Eldorado Community:
http://hdl.handle.net/2003/52
2024-03-28T14:56:00ZOrganische Hybrid-Verbindungen auf Basis elektronenreicher Olefine
http://hdl.handle.net/2003/42407
Title: Organische Hybrid-Verbindungen auf Basis elektronenreicher Olefine
Authors: Antoni, Patrick Wolf2023-01-01T00:00:00ZSynthese, Charakterisierung und photophysikalische Untersuchungen von Kupfer(I)-Emittern im Zusammenhang mit Exzitonenkopplung und die Synthese heteronuklearer Systeme auf Basis von Kupfer(I)- und Gruppe(IV)-Metallen
http://hdl.handle.net/2003/42401
Title: Synthese, Charakterisierung und photophysikalische Untersuchungen von Kupfer(I)-Emittern im Zusammenhang mit Exzitonenkopplung und die Synthese heteronuklearer Systeme auf Basis von Kupfer(I)- und Gruppe(IV)-Metallen
Authors: Janiak, Lars Immanuel
Abstract: Das Design molekularer Emitter auf Basis von häufig vorkommenden Metallen, wie z.B. Kupfer(I), ist eine Herausforderung der gegenwärtigen Forschung und wird in dieser Arbeit thematisiert. Lumineszente Materialien in z.B. OLEDs enthalten häufig teure Edelmetalle mit örtlich begrenztem Vorkommen, wodurch aktuell eine geopolitische Abhängigkeit entsteht und in Zukunft der Bedarf für die Massenprodukte nicht abgedeckt werden kann. Ein weiteres Problem von OLEDs ist die Stabilität und Lichtsättigung, die aufgrund niedriger strahlender Ratenkonstanten die Lebenszeit des Bauteils begrenzen. Organometallkomplexe bieten den Vorteil einer hohen Spin-Bahn-Kopplung (SOC), wodurch Singulett- mit Triplettzuständen koppeln und eine effiziente Phosphoreszenz erreichen. Nachteilig ist jedoch, dass Phosphoreszenz sich durch verhältnismäßig lange Lebenszeiten auszeichnet. Diese Problematik kann mit dem alternativen und vielversprechenden Emissionsmechanismus der thermisch aktivierten verzögerten Fluoreszenz (TADF) umgangen werden, der Zugang zu deutlich kürzeren Lebenszeiten und hohen strahlenden Ratenkonstanten 𝑘𝑟 ermöglicht. Einen weiteren Lösungs-ansatz bietet die Verwendung des physikalischen Phänomens der intramolekularen Exzitonenkopplung, welches in dieser Arbeit anhand ausgewählter Kupfer(I)-Komplexe untersucht wurde. So wurde der Einfluss eines weiteren Metallzentrums in Organometallverbindungen analysiert, um das Übergangsdipolmoment μ zu erhöhen, das ein direktes Maß für die Erlaubtheit eines Übergangs darstellt. Hierzu wurden Pyrimidin- und Benzimidazol-basierte Brückenliganden verwendet, die durch zwei bidentate Koordinationsstellen eine hohe räumliche Nähe beider Metallzentren ermöglichen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde zudem mit S-BINAP, POP und Xantphos der Einfluss verschiedener bidentater Phosphanliganden, aber auch des N-heterocyclischen 2,4-Di-isopropylphenyl-substituierten ARDUENGO-Carbens, auf die photophysikalischen Eigenschaften im Festkörper untersucht. Insbesondere bei bpm-basierten Kupfer(I)-Komplexen wurden kürzere Lebenszeiten mit gleichbleibend niedrigen Quantenaus-beuten detektiert, während für die strahlende Ratenkonstante 𝑘𝑟 bei pmbim- und bzim-basierten Systemen keine Zunahme zu beobachten war. Des Weiteren wurden einige phosphoreszierende Blaulichtemitter auf bzim-Basis mit Quantenausbeuten von bis zu 𝛷 = 0.61 charakterisiert. Zudem wurden bpm-basierte bimetallische Komplexe mit ungewöhnlichen reversiblen Reduktionspotentialen isoliert, welche sich als potenzielle Ein-Elektronen-Transferreagenzien ausweisen. Zusätzlich wurden photokatalytische Umwandlungen mittels DEXTER-Energietransfer von bzim-basierten Kupfer(I)-Komplexen erfolgreich durchgeführt.
Eine weitere Herausforderung stellt die Bildung des anti-MARKOVNIKOV-Produkts in der Hydroaminierung da. Aufgrund verschiedener thermodynamischer und kinetischer Barrieren ist das anti-MARKOVNIKOV-Produkt in der Hydroaminierung auf direktem Weg schlecht zugänglich. Gruppe(IV)-Metalle sind in der Lage diese Reaktion zu katalysieren. Aufgrund ihrer geringen Toleranz gegenüber funktionaler Gruppen und geringer Ausbeuten des anti-MAR-KOVNIKOV-Produkts jedoch limitiert. Im zweiten Teil der Arbeit wurden daher heteronukleare Systeme auf Basis von Kupfer(I)- und Gruppe(IV)-Metallen untersucht, welche in Zukunft als bimetallische Photokatalysatoren für die Hydroaminierung eingesetzt werden sollen. Priorität lag hierbei auf der Synthese und Isolation von derartigen Metallkomplexen. Während sich Gruppe(IV)-Amidokomplexe nicht für die Umsetzung mit Kupfer(I)-Komplexen eigneten, konnte durch den Wechsel auf Gruppe(IV)-Halogenidkomplexe eine erste heteronukleare Spezies auf Basis von Cu(I) und Zr(IV) nachgewiesen werden. Zudem konnten weitere neuartige Gruppe(IV)-pmbim-Verbindungen und ein trimetallischer Komplex auf Basis von einem Ti(IV)-Atom und zwei Cu(I)-Atomen isoliert werden. Letzterer zeichnet sich durch eine intensive Absorption über das gesamte sichtbare Spektrum aus.2023-01-01T00:00:00ZTuning the high-pressure phase behaviour of highly compressible zeolitic imidazolate frameworks: from discontinuous to continuous pore closure by linker substitution
http://hdl.handle.net/2003/42380
Title: Tuning the high-pressure phase behaviour of highly compressible zeolitic imidazolate frameworks: from discontinuous to continuous pore closure by linker substitution
Authors: Song, Jianbo; Pallach, Roman; Frentzel-Beyme, Louis; Kolodzeiski, Pascal; Kieslich, Gregor; Vervoorts, Pia; Hobday, Claire L.; Henke, Sebastian
Abstract: The high-pressure behaviour of flexible zeolitic imidazolate frameworks (ZIFs) of the ZIF-62 family with the chemical composition M(im)2−x(bim)x is presented (M2+=Zn2+, Co2+; im−=imidazolate; bim−=benzimidazolate, 0.02≤x≤0.37). High-pressure powder X-ray diffraction shows that the materials contract reversibly from an open pore (op) to a closed pore (cp) phase under a hydrostatic pressure of up to 4000 bar. Sequentially increasing the bim− fraction (x) reinforces the framework, leading to an increased threshold pressure for the op-to-cp phase transition, while the total volume contraction across the transition decreases. Most importantly, the typical discontinuous op-to-cp transition (first order) changes to an unusual continuous transition (second order) for x≥0.35. This allows finetuning of the void volume and the pore size of the material continuously by adjusting the pressure, thus opening new possibilities for MOFs in pressure-switchable devices, membranes, and actuators.2022-02-04T00:00:00ZCovalent allosteric inhibitors of Akt generated using a click fragment approach
http://hdl.handle.net/2003/42375
Title: Covalent allosteric inhibitors of Akt generated using a click fragment approach
Authors: Westhuizen, Leandi van der; Weisner, Jörn; Taher, Abu; Landel, Ina; Quambusch, Lena; Lindemann, Marius; Uhlenbrock, Niklas; Müller, Matthias P.; Green, Ivan R.; Pelly, Stephen C.; Rauh, Daniel; Otterlo, Willem A. L. van
Abstract: Akt is a protein kinase that has been implicated in the progression of cancerous tumours. A number of covalent allosteric Akt inhibitors are known, and based on these scaffolds, a small library of novel potential covalent allosteric imidazopyridine-based inhibitors was designed. The envisaged compounds were synthesised, with click chemistry enabling a modular approach to a number of the target compounds. The binding modes, potencies and antiproliferative activities of these synthesised compounds were explored, thereby furthering the structure activity relationship knowledge of this class of Akt inhibitors. Three novel covalent inhibitors were identified, exhibiting moderate activity against Akt1 and various cancer cell lines, potentially paving the way for future covalent allosteric inhibitors with improved properties.2022-02-16T00:00:00ZSynthesis and characterization of cationic hydrogels from thiolated copolymers for independent manipulation of mechanical and chemical properties of cell substrates
http://hdl.handle.net/2003/42374
Title: Synthesis and characterization of cationic hydrogels from thiolated copolymers for independent manipulation of mechanical and chemical properties of cell substrates
Authors: Pätzold, Florian; Stamm, Nils; Kamps, Dominic; Specht, Maria; Bolduan, Patrick; Dehmelt, Leif; Weberskirch, Ralf
Abstract: Cells sense both mechanical and chemical properties in their environment and respond to these inputs with altered phenotypes. Precise and selective experimental manipulations of these environmental cues require biocompatible synthetic materials, for which multiple properties can be fine-tuned independently from each other. For example, cells typically show critical thresholds for cell adhesion as a function of substrate parameters such as stiffness and the degree of functionalization. However, the choice of tailor-made, defined materials to produce such cell adhesion substrates is still very limited. Here, a platform of synthetic hydrogels based on well-defined thiolated copolymers is presented. Therefore, four disulfide crosslinked hydrogels of different composition by free radical polymerization are prepared. After cleavage with dithiothreitol, four soluble copolymers P1–P4 with 0–96% cationic monomer content are obtained. P1 and P4 are then combined with PEGDA3500 as a crosslinker, to fabricate 12 hydrogels with variable elasticity, ranging from 8.1 to 26.3 kPa and cationic group concentrations of up to 350 µmol cm−3. Systematic analysis using COS7 cells shows that all of these hydrogels are nontoxic. However, successful cell adhesion requires both a minimal elasticity and a minimal cationic group concentration.2022-02-20T00:00:00ZSynthese und Studien photoaktiver Übergangsmetallkomplexe
http://hdl.handle.net/2003/42364
Title: Synthese und Studien photoaktiver Übergangsmetallkomplexe
Authors: Koop, Stefan
Abstract: Der Fokus dieser Dissertation lag in der Synthese und Untersuchung photoaktiver Übergangsmetallkomplexe. Im ersten Projekt wurde die Darstellung neuartiger NHC-Übergangsmetallkomplexe auf Basis von Mangan und Vanadium und ihre Eignung als photoinduzierte, schaltbare Radikalspezies untersucht. Neben dieser wurde im zweiten Projekt die Synthese bimetallischer Photokatalysatoren auf Basis von Kupfer und Rhodium/Iridium und deren Eignung für Hydroaminierungsreaktionen untersucht. Es gelang der Einblick in die Synthese und Darstellung vier neuartiger bimetallischer Komplexe. Im letzten Projekt dieser Promotionsarbeit wurde die Synthese und Untersuchung von photolumineszenten Zn(II)-Komplexen in niedrigen Koordinationsmodi, welche Carbenliganden als π-Chromophore tragen. Neben der erfolgreichen Synthese trigonaler Zn(II)-Komplexe, konnte ein Einblick in deren photophysikalischen Verhaltensweisen gewonnen werden. Diese Ergebnisse liefern eine neue Klasse von seltenen phosphoreszierenden Zn(II)-Komplexen, die für photokatalytische Anwendungen interessant sein könnten.2023-01-01T00:00:00ZStructure and dynamics studies of the enzymes hCAII and GlpG via NMR spectroscopy
http://hdl.handle.net/2003/42363
Title: Structure and dynamics studies of the enzymes hCAII and GlpG via NMR spectroscopy
Authors: Kotschy, Julia
Abstract: Lösungs- und Festkörper-NMR-Spektroskopie eignen sich gut, um Moleküle wie Proteine mit atomarer Auflösung zu charakterisieren. Hier wurden insbesondere strukturelle und dynamische Änderungen durch die Interaktion mit Inhibitoren, Strategien zur NMR-Probenoptimierung und verschiedene Methoden zur Zuordnung von NMR-Peaks eruiert. Lösungs- und Festkörper-NMR-Experimente wurden entwickelt, um die Flexibilität von SBR in hCAII-gebundenem Zustand zu messen. Das Enzym hCAII reguliert osmotische Prozesse in humanen Zellen und ist deshalb ein Zielprotein für Arzneimittel. Die entwickelte Methode zeigte, dass sich der Ligand trotz hoher Affinität in der Bindungstasche bewegt. Dies könnte von Interesse für die Wirkstoffentwicklung sein. Des Weiteren wurden sogenannte „time-shared“ 3D Lösungs- und Festkörper-NMR-Experimente für die Zuordnung von Methyl-Gruppen durch die Korrelation von Amid- und Methyl-Protonen in räumlicher Nähe zueinander genutzt.
