membrane proteins was established. Several rhodopsins from archae- and eubacteria (bacteriorhodopsin bR, N.pharaonis halorhodopsin NphR, N.pharaonis sensory rhodopsin II NpsRII and proteorhodopsin PR) as well as the G-protein coupled human Glycinreceptor (hGlyR1) were successfully synthesised in a coupled in vitro transcription/translation system based on E.coli cell extracts. Insertion of the proteins in an artificial hydrophobic environment consisting of various detergents or lipids was screened by proteolytic digestion of protease-accessible regions. bR and to less amounts NpsRII and PR were inserted into small unilamellar liposomes consisting of phospholipids in the fluid L-phase. The estimated protein yield of cell-free synthesised bR (bRcf) was 20 mg/liter. Functionality of the cell-free synthesised bRcf was confirmed by laserflash-photolysis. The photocycle of bRcf is similar to that of the native protein. The M-Intermediate decays with a slower rate constant than bR in the purple membrane but comparable with polarized cell-envelope vesicles from H.salinarum. The photocurrent of bRcf could be meassured directly using the crude reaction mixture. The high current of 1 nA/cm2 can be explained by the unidirectional orientation of the protein in the liposomes.
To compare functional in vitro with in vivo expression of membrane proteins the heterologous in vivo expression was applied to the bR-like PR from uncultivated marine eubacteria. PR was functionally expressed and purified from E.coli cells in yields up to 9 mg/liter culture volume. PR belongs to the family of retinal-containing seven-transmembrane helix receptors. After irradiation PR cycles through subsequent steps of spectrally distinct intermediates. This photocycle results in the transport of a proton across the cell membrane. The absorption maximum of PR is dependent on the pH and shifts from 518 nm at alkaline to 539 nm at acidic pH. Based on a detailed kinetic analysis of the transient absorption changes of the alkaline and acidic species, two distinct photocycle models were derived.
The photocurrents of PR were investigated by the black lipid membrane technique, revealing that PR pumps protons outwardly at alkaline pH, but the pumping direction is inverted at acidic pH.
These results show that PR acts as an efficient proton pump suggesting a primary role in bacterial energy conversion. The existence of two competing photocycles with inverse pumping directions could allow for a more subtle regulation of the membrane potential. Regarding the fact that marine bacteria contribute considerably for the biomass on earth, PR phototrophy might be a globally significant oceanic microbial process beside the photosynthesis reaction.2005-07-15T10:23:51ZProtein- und Naturstoffstruktur als Leitprinzipien für die Entwicklung von Verbindungsbibliotheken
http://hdl.handle.net/2003/21357
Title: Protein- und Naturstoffstruktur als Leitprinzipien für die Entwicklung von Verbindungsbibliotheken
Authors: Koch, Marcus Alexander2005-05-27T00:00:00ZHigh yield functional expression, purification, and reconstitution of human sodium/D-glucose cotransporter 1 (hSGLT1) in Pichia pastoris & pilot studies for photoaffinity labeling of functional domains of SGLT1
http://hdl.handle.net/2003/21356
Title: High yield functional expression, purification, and reconstitution of human sodium/D-glucose cotransporter 1 (hSGLT1) in Pichia pastoris & pilot studies for photoaffinity labeling of functional domains of SGLT1
Authors: Tyagi, Navneet Kumar2005-05-17T00:00:00ZSynthese und biologische Evaluierung von Lipo-, Glyco- und Phosphopeptiden
http://hdl.handle.net/2003/21355
Title: Synthese und biologische Evaluierung von Lipo-, Glyco- und Phosphopeptiden
Authors: Schlummer, Stefanie
Abstract: Um Aussagen über komplexe molekularbiologische Vorgänge zu treffen, werden an diesen Prozessen beteiligte Proteine bzw. Partialstrukturen dieser Proteine als wichtige Hilfsmittel eingesetzt. Viele dieser Proteine sind posttranslational modifiziert und gerade diese Modifikationen haben einen entscheidenden Einfluss auf die Eigenschaften des Proteins. Der Zugang zu diesen posttranslational modifizierten Proteinen ist über Proteinexpression nicht oder nur schwer möglich. Die chemische Synthese von posttranslational modifizierten Peptiden und Proteinen bietet die Möglichkeit Modifikationen gezielt einzubringen. Zusätzlich können neben den natürlich vorkommenden Modifikationen beliebige Gruppen wie z. B. Fluorophore eingeführt werden.Das N-Ras-Protein ist ein zentraler Schalter in der Wachstumskontrolle von Zellen. Der C-Terminus des N-Ras ist doppelt lipidiert und diese Lipidierungen sind ausschlaggebend für die Aktivität des Proteins. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Synthese entwickelt, um Fluoreszenz-markierte, und doppelt lipidierte N-Ras Proteine darzustellen. Diese Fluoreszenz-markierten Proteine konnten so in biophysikalischen und molekularbiologischen Untersuchungen eingesetzt werden, dass über den Einfluss der Modifikationen auf die Lokalisation und Aktivität des Proteins eine Auskunft erhalten wurde.In weiteren Teilen der Arbeit wurden zelluläre Transportwege untersucht. Peptide mit einer an die vJun-Kernlokalisierungssequenz angelehnten Sequenz konnten über Festphasensynthese so aufgebaut werden, dass verschiedene Modifikationen, wie Phosphorylierung und Glykosylierung in Nachbarstellung zur NLS eingebracht werden konnten. Eine Verknüpfung mit Avidin als Transportgut ermöglichte die Ausnutzung des natürlichen Kernimportweges und die Regulation des Kernimportes durch posttranslationale Modifikationen. Konjugaten aufgebaut aus einer hydrophoben Proteintransduktionsdomäne (PTD) und einer hydrophilen Kernlokalisierungssequenz (NLS) besitzen die Fähigkeit die Plasmamembran zu durchdringen und in den Zellkern zu translokieren. Mittels Festphasenpeptidsynthese konnten solchen peptidische Transporter synthetisiert und in Lokalisationsstudien eingesetzt werden.2005-05-11T00:00:00ZSemisynthese fluoreszenzmarkierter und prenylierter Rab7-Proteine
http://hdl.handle.net/2003/20381
Title: Semisynthese fluoreszenzmarkierter und prenylierter Rab7-Proteine
Authors: Watzke, Anja2005-05-02T00:00:00ZEntwicklung einer flexiblen Lösungs- und Festphasensynthese von Dekalinen und heterozyklischer Analoga
http://hdl.handle.net/2003/20380
Title: Entwicklung einer flexiblen Lösungs- und Festphasensynthese von Dekalinen und heterozyklischer Analoga
Authors: Roettger, Svenja
Abstract: Ziel dieser Dissertation war die Entwicklung einer flexiblen Synthesestrategie, die mittels einer einstufigen Robinson-Anellierung unter Einsatz eines breiten Spektrums an Ausgangstoffen zu einer Dekalin-Bibliothek führt, die zusammen mit weiteren Naturstoffprojekten der Arbeitsgruppe Information z.B. zur Enzym-Inhibierung liefern sollte. Dabei sollte die Strategie so ausgearbeitet werden, dass sowohl die Vorteile der Lösungs- als auch der Festphasensynthese genutzt werden. <p>Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, zuerst eine einstufige Lösungssynthese für den Aufbau von Dekalinen mittels Robinson-Anellierung aus Methylvinylketonanaloga und Cyclohexanonderivaten zu entwickeln. Dabei wurde das Cyclohexanonderivat als Enamin aktiviert wobei verschiedene Amine bzw. auch Prolin getestet wurden.Um ein breite Variabilität an Substituentenmustern der Dekaline erhalten zu können, wurden zum einen Synthesestrategien zur Darstellung von unterschiedlich substituierten Analoga von Methylvinylketon entwickelt. Zum anderen gelang in der Robinson-Anellierung auch der Einsatz eines breiten Spektrums an Cyclohexanonderivaten sowie heterozyklischer Analoga. Mit der Synthese von ca. 150 Grundgerüsten ist die Entwicklung eines flexiblen Eintopfvefahrens zur Darstellung von Dekalinen und heterozyklischer Analoga gelungen.<p>Basierend auf diesen Dekalingerüsten wurde einige Derivatisierungen in Lösung durchgeführt. Neben der Entschützung sämtlicher Schutzgruppen wurden z.B. Substitutionen durchgeführt, um weitere funktionelle Gruppen in die Moleküle einführen zu können.<p>Für die Übertragung der Reaktion an die feste Phase war die Anbindung der Methylvinylketonanaloga an den polymeren Träger ein bedeutender Schritt. Im Rahmen dieser Versuche ist es gelungen, substituierte Analoga auch am polymeren Träger darzustellen. Basierend auf diesen festphasengebundenen Ausgangsstoffen ist es erstmal gelungen, die Robinson-Anellierung auch am polymeren Träger (Polystyrolharz) durchzuführen, wobei wiederum verschiedene Cyclohexanonanaloga zum Einsatz kamen.<p>Im letzten Abschnitt der Arbeit wurde eine für einen Großteil der Moleküle anwendbarer Anker zur Anbindung an einen polymeren Träger entwickelt. In Beispielreaktionen wurden diese Derivate an die feste Phase gebunden und z.B. mittels Aldolreaktionen weiter derivatisiert. So konnten neben der Lösungssynthese durch die Derivatisierung in Lösung und an der festen Phase weitere 50 Derivate dargestellt werden.<p>Es wurde bereits mit der biologischen Evaluierung begonnen, diese wird jedoch in den nächsten Monaten noch fortgesetzt.2005-05-02T00:00:00Z