Intramembranproteasen der Rhomboid-ähnlichen Familie sind an Prozessen beteiligt, die mit Krebs- und neurodegenerativen Erkrankungen[1] assoziiert sind. Die Intramembranprotease GlpG aus E. coli wurde als Vertreter dieser Familie betrachtet. Nachdem die Expression und Aufreinigung von GlpG optimiert worden waren, wurden die NMR-Peaks der Methyl-Gruppen durch Punktmutationen zugeordnet. Diese wurden dazu genutzt lokale Änderungen der chemischen Umgebung und der Flexibilität der Seitenketten im Mikro- bis Millisekunden-Bereich für GlpG ohne und im Komplex mit Inhibitoren mittels Lösungs-NMR-Spektroskopie zu verfolgen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Interaktion mit dem Inhibitor STS1775 Konformationsänderungen bzw. Änderungen in der Dynamik von Methyl-Gruppen induziert, die bis zu 18 Å weit vom aktiven Zentrum entfernt sind.; Solution and solid-state NMR are valuable tools to characterize the chemical environments and dynamics of molecules like proteins with atomic resolution. Here, the effects of protein-ligand interactions on structural features and flexibility, strategies for NMR sample optimization, as well as different tools for peak assignments were elucidated.
For an unlabelled ligand in hCAII-bound state, dynamics were detected for a high-affinity complex via dedicated solution and solid-state NMR experiments. The enzyme hCAII is a well-studied drug target involved in, for example, pH regulation in human cells. The approach allowed to connect protein-ligand interactions with ligand flexibility, which might be of interest for medicinal chemistry. Furthermore, time-shared 3D NOESY/RFDR experiments were utilized both in solution and the solid state to assign methyl groups of hCAII.
Intra-membrane proteases of the rhomboid-like family are involved in processes associated with devastating conditions like cancer and neurodegeneration[1]. Here, GlpG from E. coli as a well-studied representative of the family was studied. After optimizing several expression and purification conditions, selected methyl groups were assigned via mutation to study chemical shift perturbations and microsecond to millisecond motion via solution NMR spectroscopy, comparing GlpG in apo and inhibitor-bound state. Our data indicate that upon binding of inhibitor STS1775, the conformational ensemble changes despite of up to 18 Å distance from the active site. Consequently, the occupancy of the active site modulates conformations close to but also far away from the substrate binding site.2024-01-01T00:00:00ZTablet-Einsatz zur Vermittlung und Sicherung von Fachwissen
http://hdl.handle.net/2003/42358
Title: Tablet-Einsatz zur Vermittlung und Sicherung von Fachwissen
Authors: Greitemann, Lars; Melle, Insa
Abstract: Tablets kommt eine zunehmende Bedeutung im Unterricht zu. Sie ermöglichen die Erweiterung bewährter Unterrichtsformen (z. B. Bearbeitung von Aufgaben), aber auch neue Formate (z. B. Erstellung von Erklärvideos durch die Lernenden). Im Rahmen der hier vorgestellten Untersuchung wird die Wirkung des Tablet-Einsatzes in der Erarbeitungs- und Sicherungsphase analysiert. Dafür wird eine digitale Lernumgebung zur Einführung in das Basiskonzept Chemische Reaktion evaluiert, welche die Schüler:innen durch die beiden Unterrichtsphasen führt. Die Intervention wird im Rahmen eines Projekttags im Chemieanfangsunterricht durchgeführt, wobei sechs Unterrichtsstunden à 45 Minuten zur Verfügung stehen. Während der Erarbeitungsphase erfolgt ein interaktiver Informationsinput. Anschließend werden die Inhalte in Form von Experimenten angewendet und vertieft. Für die Sicherungsphase wird die Klasse in zwei Gruppen eingeteilt: Die eine Hälfte der Lernenden erstellt eigene Erklärvideos, wohingegen die andere Hälfte Aufgaben auf den iPads bearbeitet. Die Evaluation erfolgt unter anderem im Hinblick auf den Fachwissenszuwachs und die Einschätzung der Lernmaterialien durch die Schüler:innen. Der Vergleich beider Gruppen ermöglicht Aussagen über die Effektivität beider Sicherungsmaßnahmen.2022-06-15T00:00:00ZGestaltung von Chemieunterricht für diverse Lerngruppen – ein Beispielunterricht zum Planungsmodell ChemDive
http://hdl.handle.net/2003/42357
Title: Gestaltung von Chemieunterricht für diverse Lerngruppen – ein Beispielunterricht zum Planungsmodell ChemDive
Authors: Holländer, Monika; Böhm, Katharina; Jasper, Leonie; Melle, Insa
Abstract: Durch bildungspolitische und gesellschaftliche Veränderungen sind Lehrkräfte im deutschen Schulsystem mit einer zunehmend heterogenen Schülerschaft konfrontiert, nicht nur in inklusiven Lerngruppen. Dieser Diversität gilt es positiv zu begegnen, indem Unterricht von Beginn an für alle Lernenden zugänglich geplant und durchgeführt wird. Ein Konzept für die Gestaltung eines solchen Unterrichts ist das Universal Design for Learning, kurz UDL. Die Implementierung des nicht fachspezifischen UDL-Rahmenkonzepts in den Fachunterricht kann jedoch für (angehende) Lehrkräfte ein Hindernis darstellen. Vor diesem Hintergrund wurde auf Basis des UDL und anknüpfend an gängige Phasen- bzw. Verlaufsplankonzepte aus dem naturwissenschaftsdidaktischen Bereich das Planungsmodell ChemDive entwickelt, das Anregungen für konkrete Umsetzungsmöglichkeiten für einen universell zugänglichen Chemieunterricht bietet. ChemDive wird anhand eines Unterrichtsbeispiels erläutert und veranschaulicht.2022-06-15T00:00:00ZOrganic four‐electron redox systems based on bipyridine and phenanthroline carbene architectures
http://hdl.handle.net/2003/42354
Title: Organic four‐electron redox systems based on bipyridine and phenanthroline carbene architectures
Authors: Antoni, Patrick W.; Golz, Christopher; Hansmann, Max M.
Abstract: Novel organic redox systems that display multistage redox behaviour are highly sought-after for a series of applications such as organic batteries or electrochromic materials. Here we describe a simple strategy to transfer well-known two-electron redox active bipyridine and phenanthroline architectures into novel strongly reducing four-electron redox systems featuring fully reversible redox events with up to five stable oxidation states. We give spectroscopic and structural insight into the changes involved in the redox-events and present characterization data on all isolated oxidation states. The redox-systems feature strong UV/Vis/NIR polyelectrochromic properties such as distinct strong NIR absorptions in the mixed valence states. Two-electron charge–discharge cycling studies indicate high electrochemical stability at strongly negative potentials, rendering the new redox architectures promising lead structures for multi-electron anolyte materials.2022-03-17T00:00:00ZBreathing porous liquids based on responsive metal-organic framework particles
http://hdl.handle.net/2003/42351
Title: Breathing porous liquids based on responsive metal-organic framework particles
Authors: Koutsianos, Athanasios; Pallach, Roman; Frentzel-Beyme, Louis; Das, Chinmoy; Paulus, Michael; Sternemann, Christian; Henke, Sebastian
Abstract: Responsive metal-organic frameworks (MOFs) that display sigmoidal gas sorption isotherms triggered by discrete gas pressure-induced structural transformations are highly promising materials for energy related applications. However, their lack of transportability via continuous flow hinders their application in systems and designs that rely on liquid agents. We herein present examples of responsive liquid systems which exhibit a breathing behaviour and show step-shaped gas sorption isotherms, akin to the distinct oxygen saturation curve of haemoglobin in blood. Dispersions of flexible MOF nanocrystals in a size-excluded silicone oil form stable porous liquids exhibiting gated uptake for CO2, propane and propylene, as characterized by sigmoidal gas sorption isotherms with distinct transition steps. In situ X-ray diffraction studies show that the sigmoidal gas sorption curve is caused by a narrow pore to large pore phase transformation of the flexible MOF nanocrystals, which respond to gas pressure despite being dispersed in silicone oil. Given the established flexible nature and tunability of a range of MOFs, these results herald the advent of breathing porous liquids whose sorption properties can be tuned rationally for a variety of technological applications.2023-07-14T00:00:00Z„Das verbrannte Holz betreibt ja keine Fotosynthese mehr“ – Analyse der Lernhürden bei der Erstellung von Kohlenstoffkreisläufen anhand von Unterrichtsvideos
http://hdl.handle.net/2003/42349
Title: „Das verbrannte Holz betreibt ja keine Fotosynthese mehr“ – Analyse der Lernhürden bei der Erstellung von Kohlenstoffkreisläufen anhand von Unterrichtsvideos
Authors: Krabbe, Christina; Thelen, Frederic; Simonds, Kathryn; Melle, Insa
Abstract: Die Nutzung von fossilen und regenerativen Rohstoffen zur Energiegewinnung und deren Beitrag zum Kohlenstoffkreislauf ist ein komplexes Thema, welches unterschiedliche (Schüler:innen-)Schwierigkeiten mit sich bringt. Darum ist es umso wichtiger, bei der Planung eines solchen Unterrichts diese Lernhürden zu berücksichtigen. Um Studierende dafür zu professionalisieren, bietet sich die Arbeit mit Videos von realem Unterricht an. Daher wurden Unterrichtsvideos erstellt und deren Einsatz in einer Lehrveranstaltung beforscht. Die Videos zeigen Schüler:innen bei der Erstellung von Kohlenstoffkreisläufen und offenbaren (Schüler:innen-)Schwierigkeiten im Prozess der Aufgabenbearbeitung. Der Beitrag führt literaturbekannte Lernhürden zum Thema auf und zeigt anhand der ausgewerteten Ergebnisse der Videoanalysen, welche (Schüler:innen-)Schwierigkeiten Studierende anhand der entwickelten Unterrichtsvideos identifizieren können.2022-06-15T00:00:00ZUltra‐long lived luminescent triplet excited states in cyclic (alkyl)(amino)carbene complexes of Zn(II) halides
http://hdl.handle.net/2003/42327
Title: Ultra‐long lived luminescent triplet excited states in cyclic (alkyl)(amino)carbene complexes of Zn(II) halides
Authors: Mrózek, Ondřej; Gernert, Markus; Belyaev, Andrey; Mitra, Mousree; Janiak, Lars; Marian, Christel M.; Steffen, Andreas
Abstract: The high element abundance and d10 electron configuration make ZnII-based compounds attractive candidates for the development of novel photoactive molecules. Although a large library of purely fluorescent compounds exists, emission involving triplet excited states is a rare phenomenon for zinc complexes. We have investigated the photophysical and -chemical properties of a series of dimeric and monomeric ZnII halide complexes bearing a cyclic (alkyl)(amino)carbene (cAAC) as chromophore unit. Specifically, [(cAAC)XZn(μ-X)2ZnX(cAAC)] (X=Cl (1), Br (2), I (3)) and [ZnX2(cAAC)(NCMe)] (X=Br (4), I (5)) were isolated and fully characterized, showing intense visible light photoluminescence under UV irradiation at 297 K and fast photo-induced transformation. At 77 K, the compounds exhibit improved stability allowing to record ultra-long lifetimes in the millisecond regime. DFT/MRCI calculations confirm that the emission stems from 3XCT/LEcAAC states and indicate the phototransformation to be related to asymmetric distortion of the complexes by cAAC ligand rotation. This study enhances our understanding of the excited state properties for future development and application of new classes of ZnII phosphorescent complexes.2022-05-18T00:00:00ZChelating phosphorus–an O, C, O-coordinating pincer-type ligand coordinating PIII and PV centres
http://hdl.handle.net/2003/42323
Title: Chelating phosphorus–an O, C, O-coordinating pincer-type ligand coordinating PIII and PV centres
Authors: Gock, Michael; Lutter, Michael; Pintus, Anna; Schollmeier, Dieter; Arca, Massimiliano; Lippolis, Vito; Jurkschat, Klaus
Abstract: The sequence of reactions of the phosphorus-containing aryllithium compound 5-t-Bu-1,3-[(P(O)(O-i-Pr)2]2C6H2Li (ArLi) with Ph2PCl, KMnO4, elemental sulfur and elemental selenium, respectively, gave the aryldiphenylphosphane chalcogenides 5-t-Bu-1,3-[(P(O)(O-i-Pr)2]2C6H2P(E)Ph2 (1, E=O; 2, E=S; 3, E=Se). Compound 1 partially hydrolysed giving [5-t-Bu-1-{(P(O)(O-i-Pr)2}-3-{(P(O)(OH)2}C6H2]P(O)Ph2 (4). The reaction of ArLi with PhPCl2 provided the benzoxaphosphaphosphole [1(P), 3(P)-P(O)(O-i-Pr)OPPh-6-t-Bu-4-P(O)(O-i-Pr)2]C6H2P (5i) as a mixture of the two diastereomers. The oxidation of 5i with elemental sulfur gave the benzoxaphosphaphosphole sulfide [1(P), 3(P)-P(O)(O-i-Pr)OP(S)Ph-6-t-Bu-4-P(O)(O-i-Pr)2]C6H2 (5) as pair of enantiomers P1(R), P3(S)/P1(S), P3(R) of the diastereomer (RS/SR)-5 (5b). The aryldiphenylphosphane 5-t-Bu-1,3-[(P(O)(O-i-Pr)2]2C6H2PPh2 (6) was obtained from the reaction of the corresponding aryldiphenylphosphane sulfide 2 with either sodium hydride, NaH, or disodium iron tetracarbonyl, Na2Fe(CO)4. The oxidation of the aryldiphenylphosphane 6 with elemental iodine and subsequent hydrolysis yielded the aryldiphenyldioxaphosphorane 9-t-Bu-2,6-(OH)-4,4-Ph2-3,5-O2-2,6-P2-4λ5-P-[5.3.1.0]-undeca-1(10),7(11),8-triene (7). Both of its diastereomers, (RR/SS)-7 (7a) and (RS/SR)-7 (7b), were separated as their chloroform and i-propanol solvates, 7a⋅2CHCl3 and 7b⋅i-PrOH, respectively. DFT calculations accompanied the experimental work.2022-07-12T00:00:00ZSuppression of liquid-liquid phase separation and aggregation of antibodies by modest pressure application
http://hdl.handle.net/2003/42322
Title: Suppression of liquid-liquid phase separation and aggregation of antibodies by modest pressure application
Authors: Fetahaj, Zamira; Jaworek, Michel W.; Oliva, Rosario; Winter, Roland
Abstract: The high colloidal stability of antibody (immunoglobulin) solutions is important for pharmaceutical applications. Inert cosolutes, excipients, are generally used in therapeutic protein formulations to minimize physical instabilities, such as liquid–liquid phase separation (LLPS), aggregation and precipitation, which are often encountered during manufacturing and storage. Despite their widespread use, a detailed understanding of how excipients modulate the specific protein-protein interactions responsible for these instabilities is still lacking. In this work, we demonstrate the high sensitivity to pressure of globulin condensates as a suitable means to suppress LLPS and subsequent aggregation of concentrated antibody solutions. The addition of excipients has only a minor effect. The high pressure sensitivity observed is due to the fact that these flexible Y-shaped molecules create a considerable amount of void volume in the condensed phase, leading to an overall decrease in the volume of the system upon dissociation of the droplet phase by pressure already at a few tens of to hundred bar. Moreover, we show that immunoglobulin molecules themselves are highly resistant to unfolding under pressure, and can even sustain pressures up to about 6 kbar without conformational changes. This implies that immunoglobulins are resistant to the pressure treatment of foods, such as milk, in high-pressure food-processing technologies, thereby preserving their immunological activity.2022-06-27T00:00:00ZGold(I) NHC catalysts immobilized to amphiphilic block copolymers: a versatile approach to micellar gold catalysis in water
http://hdl.handle.net/2003/42321
Title: Gold(I) NHC catalysts immobilized to amphiphilic block copolymers: a versatile approach to micellar gold catalysis in water
Authors: Petersen, Hanne; Ballmann, Monika; Krause, Norbert; Weberskirch, Ralf
Abstract: Fifteen gold(I)-NHC-functionalized amphiphilic block copolymers that differ in the type of linker (ethyl, pentyl, octyl and benzyl) that attaches the gold(I) NHC catalyst to the block copolymer backbone, as well as, the substitution pattern of the NHC ligand (i. e. mesityl, methyl, 2,6-diisopropylphenyl and n-hexyl) were synthesized by a reversible addition and fragmentation transfer (RAFT) polymerization process. Micelle formation of the gold(I) NHC polymers was analyzed by electron microscopy and dynamic light scattering and revealed spherical and rod-like particles from 12 to 96 nm. In the micellar, gold(I) catalyzed cycloisomerization of an allene to the corresponding dihydrofuran, linker flexibility and substitution pattern of the NHC-ligand showed a strong effect on the catalytic activity. Best results were obtained were obtained for gold(I) NHC catalysts bound to the polymer backbone by pentyl linker whereas the rather stiff benzyl linker gave lowest catalyst conversion. Moreover, the polymer catalyst could be recycled in four consecutive runs and gave activities from 35 to 84 % in the fourth run and underscores the importance of fine tuning structural parameters to achieve high conversion under micellar reaction conditions.2022-06-23T00:00:00ZTargeting RNA-protein interactions with peptides and small molecule inhibitors
http://hdl.handle.net/2003/42315
Title: Targeting RNA-protein interactions with peptides and small molecule inhibitors
Authors: Chang, Jen-Yao
Abstract: WD repeat domain 5 (WDR5) is a scaffold protein involved in protein-protein or RNA-protein complexes, and most of these complexes play an important role in various epigenetic modulation processes. In particular, some of the long non-coding RNAs (lncRNAs) rely on the formation of the lncRNA-WDR5 complex to exert their epigenetic modulation, such as the upregulation of the lncRNA itself. If an oncogenic lncRNA relies on this pathway to maintain its expression level, it is possible to inhibit its positive feedback loop and thus reduce the expression of the oncogenic lncRNA. Therefore, this thesis focuses on investigating the potential of targeting lncRNA-WDR5 interactions, followed by evaluating the downregulation of lncRNA in cellulo.
Targeting lncRNA-WDR5 interactions could be achieved by designing an inhibitor that targets the same binding pocket on WDR5. Several lncRNA are reported to recognize WDR5-binding motif (WBM) site, as a result, a study of structure-activity relationship of peptide-based inhibitors derivatize from protein-WDR5 interactions to target WBM site are performed. Further optimizations are performed by tailor-design macrocycle structure to facilitate peptides adopt the binding conformation and indeed the binding affinity is improved. The ability of macrocycle to disrupt lncRNA-protein interaction is verified by competitive in vitro RNA immunoprecipitation (iv-RIP).
Cellular experiments are performed to determine whether targeting lncRNA-WDR5 interactions leads to downregulation of the lncRNA itself. Several strategies show their ability to enhance cell uptake of macrocycles. Finally, two molecules show that targeting lncRNA-WDR5 complexes can lead to reduction of the lncRNA itself and that different lncRNA have different sensitivity to the treatment.2023-01-01T00:00:00ZA bacterial surface display platform for the discovery of cytosine modification readers from cDNA libraries
http://hdl.handle.net/2003/42314
Title: A bacterial surface display platform for the discovery of cytosine modification readers from cDNA libraries
Authors: Schiller, Damian
Abstract: 5-methylcytosine (5mC) occurs in palindromic cytosine guanine dyads (CpGs) of mammalian genomes and is a key element of epigenetic transcription regulation. Central to these regulatory functions is the ability of cytosine modifications to modulate the interaction of chromatin proteins with DNA. In this context, reader proteins are known to selectively recognize the cytosine modification. Interactome profiling studies based on pulldowns of nuclear extracts in combination with mass spectrometry-based (MS) proteomics have been the main approach to discovering readers of 5mC. However, this approach may miss important (anti-)readers due to the competition of proteins for the probe and low expression levels. Moreover, direct readers cannot be distinguished from indirect binders of protein complexes.
In the scope of this thesis, a bacterial surface display system for discovering novel reader candidates from human cDNA was established. In detail, our approach offers screenings of cDNA-encoded protein libraries independent of their endogenous expression levels and without competition with other proteins. It further allows for rapid iterative FACS selections with defined, fluorescently labeled on- and off-target DNA probes. Furthermore, the system benefits from the fast protein expression machinery and growth of bacterial cells. We created surface display libraries of full-length and fragmented coding sequences (CDS) from human cDNA and demonstrated the compatibility of the Intimin surface display platform with displaying human proteins and protein fragments. Moving on, we proved the functionality of our selection system by enriching known 5mC reader candidates from a display library of human thyroid cDNA. In addition, we were able to identify novel reader candidates. Therefore, this study offers a promising tool to complement existing efforts in discovering 5mC reader candidates. Furthermore, the tool bears the potential to be extended to the oxidized derivates of 5mC and their combinations in CpGs, which have not been investigated so far.2023-01-01T00:00:00ZBiophysikalische Einblicke in heterogene Modellbiomembranen, G-Quadruplexe und Eigenschaften der Flüssig-Flüssig-Phasentrennung von Peptiden
http://hdl.handle.net/2003/42313
Title: Biophysikalische Einblicke in heterogene Modellbiomembranen, G-Quadruplexe und Eigenschaften der Flüssig-Flüssig-Phasentrennung von Peptiden
Authors: Manisegaran, Magiliny
Abstract: Die biophysikalische Chemie ist eine Forschungsdisziplin, die Antworten auf medizinische und biochemische Fragen liefert. Modellsysteme biologischer Makromoleküle werden verwendet, um ein umfassendes Verständnis biologischer Prozesse zu fördern. Dies kann Ansätze für die Diagnose und Behandlung von Krankheiten liefern. In dieser Arbeit werden physikalisch-chemische Einflüsse auf heterogene Modellbiomembranen, G-Quadruplexe und die Eigenschaften der Flüssig-Flüssig-Phasentrennung von Peptiden untersucht: Das erste Thema in der Arbeit ist der Einfluss des Immunregulators 25-Hydroxycholesterol auf das thermotrope und barotrope Phasenverhalten und die Struktur von Modellbiomembranen, das zweite die Bindungseigenschaften von Berberin an den G-Quadruplex der RG-1-Sequenz der RNA des SARS-CoV-2-Virus unter verschiedenen Lösungsbedingungen und das letzte Thema behandelt die Wechselwirkung zwischen zwei Phasenkoexistenzen verschiedener biologischer Systeme: Heterogene Membransysteme zeigen eine Phasenkoexistenz, die als Kompartimentierung der Zellmembran verstanden werden kann. Proteine und Nukleinsäuren können die Eigenschaft der Flüssig-Flüssig-Phasentrennung aufweisen.2023-01-01T00:00:00ZUntersuchung von Zn(II)-Komplexen als preisgünstige Triplett-Emitter
http://hdl.handle.net/2003/42312
Title: Untersuchung von Zn(II)-Komplexen als preisgünstige Triplett-Emitter
Authors: Kuhnt, Julia
Abstract: Die Entwicklung nachhaltiger Alternativen zu etablierten Emittermaterialien basierend auf Iridium(III) und Platin(II) stellt eine aktuelle Herausforderung dar. Zink(II) bietet aufgrund der hohen Verfügbarkeit eine vielversprechende Möglichkeit, den Schutz seltener Metalle und damit die Verfügbarkeit aller chemischen Elemente für zukünftige Generationen zu garantieren. Allerdings erschwert die hohe Redox-Stabilität von Zink(II) das Design effizienter Emitter, sodass nur ein geringes Forschungsinteresse auf diesem Gebiet besteht. Im Fokus dieser Arbeit stehen literaturbekannte Zn(II)-Emitter, die nach heutiger Betrachtung Fragen bezüglich ihrer Emissionsmechanismen aufwerfen. Durch umfangreiche Studien werden diese erfolgreich aufgeklärt und das versteckte Potential der Verbindungen herausgearbeitet. Für diese Untersuchungen ist es unabdingbar, auf die Komplexität multiexponentieller Zerfälle einzugehen und es wird eine Vorgehensweise für die Analysen basierend auf gemittelten Lebenszeiten herausgearbeitet. Hierfür werden drei Annahmen formuliert und validiert, die die Beteiligung der einzelnen Lebenszeitkomponenten in demselben Emissionsmechanismus, die Unabhängigkeit von der Anregungswellenlänge und die Temperaturunabhängigkeit des Extinktionskoeffizienten beinhalten. Mithilfe der photophysikalischen Daten werden zudem kinetische Methoden angewendet, um strahlende und strahlungslose Ratenkonstanten für einen ineffizienten Emitter abzuschätzen und so Emissionsmechanismen vorherzusagen.2023-01-01T00:00:00ZTransition metal-free cycloisomerization of propargylic amides to oxazoles in hexafluoroisopropanol (HFIP)
http://hdl.handle.net/2003/42292
Title: Transition metal-free cycloisomerization of propargylic amides to oxazoles in hexafluoroisopropanol (HFIP)
Authors: Jankowski, Nicholas; Dietrich, Julian; Krause, Norbert
Abstract: A transition metal-free method for the cycloisomerization of propargylic amides to oxazoles was developed. The reaction utilizes in situ generated hydrogen chloride in hexafluoroisopropanol (HFIP). With the aid of Design of Experiments optimization a wide range of substrates was transformed into the desired oxazoles. The method allows product formation without side reactions eliminating the need for extensive work-up and purification.2022-08-08T00:00:00ZRevisiting ligand-to-ligand charge transfer phosphorescence emission from zinc(II) diimine bis-thiolate complexes: it is actually thermally activated delayed fluorescence
http://hdl.handle.net/2003/42274
Title: Revisiting ligand-to-ligand charge transfer phosphorescence emission from zinc(II) diimine bis-thiolate complexes: it is actually thermally activated delayed fluorescence
Authors: Lüdtke, Nora; Kuhnt, Julia; Heil, Tabea; Steffen, Andreas; Marian, Christel M.
Abstract: In this work we revisit and re-evaluate the photophysical behavior of the prototypical complex [Zn(SC6H4-4-R)2(phen)] as the most in-depth studied type of Zn(II)-based triplet state emitters. Previous reports suggest population of ligand-to-ligand charge transfer (LLCT) states via phenanthroline localized ππ* states, with an energy barrier between the 3ππ* and the bk;1/3LLCT states requiring thermal activation. Besides very weak prompt fluorescence, the dominant radiative mechanism was attributed to phosphorescence. Our photophysical studies, including temperature-dependent quantum yield determination and time-resolved luminescence measurements, reveal a high radiative rate constant kr=3.5×105 s−1 at room temperature and suggest thermally activated luminescence as the major emission path. High-level DFT/MRCI calculations confirm this assignment and provide deeper insight into the excited-state kinetics, including rate constants for the (reverse) intersystem crossing processes. Thus, our study demonstrates that further optimization of the photophysical properties of this type of Zn(II) triplet exciton emitter bears great potential for future application in devices.2022-09-04T00:00:00ZEfficient synthesis of macromolecular DO3A@Gn derivatives for potential application in MRI diagnostics: from polymer conjugates to polymer nanoparticles
http://hdl.handle.net/2003/42273
Title: Efficient synthesis of macromolecular DO3A@Gn derivatives for potential application in MRI diagnostics: from polymer conjugates to polymer nanoparticles
Authors: Kampmann, Anne-Larissa; Hiller, Wolf; Weberskirch, Ralf
Abstract: Herein, the synthesis of three different macromolecular DO3A@Gn conjugates based on poly(2-oxazoline)s is presented. Therefore, poly(2-methyl-2-oxazoline) is synthesized by a ring-opening, cationic polymerization and the polymerization is terminated with DO3A(tBu)3. The best results are obtained after 48 h at 120 °C with degree of termination of 86%. After deprotection of the DO3A ligand and complexation with Gn3+, relaxivity as measured with a magnetic field strength of 9.4 T (400 MHz) reveals values for r1 of up to 2.32 mm−1 s−1. The concept is extended to a block copolymer based on 2-heptyl-2-oxazoline and 2-methyl-2-oxazoline that is again terminated with DO3A(tBu)3 to form micelles with a size of 12.6 ± 0.7 nm after DO3A(tBu)3 termination and deprotection of the 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-N,N,N,N-tetraacetic acid ligand. After complexation with Gn3+, relaxivity r1 is 10.1 mm−1 s−1 as determined from the slope of the plot of 1/T1 against the gadolinium(III) concentration at 9.4 T. Finally, crosslinked nanoparticles are prepared from amphiphilic macro-monomers that form micelles in water and are crosslinked throughout the core in the presence of azoisobutyronitrile (AIBN). The nanoparticle is 32.9 ± 7.8 nm in size after Gn3+ complexation and reveals a relaxivity r1 of 6.77 mm−1 s−1.2022-09-10T00:00:00ZTowards substrate-reagent interaction of Lochmann-Schlosser bases in THF: bridging THF hides potential reaction site of a chiral superbase
http://hdl.handle.net/2003/42272
Title: Towards substrate-reagent interaction of Lochmann-Schlosser bases in THF: bridging THF hides potential reaction site of a chiral superbase
Authors: Brieger, Lukas; Schrimpf, Tobias; Scheel, Rebecca; Unkelbach, Christian; Strohmann, Carsten
Abstract: The metalation of N,N-dimethylaminomethylferrocene in THF by the superbasic mixture of nBuLi/KOtBu proceeds readily at low temperatures to afford a bimetallic Li2K2 aggregate containing ferrocenyl anions and tert-butoxide. Starting from an enantiomerically enriched ortho-lithiated aminomethylferrocene, an enantiomerically pure superbase can be prepared. The molecular compound exhibits superbasic behavior deprotonating N,N-dimethylbenzylamine in the α-position and is also capable of deprotonating toluene. Quantum chemical calculations provide insight into the role of the bridging THF molecule to the possible substrate–reagent interaction. In addition, a benzylpotassium alkoxide adduct gives a closer look into the corresponding reaction site of the Lochmann–Schlosser base that is reported herein.2022-09-13T00:00:00ZA silicon-stereogenic silanol - 18O-isotope labeling and stereogenic probe reveals hidden stereospecific water exchange reaction
http://hdl.handle.net/2003/42266
Title: A silicon-stereogenic silanol - 18O-isotope labeling and stereogenic probe reveals hidden stereospecific water exchange reaction
Authors: Langenohl, Felix; Rösler, Jonas; Zühlke, Sebastian; Kirchhoff, Jan-Lukas; Strohmann, Carsten
Abstract: A silicon-stereogenic aminosilanol was isolated in excellent diastereomeric ratio and the absolute configuration was determined. The silanol is configurative and condensation stable in solution and shows stereoselective transformations with a clean stereospecific pathway in follow-up reactions, which leads to the isolation of a silicon-stereogenic zinc complex and siloxane compounds. Investigations with 18O-labelled water and mass spectrometry analysis revealed an otherwise hidden exchange of oxygen atoms of silanol and water in solution that proceeds with retention of the configuration at the silicon center. This novel combination of a stereochemical probe and isotopic labeling in a silicon-stereogenic compound opens new analytic possibilities to study stereochemical courses of reactions with the aid of chiral silanols mechanistically.2022-09-27T00:00:00ZEntwicklung und Synthese neuartiger Silicium-basierter Fluorid-Akzeptoren für Anwendungen als Radiotracer in der Positronen-Emissions-Tomographie
http://hdl.handle.net/2003/42260
Title: Entwicklung und Synthese neuartiger Silicium-basierter Fluorid-Akzeptoren für Anwendungen als Radiotracer in der Positronen-Emissions-Tomographie
Authors: Mawick, Matthias
Abstract: Die Positronen-Emissions-Tomographie zählt zu den wichtigsten diagnostischen Methoden der Nuklearmedizin. In Kombination mit der Computertomographie ermöglicht sie eine nichtinvasive Bildgebung zur morphologischen und funktionellen Darstellung von Gewebe. Für die Aufnahme der Bilder werden den behandelten Personen Radiopharmazeutika verabreicht, die einen radioaktiv markierten Tracer enthalten und die Aufnahme der Schnittbilder erst ermöglichen. Abhängig vom jeweiligen Einsatzgebiet kann eine Vielzahl von Verbindungsklassen als Radiotracer eingesetzt werden. Eine noch relativ neue, aber bereits klinisch eingesetzte Variante stellen die Silicium-basierten Fluorid-Akzeptoren (SiFA-Verbindungen) dar. Diese enthalten eine 19F Si-Bindung, die unter milden Reaktions-bedingungen durch einen Isotopenaustausch mit radioaktivem 18F markiert werden kann.
Der Fokus dieser Arbeit liegt auf der Erweiterung des Spektrums einsetzbarer Markierungsvorläufer. Zunächst wurde versucht, die bekannten SiFA-Verbindungen durch Konjugation an wasserlösliche, bifunktionalisierte Cyclodextrine hydrophiler zu machen, um die Anwendbarkeit in vivo zu vereinfachen. Anschließend konnten SiFA-Derivate mit bisher unbekanntem Substitutionsmuster am Siliciumatom synthetisiert, sowie einige ihrer experimentellen und theoretischen hydrolytischen Halbwertszeiten ermittelt werden.
Schließlich gelang die Synthese neuartiger CycloSiFA-Derivate als Weiterentwicklung der klassischen [19F]SiFA-Markierungsvorläufer. Diese enthalten eine Si N-Bindung und lassen sich unter Ringöffnung markieren. Dabei werden Gleichgewichtsreaktionen umgangen, sodass idealerweise Radiotracer mit hohen Aktivitäten zugänglich sind. Zusätzlich konnte eine kleine Bibliothek funktionalisierter CycloSiFA-Verbindungen aufgebaut werden, die eine effiziente On-Demand-Kupplung an biologisch aktive Moleküle ermöglichen sollte. Neben Experimenten zu Folgereaktionen sowie Testreaktionen zur Kupplung an kleinere Moleküle, konnte durch eine Kooperation mit der Forschungsgruppe SCHIRRMACHER auch ein Protokoll zur Radiomarkierung der CycloSiFA-Derivate mit 18F erarbeitet werden.2023-01-01T00:00:00ZDesign, synthesis and biological evaluation of tool compounds for the cellular investigation of deubiquitinases
http://hdl.handle.net/2003/42255
Title: Design, synthesis and biological evaluation of tool compounds for the cellular investigation of deubiquitinases
Authors: Schmidt, Mirko
Abstract: The ubiquitin proteasomal system, is an important mediator of protein homeostasis through ubiquitination of substrates, but also coordinates various other functions throughout the cell. Deubiquitinases (DUBs) are essential regulators within this system. They are a specialized class of proteases that can cleave ubiquitin from its substrates and their dysregulation is involved in the development of various diseases. However, the understanding regarding their substrates, cellular localization, their involvement in cellular signaling and structural features remains limited. Despite the enormous therapeutical potential only a few DUB inhibitors are known to date. Therefore, novel tool compounds are of urgent need to enhance the understanding of DUBs in a cellular setting.
This thesis describes the discovery, chemical synthesis and biological evaluation of such tool compounds for investigating DUBs in a living environment. To accomplish this, literature-known compounds were resynthesized to introduce alkyne tags to utilize their use as activity-based probes (ABPs) in cell-based systems. An intensive cellular characterization of a dedicated small molecule ABP library targeting DUBs resulted in the discovery of the chemogenomic pair of probes GK13S and GK16S, usable for the selective investigation of the DUB UCHL1 in a living environment. The probes were used to unravel potential substrates and a cellular phenotype after the inhibition of UCHL1. Furthermore, this thesis describes the synthesis and cellular evaluation of PROTAC molecules to study DUBs beyond inhibition.
Altogether, this thesis should foster the understanding of DUBs and serve as a blueprint for the synthesis of further probe molecules to study these enzymes.2023-01-01T00:00:00ZÜber die Reaktivität gezielt ausgebildeter Lithiumalkylaggregate
http://hdl.handle.net/2003/42254
Title: Über die Reaktivität gezielt ausgebildeter Lithiumalkylaggregate
Authors: Kleinheider, Johannes
Abstract: Im Rahmen dieser Arbeit konnte das Verständnis von Aggregation und Reaktivität in ihrem direkten Zusammenhang ausgeweitet werden. Dabei wurde das Konzept der „frustrierten“ Aggregation entwickelt. Dieses baut auf der Annahme auf, dass sich durch die gezielte Anwendung von stöchiometrischen Mengen an Liganden in unpolarer, aprotischer Lösung eine gezielte Aggregation erreichen lässt, die die Öffnung einer Koordinationsstelle über das Spalten einer schwachen Koordination ermöglicht. Auf diese Weise lässt sich eine ungewöhnlich hohe Zugänglichkeit einer freien Koordinationsstelle am Lithiumalkyl erreichen, die eine ungewöhnlich hohe Reaktivität des Aggregates zur Folge hat. Die Überlegungen beruhen auf dem CIP-Effekt, welcher die Reaktivität und Selektivität von Lithiumalkylreaktionen mit der entsprechenden Vorkoordination verbindet. Folglich konnten auch statistische Einflüsse bei der Bildung von Vorkoordinationen beobachtet werden, welche bei energetisch geringen Unterschieden zwischen den jeweiligen Komplexen auftraten und in Abhängigkeit zum Aggregationsgrad der reaktiven Spezies standen. Anhand von Hexamethylaceton konnte zudem das Verständnis der gezielten Aggregatbildung erweitert werden, indem durch die sterische Überfrachtung in der Vorkoordination der Ablauf einer Additionsreaktion an das Keton unterbunden werden konnte. Stattdessen war es möglich eine selektive Lithiumhydrid-Transferreaktion zu beobachten, die auch mittels in situ FTIR-Spektroskopie verfolgt werden konnte. Durch die Zuhilfenahme quantenchemischer Berechnungen konnte der Reaktionsmechanismus dieses meist übersehenen Reaktionstypus aufgeklärt werden.2023-01-01T00:00:00ZNMR-spektroskopische und chromatographische Untersuchungen zur Bestimmung des Struktur- und Diffusionsverhaltens von amphiphilen Poly-2-oxazolinen, Homo- und Copolymeren
http://hdl.handle.net/2003/42210
Title: NMR-spektroskopische und chromatographische Untersuchungen zur Bestimmung des Struktur- und Diffusionsverhaltens von amphiphilen Poly-2-oxazolinen, Homo- und Copolymeren
Authors: Grabe, Bastian
Abstract: Die NMR-Spektroskopie, als eine der vielfältigsten Methoden der Analytik, hilft dabei Probleme von chemischem Interesse zu lösen und das Verständnis zu erweitern. Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Untersuchung der chemischen und physikalischen Eigenschaften von Polymeren mittels NMR-Spektroskopie unter Verwendung bekannter Methoden sowie neu entwickelter Applikationen. Besonderer Fokus liegt dabei auf der Diffusion Ordered Spectroscopy (DOSY). Für die Untersuchung von mizellaren Systemen wurden amphiphile Poly-2-oxazolin Block-Copolymere synthetisiert, die in wässriger Lösung Mizellen ausbilden. Es wurden hydrodynamische Radien als auch die Anteile der Mizellen in Lösung unter variablen Bedingungen bestimmt, um so die Abhängigkeit der physikalischen Eigenschaften von der chemischen Struktur zu verstehen. Zudem wurde in dieser Arbeit eine alternative Methode, basierend auf Diffusion Ordered Spectroscopy in Verbindung mit der inversen Laplace Transformation (ILT) entwickelt. werden. Die ermittelten 1H-Signalabfälle des DOSY-Experiments wurden mit Hilfe der ILT in eine Diffusionskoeffizientenverteilung des Polymers überführt. Die neu entwickelte DOSY-ILT Methode konnte erfolgreich an PS-b-PMMA Copolymeren etabliert und mit der chromatographischen Analyse verglichen werden. Für die Auftrennung und Analyse einer Oligostyrolmischung wurde eine neue Kopplung von LC und NMR entwickelt. Die 3D-LC-DOSY Experimente lieferten für die Charakterisierung der Substanzen hydrodynamische Radien, Molmassen sowie die Zusammensetzung der Analyten.2022-01-01T00:00:00ZQualitative and quantitative characterization of protein backbone heterogeneity by solid-state NMR spectroscopy
http://hdl.handle.net/2003/42203
Title: Qualitative and quantitative characterization of protein backbone heterogeneity by solid-state NMR spectroscopy
Authors: Burakova, Ekaterina
Abstract: Flexibility of the polypeptide chains plays the key role in protein functions, their un-, re- and misfolding pathways. Understanding the conformational landscape which protein chain occupies statically and dynamically is essential for understanding of cellular processes and ultimately, designing efficient drugs, safe pesticides, and industrial biotechnological processes. NMR spectroscopy is an indispensable technique studying disordered molecules site-specifically, both in solution and in the solid state.
Protein disorder covers the continuum between the static set of defined states and dynamic ensembles. Dynamic disorder can be converted into static disorder by freeze-trapping and studied in the solid phase. In solid-state NMR, static disorder manifests itself as the presence of additional peaks or, in the general case, severe line broadening. Converting the distribution of the resonance frequencies into conformational ensembles is not a trivial task due to the multitude of factors that contribute to the nuclear resonance frequencies.
This works proposes approaches to analyze residue-specific static disorder by interpretation and quantification of heterogeneously broadened peaks in multidimentsional solid-state NMR spectra. The engineered routines reconstruct the distributions of the backbone dihedral angles φ and ψ on the basis of database analyses and by help of dihedral-angle predictors. The workflows are tested on a model sample as well as on a naturally heterogeneous functional amyloid (EAS∆15 rodlet sample), where the obtained heterogeneity scores are compared to those formed by peak shape parameters (widths, intensities, and tilt). The analysis of the EAS ∆15 sample demonstrates the intrinsic power and weaknesses of the proposed analysis for rather challenging systems where the only available high-resolution physico-chemical data are the peak shapes in the solid-state NMR spectra.2023-01-01T00:00:00ZAufbau und Transformation Si-stereogener Verbindungen
http://hdl.handle.net/2003/42202
Title: Aufbau und Transformation Si-stereogener Verbindungen
Authors: Krupp, Anna
Abstract: Das Ziel dieser Arbeit war es, Si-stereogene Organosilane über substratinduzierte diastereoselektive Synthesen mit hohen Diastereomerenüberschüssen zu erzeugen, und die Reaktionen stereochemisch zu untersuchen. Im direkten Anschluss erfolgte die intensive Untersuchung des stereochemischen Ver¬laufs der Substitution der verbliebenen funktionellen Gruppen. Nach Synthese der Si-stereogenen Silane erfolgte die konfigurelle Aufklärung über die Co-Kristallisation mit der Halogenbrücken-Methode als nicht-kovalente Derivatisierung. Neben der Bestimmung der absoluten Konfigurationen der stereogenen Siliciumzentren konnte die Halogenbrücken-Methode auch zur Strukturaufklärung achiraler Verbindungen erfolgreich genutzt werden.
Die substratinduzierten diastereoselektiven Synthesen, basierend auf einem chiralen Aminrückgrat, lieferten bei der nucleophilen Substitution von Dimethoxysilanen mit Lithiumalkylen Si-stereogene Monomethoxysilane mit guten bis exzellenten Diastereomerenverhältnissen (bis > 99:1). Die wechselseitig komplementären Synthesen zeigen eine klare Stereodivergenz, wodurch experimentell eine kinetisch kontrollierte Reaktionsführung belegt ist.
Die Si-stereogenen Monomethoxysilane wurden in einem weiteren Schritt in Studien zur Trans-formation der verbliebenen Methoxygruppe durch Substitution mit verschiedenen Nucleophilen eingesetzt. Die nucleophile Substitution der Monomethoxysilane verläuft stereospezifisch unter Retention der Konfiguration am Silicium für primäre Lithiumalkyle, heterozyklische Lithiumalkyle und Hydride ab.
Durch die Kombination der experimentellen Beobachtungen mit quantenchemischen Studien konnten Mechanismushypothesen aufgestellt werden.2023-01-01T00:00:00ZKupfer(I)-Komplexierungen mit Silyl-substituierten Thioether-Liganden
http://hdl.handle.net/2003/42201
Title: Kupfer(I)-Komplexierungen mit Silyl-substituierten Thioether-Liganden
Authors: Wattenberg, Jonathan
Abstract: Die Arbeit gliedert sich in vier Themenblöcke aus der Übergangsmetallkoordinationschemie mit synthetisierten Silyl-substituierten Thioether-Liganden. Dabei standen die Kupfer(I)-halo¬ge¬nide im Fokus.
Im ersten Teil konnte mit 1,3-Dithian-substituierten Liganden eine Vielzahl von molekularen und polymeren Komplexen synthetisiert und strukturell aufgeklärt werden. Sowohl monometallische Komplexe der Kupfer(I)-halogenide als auch bimetallische Komplexe, bestehend aus den Halogeniden der Zinkgruppenelemente und Kupfer(I)-halogenide, konnten untersucht werden.
Im zweiten Teil wurden die Bindungssituationen von Kupfer(I)-iodid-Koordinationspolymeren analysiert, die selten beobachtete π-koordinierende C–C-Doppelbindungen enthielten. Es konnte gezeigt werden, dass Si- und Ge-gebundene Vinyl-Funktionen durch Polarisationseffekte elektronisch angereichert werden und so, anders als im C-Homolog, mit Kupfer(I)-iodid wechselwirken konnten.
Der dritte Teil beschreibt die Synthese von α-Silylthioethern, deren Struktur vom Thioanisol abgeleitet wurde. Drei der synthetisierten, monodentaten Liganden bildeten quadratisch-planare Palladium(II)-chlorid trans-Komplexe, deren temperaturabhängige Konfigurations¬stabilität im Festkörper und in Lösung untersucht wurde.
Im vierten Teil konnte über UV-induzierte Thiol-En-Reaktionen eine Reihe von sechs β-Silylthioethern synthetisiert werden, welche mit Kupfer(I)-iodid eindimensionale Koordinationspolymere bildeten. Abhängig vom Substitutionsmuster am Liganden wurden Komplexe mit dimeren oder mit tetrameren Metalleinheiten strukturell aufgeklärt. Für die metallreichen Koordinationspolymere konnten phosphoreszierende Eigenschaften beobachtet und charakterisiert werden.2023-01-01T00:00:00ZA cell fusion interaction network during the mating of Saccharomyces cerevisiae
http://hdl.handle.net/2003/42197
Title: A cell fusion interaction network during the mating of Saccharomyces cerevisiae
Authors: Hagemeier, Angela
Abstract: Cell-cell fusion is essential for sexual reproduction and occurs when the lipid membranes of two
distinct cells merge into one continuous bilayer. While in recent years some general aspects have
been uncovered, the underlying molecular mechanism remains poorly understood. Mating of
haploid Saccharomyces cerevisiae cells of the opposite sex provides an ideal model system to
study plasma membrane (PM) fusion in eukaryotic organisms. In this work, a multicolor flow
cytometry assay based on fluorescent complementation (BiFC) of split-GFP was adapted to screen
a customized yeast knockout library (YKO) for fusion defects. In total, 28 mutants were identified
that exhibited fusion levels at least as defective as .prm1, a known regulator of this step. Like
.prm1, the majority displayed a bilateral fusion defect.
The remaining part of the work focused on an in-depth analysis of select gene of interest (GOI)
mutants. Investigations of synergistic relationships in trans revealed an interaction network
operating during PM fusion involving at least four independent yet partially overlapping fusion
pathways. Previously two pathways with ERG6 and PRM1 have been reported. VMA2, a gene
encoding a subunit of the vacuolar membrane ATPase (V-ATPase), was revealed in this work to
operate on a third pathway. The findings show that the V-ATPase i) promotes cell fusion indirectly
by acidifying endomembrane organelles, ii) facilitates both cell wall (CW) remodeling and PM
fusion stages approximately equally, and iii) synergistically interacts with 12 other genes identified
in this study. CAX4 was identified to operate on the fourth pathway and the only novel gene found
to synergize with PRM1. Further investigations revealed that Prm1p was less abundant in a .cax4
sensitized background, while its localization is not affected.
Finally, this work discovered that several subunits of the RNA polymerase II mediator complex are
involved in promoting early and late stages of yeast mating. The deletion of subunits leads to
varying degrees of defects in cell pairing and pheromone secretion as well as CW remodeling and
PM fusion. Together, these findings suggest that the mediator complex acts as a master regulator
of cell fusion perhaps by synchronizing the expression of mating genes needed at crucial time
points starting from the digestion of the CW up to the merging of the PMs.2023-01-01T00:00:00ZTranscriptomics-based developmental toxicity and cardiotoxicity assessment using induced pluripotent stem cells
http://hdl.handle.net/2003/42196
Title: Transcriptomics-based developmental toxicity and cardiotoxicity assessment using induced pluripotent stem cells
Authors: Cherianidou, Anna
Abstract: This PhD study focuses on developing an innovative in vitro test system using human-induced pluripotent stem cells (hiPSCs) to assess developmental toxicity. Traditional approaches rely on animal studies, which can be complex, costly, and less applicable to humans. The study introduces the UKK2 protocol combined with hiPSCs and transcriptomics to evaluate both developmental teratogenicity and cardiotoxicity. The research involves differentiating hiPSCs into various germ layers and cardiomyocytes in the presence of substances known to have embryotoxic effects. Gene expression analyses identify gene signatures associated with early embryotoxicity and cardiotoxicity. The study's first phase assesses the effectiveness of the UKK2 test system with 23 teratogens and 16 non-teratogens at varying concentrations. A classifier with high accuracy (90% to 92%) is established for predicting teratogens using the UKK2 test system. The research extends the UKK2 protocol to evaluate developmental cardiotoxicity (UKK-CTT). A gene signature predicts the inhibitory potential of teratogens and non-teratogens in cardiomyogenesis. The "Developmental Cardiotoxicity Index" (CDI31g) effectively distinguishes compounds affecting hiPSC differentiation into functional cardiomyocytes. This study anticipates a promising future for human-based in vitro models in developmental toxicity screening, improving drug testing and teratogenicity prediction. These advancements provide valuable insights into drug-induced developmental toxicity during cardiac organogenesis, enhancing our understanding of critical embryonic development phases and drug safety during vulnerable periods.; Diese Doktorarbeit konzentriert sich auf die Entwicklung eines innovativen In-vitro-Testsystems unter Verwendung von menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) zur Bewertung der Entwicklungstoxizität. Herkömmliche Ansätze beruhten auf Tierversuchen, die oft komplex, kostspielig und aufgrund von Speziesunterschieden nicht direkt auf den Menschen übertragbar sind. Das "Universitätsklinikum Köln (UKK)2"-Testsystem wurde entwickelt, um sowohl Entwicklungsteratogenität als auch Kardiotoxizität zu bewerten. Es nutzte hiPSCs, Transkriptom-Analysen und ausgewählte Substanzen in in vivo-ähnlichen Konzentrationen. Die Differenzierung von hiPSCs in verschiedene Keimblätter und Kardiomyozyten wurde in Gegenwart und Abwesenheit von Substanzen mit embryotoxischer Wirkung untersucht. Genexpressionsanalysen identifizierten charakteristische Gene-signaturen für Embryotoxizität und Kardiotoxizität. In der ersten Phase wurden 23 Teratogene und 16 Nicht-Teratogene in maximaler Plasmakonzentration (Cmax) und 20-facher Cmax-Konzentration getestet. Ein prädiktiver Klassifikator mit einer Genauigkeit von 90% bis 92% wurde entwickelt, um Teratogene vorherzusagen. Das UKK2-Testsystem wurde dann zum UKK-Kardiotoxizitätstest (UKK-CTT) erweitert, um Substanzen zu testen, die die Kardiomyogenese hemmen. Eine Gensignatur wurde identifiziert, um Teratogene von Nicht-Teratogenen zu unterscheiden. Der "Developmental Cardiotoxicity Index" (CDI31g) wurde erstellt, um Substanzen zu unterscheiden, die die Kardiomyogenese beeinflussen. Die Studie zeigt vielversprechende Möglichkeiten für hiPSC-basierte In-vitro-Modelle zur Identifizierung von Embryotoxinen in der präklinischen Phase der Arzneimittelentwicklung. Die Entwicklung und Anwendung des UKK2-Testsystems und des UKK-CTT haben wertvolle Erkenntnisse über Entwicklungstoxizität und Kardiotoxizität geliefert und bilden eine Grundlage für die sichere Arzneimittelentwicklung in der präklinischen Phase.2023-01-01T00:00:00ZTargeting of RNA-binding proteins with macrocyclic peptides
http://hdl.handle.net/2003/42190
Title: Targeting of RNA-binding proteins with macrocyclic peptides
Authors: Schmeing, Stefan
Abstract: Die Arzneimittelforschung konzentrierte sich lange Zeit auf die Entwicklung von Modulatoren für Enzyme, da viele Enzyme zielgerichtete, kleine Taschen und katalytische Stellen aufweisen, für die kleine Moleküle auf rationale Weise entworfen oder gescreent werden konnten. Auch Protein-Protein-Wechselwirkungen, für die verschiedene chemische Räume erforscht werden mussten, wurden erfolgreich ins Visier genommen. In den letzten Jahren wurde das Interesse an vielfältigeren makromolekularen Komplexen wie Nukleinsäure Protein-Interaktionen geweckt. Bei dieser Arbeit liegt der Schwerpunkt auf der Entdeckung von Modulatoren von Protein-RNA Interaktionen. Das Projekt konzentrierte sich auf den Spleißfaktor polypyrimidine tract binding protein 1 (PTBP1), der bei Überexpression
verschiedene Krankheiten wie Krebs, Herzerkrankungen, Diabetes und den Abbau von Nervenzellen verursacht. Dieses Protein besteht aus vier RNA bindenden Domänen, die unterschiedliche Konsensussequenzen mit hoher Ähnlichkeit binden und durch die Tertiärstruktur des Proteins und der RNA eine komplexe Bindung an die Ziel-RNAs ermöglichen. Zunächst wurde versucht, einen auf E. coli basierenden zellulären Assay zur Quantifizierung der Interaktion von PTBP1 mit seinen Ziel-RNAs zu entwickeln. Dieser Assay sollte verwendet werden, um eine Bibliothek genetisch kodierter Peptidmakrozyklen auf Inhibitoren dieser Interaktion zu untersuchen. Später wurde die Funktion einer kürzlich berichteten transienten α-Helix zwischen den N-terminalen Domänen von PTBP1 untersucht und genutzt, um stabilisierte Peptide zu entwickeln, die mit der nativen, in das Protein eingebetteten Helix in vitro konkurrieren. Es konnte gezeigt werden, dass die Makrozyklen die Kooperativität zwischen RRM1 und RRM2 für eine RNA mit zwei Bindungsstellen hemmen. Die Peptide weisen einen einstelligen mikromolaren KI in den durchgeführten Experimenten auf. Diese Moleküle erwiesen sich als mäßig zellpermeabel, lysatstabil und modulierten das Spleißen mit geringen Auswirkungen. Darüber hinaus wurde der Bindungsmodus eines Peptids durch Ko-Kristallisation mit RRM1 validiert.
In einem weiteren Projekt wurden makrozyklische Peptid-Inhibitoren für ein nicht konventionelles RNA-Bindungsprotein WDR5 strukturell untersucht, um ihre Wirkungsweise zu validieren.; Drug discovery traditionally focused on the development of modulators for enzymes for a long time because many enzymes provide targetable small pockets and catalytic sites for which small molecules could be rationally designed or screened. Also, protein-protein interactions, for which different chemical spaces needed to be explored, were targeted successfully. In the recent years the interest in more diverse macromolecular complexes like nucleic acid-protein interactions awaked interest. For this work, the focus is on the discovery of modulators of protein-RNA interactions. The project focused on the splicing factor polypyrimidine tract binding protein 1 (PTBP1) which drives several diseases including cancer, cardiac diseases, diabetes and neuronal degradation when overexpressed. This protein consists of four RNA recognition motifs which bind to distinct consensus sequences with high similarities, which orchestrate a complex binding mode to target RNAs through the tertiary structure of the protein and RNA. First, the development of an E. coli based cellular assay for the quantification of the interaction of PTBP1 with its target RNAs was attempted. This assay was planned to be used to screen a library of genetically encoded peptide macrocycles as inhibitors of this interaction. Later, the function of a recently reported transient α-helix between the N-terminal domains of PTBP1 was investigated and utilized to design stapled peptides to compete with the native helix in vitro. Here, it was shown that the macrocycles inhibit the cooperativity between RRM1 and RRM2 which compete with a single RNA molecule with two binding sites with a single digit micromolar KI. These molecules were validated to have a sufficient cell-permeability, lysate stability, and modulated splicing with low effects. Further on, the binding mode of one peptide was validated through co-crystallization with RRM1 lacking the native helix.
In another project, macrocyclic peptide inhibitors for a non-conventional RNA binding protein WDR5 was structurally studied to validate their mode of action.2023-01-01T00:00:00ZA primer on building life-like systems
http://hdl.handle.net/2003/42174
Title: A primer on building life-like systems
Authors: Vibhute, Mahesh A.; Mutschler, Hannes
Abstract: The quest to understand life and recreate it in vitro has been undertaken through many different routes. These different approaches for experimental investigation of life aim to piece together the puzzle either by tracing life's origin or by synthesizing life-like systems from non-living components. Unlike efforts to define life, these experimental inquiries aim to recapture specific features of living cells, such as reproduction, self-organization or metabolic functions that operate far from thermodynamic equilibrium. As such, these efforts have generated significant insights that shed light on crucial aspects of biological functions. For observers outside these specific research fields, it sometimes remains puzzling what properties an artificial system would need to have in order to be recognized as most similar to life. In this Perspective, we discuss properties whose realization would, in our view, allow the best possible experimental emulation of a minimal form of biological life.2022-12-08T00:00:00ZIdentification of small molecule inhibitors of the kynurenine pathway
http://hdl.handle.net/2003/42149
Title: Identification of small molecule inhibitors of the kynurenine pathway
Authors: Dötsch, Lara Jil
Abstract: The immune system functions as an effective barrier against tumor development. However, malignant cells can avoid elimination by the immune system by acquiring certain characteristics that alter the immune system in the tumor microenvironment (TME). For instance, cancer cells can actively induce immune tolerance by expression of the immuno-suppressive enzyme indoleamine 2,3-dioxygenase 1 (IDO1). IDO1 expression results in degradation of the essential amino acid tryptophan (Trp) and production of kynurenines (Kyn) via the Kyn pathway. Targeting the Kyn pathway has emerged to be an attractive target in immuno-oncology.
In this thesis, two compound classes were discovered through a cell-based screening that reduce Kyn levels in cancer cells upon stimulation with the cytokine interferon-γ (IFN-γ) by two distinct mechanisms. The indole-tetrahydropyridine pseudo-natural products (PNPs) called apoxidoles inhibit IDO1 directly by binding and stabilizing apo-IDO1 in vitro and in cells. The displacement of the IDO1 cofactor heme catalytically inactivates the enzyme and thereby decreases Kyn levels. The second small molecule class of N-substituted indoles called epoxykynins represents an alternative approach to modulate the Kyn pathway by not directly targeting IDO1. Instead, epoxykynin inhibits the catalytic activity of the C-terminal fatty acid hydrolase domain of the soluble epoxide hydrolase (sEH-H). As part of the arachidonic acid (AA) cascade, the highly active enzyme sEH-H plays an important role in the hydrolysis of CYP epoxygenase-derived fatty acid epoxides. Thereby, it contributes to the regulation of bioavailable epoxides and controls a variety of biological processes, such as inflammation, vasodilation, angiogenesis, neuropsychiatries and pain. Thereby, it contributes to the regulation of bioavailable epoxides and controls a variety of biological processes, such as inflammation, vasodilation, angiogenesis, neuropsychiatries and pain. The results obtained throughout this thesis uncover a cross-talk between sEH-H and the Kyn pathway.
The discovery of new Kyn pathway inhibitors is in high demand, since the most advanced holo-IDO1 inhibitor epacadostat has recently failed in clinical trials. Additionally, the identification of epoxykynins has deepened the understanding of the functional link between the Kyn pathway and the AA metabolism. These findings might enable novel strategies to design immunotherapies and enhance the host’s immune system to overcome cancer-induced immune tolerance.2023-01-01T00:00:00ZDevelopment of a screening platform for the identification of macrocyclic splicing inhibitors
http://hdl.handle.net/2003/42148
Title: Development of a screening platform for the identification of macrocyclic splicing inhibitors
Authors: Nowacki-Hansen, Jessica
Abstract: Protein-RNA interactions are substance of research of the last decades and are yet to be fully explored. Interactions of RNA-binding proteins (RBPs) with RNA are found in a plethora of fundamental biological processes such as transcription, splicing, capping, polyadenylation, and translation. Alternative splicing (AS) is the major contributor to the high protein diversity in humans, with only ~30,000 genes present, and is regulated by RBPs such as spliceosomal subunits and alternative splicing factors. Aberrant function and expression of these factors disorganise splicing patterns, which can cause neurodegenerative diseases and cancer. Targeting alternative splicing factors to fight cancer has emerged as a novel promising therapeutic approach. For this purpose, two alternative splicing factors, SRSF1 and hnRNP A2B1, were first explored with the translational repression assay procedure (TRAP) to monitor the proteins’ interaction with RNA. The TRAP assay results delivered relative binding affinities, given in repression ratios, and were found to correlate with absolute binding affinities measured with the fluorescence polarisation (FP) assay. Binding motifs for RBPs are often found by cross-linking or pull-down approaches that are cost-intense and laborious. The work described here presents a novel approach using the TRAP assay in a high throughput format to screen for 10mer RNA consensus sequence for SRSF1 and hnRNP A2B1. The TRAP assay, in combination with the plasmid-encoded peptide library SICLOPPS, was used to screen for hexameric cyclic peptides as inhibitors for the RBPs. In a first approach, Sanger sequencing was used to sequence analysis and hit peptides were evaluated using the TRAP assay. Three hit peptides were synthesized chemically and evaluated by FP. In a second, optimised screening approach, Illumina sequencing was used for hit analysis, and the top six peptides were synthesised and evaluated by FP. Two promising candidate peptides for hnRNP A2B1 were found that are currently being analysed and verified as true inhibitors.2023-01-01T00:00:00ZDiscovery of small-molecule modulators of the RNA-binding proteins LIN28 and RNase L
http://hdl.handle.net/2003/42135
Title: Discovery of small-molecule modulators of the RNA-binding proteins LIN28 and RNase L
Authors: Borgelt, Lydia
Abstract: RNA-binding proteins (RBPs) regulate all aspects of RNA biology and metabolism and are emerging targets for the development of molecular probe compounds and therapeutics for various diseases. While oligonucleotide-based and peptide-based strategies have been applied to modulate RNAs and protein–RNA interactions, efficient RBP-targeting strategies utilizing small molecules, which bear inherent merits in comparison with other chemotypes, remain obscure. In this thesis, I studied small-molecule-based strategies to target three different RBPs, the oncogenic miRNA-binding protein LIN28, the antiviral ssRNA-cleaving protein RNase L and the associated dsRNA-binding protein OAS.
LIN28, which negatively regulates let-7 miRNAs that downregulate the translation of numerous oncogenic proteins, is overexpressed in many human cancers and is a driver of tumor progression and metastasis. Thus, LIN28 inhibition via small molecules is a promising strategy for the development of cancer therapeutics. Reported LIN28 inhibitors suffer from poor inhibitory potency, insufficient characterization of mechanism of action, limited structure-activity relationship, and poor cellular activity. This work employed a screening-based and a scaffold-based approach for the identification of LIN28 inhibitors with new scaffolds and improved potency. In the former approach, trisubstituted pyrrolinones were identified as LIN28 inhibitors via a fluorescence polarization assay-based screening. The most active pyrrolinone 41 increased the expression levels of mature let-7 in LIN28-expressing cells. A following structure-activity relationship study revealed biphenyl compounds, such as 85, that showed a more potent effect in inducing let-7 maturation. In the latter approach, a spirocyclization strategy was applied based on the chromenopyrazole scaffold of reported LIN28 inhibitors to increase the LIN28-inhibitory potency induced by the rigidity of the spirocyclic scaffold. The identified and well-characterized inhibitors are worthy starting points for the development of anticancer drugs and LIN28-targeting chemical probes.
The dsRNA-cleaving protein RNase L and the ssRNA-binding protein OAS are key enzymes in the human antiviral innate immune response. OAS detects foreign dsRNA upon viral infection, leading to OAS activation and production of the second messenger 2’-5’A. The binding of 2’-5’A to RNase L leads to RNase L dimerization and activation. The RNase L dimer then cleaves ssRNAs resulting in a global translational arrest and a cellular antiviral state. Small-molecule activators of OAS and RNase L are thus promising candidates for the development of broad-spectrum antiviral therapeutics. Furthermore, RNase L activators are useful components to build bifunctional RNase L recruiters to achieve proximity-induced targeted degradation of RNAs. In this work, robust assays for the screening and validation of OAS and RNase L activators were developed and used for the discovery of small-molecule modulators. While the identification of OAS and RNase L activators proved to be challenging, potential RNase L binders were identified. Additionally, a rational design approach led to the discovery of thiophenones as RNase L inhibitors that showed more potent inhibitory potency than reported RNase L inhibitors that target the nucleotide-binding pocket of RNase L
Collectively, the results of this thesis demonstrate the feasibility targeting RBPs using a variety of small-molecule-based strategies. Screening- and scaffold-based approaches enabled the identification of modulators with new scaffolds and improved potency in targeting RBPs. The established assays, the identified compounds, and the optimization strategies presented in this work will be useful for the future development of small molecules targeting RBPs.2023-01-01T00:00:00ZStructural investigation of cholesterol homeostasis and bacterial toxins
http://hdl.handle.net/2003/42108
Title: Structural investigation of cholesterol homeostasis and bacterial toxins
Authors: Günther, Patrick
Abstract: Membrane proteins regulate a variety of processes that are critical for living organisms. They participate in cell-cell communication, catalyze reactions in or at the membrane, are involved in transmitting signals from the environment into the cell, and can transport molecules across membranes. Approximately 60% of all clinically approved drugs target membrane proteins, underscoring their importance. In order to understand the function of membrane proteins and to design more targeted drugs, determining their precise three-dimensional structures is required. In this PhD project, I aimed to structurally characterize two membrane protein complexes involved in the regulation of cholesterol homeostasis – the Scap-Insig and HMGCR-UBIAD1 complexes – and the type VI secretion system (T6SS) effector RhsA. My PhD work showcases that biochemical studies combined with structural determination by cryo-EM provides valuable insights into molecular processes that occur in or at the membrane and is of utmost pharmacological interest.2023-01-01T00:00:00ZTemperatur-, hydrostatische Druck- und Kosolvenseffekte auf Protein-Liganden-Systeme
http://hdl.handle.net/2003/42104
Title: Temperatur-, hydrostatische Druck- und Kosolvenseffekte auf Protein-Liganden-Systeme
Authors: Jahmidi-Azizi, Nisrine
Abstract: Protein-Ligand-Interaktionen sind von grundlegender Bedeutung für sämtliche biochemische Prozesse und unverzichtbar für alle Lebensformen. Die molekulare Erkennung, die durch Spezifität und Affinität charakterisiert ist, spielt eine entscheidende Rolle in biologischen Prozessen wie der Selbstreplikation, dem Stoffwechsel und der Informationsverarbeitung. Die Anwendung von Druck auf Proteine beeinflusst ihre freie Energie und die Konformationslandschaft, was zur Entstehung verschiedener Konformationszustände mit unterschiedlicher Reaktivität führen kann. Studien, die den Einfluss von Druck auf biologische Systeme untersuchen, sind besonders relevant, da Organismen in den tiefen Ozeanen extrem hohem hydrostatischem Druck ausgesetzt sind. Da die Tiefsee als Quelle für vielfältige Lebensformen gilt, ist das Verständnis der Auswirkungen von Druck auf biologische Systeme von entscheidender Bedeutung, um das Leben und seine physikalischen Grenzen zu erforschen. Allerdings bestehen noch erhebliche Wissenslücken hinsichtlich der Auswirkungen von Stressfaktoren auf biomolekulare Prozesse wie Protein-Ligand-Interaktionen. In dieser Dissertation liegt der Fokus auf der Untersuchung der Auswirkungen von Druck, Temperatur und Kosolventen auf Protein-Ligand-Systeme. Dabei werden Erkenntnisse über die thermodynamischen Eigenschaften von Ligandenbindungsreaktionen gewonnen und Aspekte wie Packungseigenschaften, Strukturschwankungen, Interaktionsmechanismen und Veränderungen in der Hydration dieser Prozesse beschrieben.2023-01-01T00:00:00ZProbing RNA catalysis in protocellular settings relevant to the origin of life
http://hdl.handle.net/2003/42093
Title: Probing RNA catalysis in protocellular settings relevant to the origin of life
Authors: Salibi, Elia
Abstract: The emergence of life has long been a topic of high interest. Of the many hypotheses pro-posed for the emergence of early cellular predecessors of our last universal common ances-tor (LUCA), the RNA World hypothesis is a prime candidate. It posits a time before the evolution of modern DNA / protein-based life, where both roles of information storage and processing were played by RNA, while DNA and complex proteins had not yet evolved. With the advent of in vitro evolution, selection experiments have yielded a variety of dif-ferent catalytic RNAs (ribozymes) able to catalyse a range of chemical reactions in a se-quence-dependent manner. Nonetheless, a number of outstanding problems remain, such as the dissemination of genetic information among protocell populations in the absence of complex cell division machinery, genotype-phenotype coupling in RNA-peptide based membrane-less compartments and finally, the general sequence-independent templating abilities of ribozymes. In this work, cycles of freezing and thawing were employed to drive the proliferation of encapsulated RNA replicators among feedstock vesicles, allowing their survival following multiple rounds of dilution via self-amplification, thereby enabling a primitive form of lateral gene transfer among protocell populations and eliminating the need for sophisticated cell division apparatus. In the following section, a ribozyme ligase was re-engineered to perform concatenated ligation of an RNA substrate leading to a drastic increase in length. Ribozyme activity was subsequently characterised in the presence of short lysine homopeptides that allow phase separation and RNA partitioning. Moreover, ribozyme activity was found to modulate the physical properties of coacervates, demon-strating a primitive form of genotype-phenotype linkage in membraneless model protocells. Finally, a group I intron-derived ribozyme ligase that performs templated ligation reaction was employed as a general templated RNA ligase and characterised for the synthesis of a variety of functional RNA sequences. The system was subsequently adopted by collabora-tors as a starting point for the development of environmentally-driven RNA replication systems. Taken together, the data presented here offer insight into the possible mechanisms for persistence and proliferation of prebiotically relevant protocell models in environmental settings as well as an overview of the ‘proto-biosphere’ on early Earth and potential transi-tional stages of chemical and biological evolution leading to the emergence of the first cellular systems as we know them.; Die Entstehung des Lebens ist seit langem ein Thema von großem Interesse. Von den vielen Hypothesen, die für die Entstehung früher zellulärer Vorläufer unseres letzten gemeinsamen Vorfahren vorgeschlagen wurden, ist die RNA-Welt-Hypothese ein Hauptkandidat. Sie geht von einer Zeit vor der Evolution des modernen DNA-/Protein-basierten Lebens aus, in der die RNA sowohl die Rolle der Informationsspeicherung als auch die der Informationsverarbeitung übernahm, während sich die DNA und komplexe Proteine noch nicht entwickelt hatten. Mit dem Aufkommen der In-vitro-Evolution haben Selektionsexperimente eine Vielzahl verschiedener katalytischer RNAs (Ribozyme) hervorgebracht, die in der Lage sind, eine Reihe chemischer Reaktionen in sequenzabhängiger Weise zu katalysieren. Dennoch gibt es noch eine Reihe offener Probleme, wie z. B. die Verbreitung genetischer Informationen zwischen den Populationen von Protozellen in Abwesenheit einer komplexen Zellteilungsmaschinerie, die Genotyp-Phänotyp-Kopplung in membranlosen Kompartimenten auf RNA-Peptidbasis und schließlich die allgemeinen sequenzunabhängigen Template-Fähigkeiten von Ribozymen. In dieser Arbeit wurden Zyklen des Einfrierens und Auftauens eingesetzt, um die Vermehrung eingekapselter RNA-Replikatoren in den Ausgangsvesikeln anzutreiben und ihr Überleben nach mehreren Verdünnungsrunden durch Selbstamplifikation zu ermöglichen, wodurch eine primitive Form des lateralen Gentransfers zwischen Protozellpopulationen ermöglicht wird und die Notwendigkeit eines hochentwickelten Zellteilungsapparats entfällt. Im folgenden Abschnitt wurde eine Ribozym-Ligase so umgestaltet, dass sie eine verkettete Ligation eines RNA-Substrats durchführt, was zu einer drastischen Zunahme der Länge führt. Die Ribozymaktivität wurde anschließend in Gegenwart von kurzen Polylysin-Polymeren charakterisiert, die eine Phasentrennung und RNA-Verteilung ermöglichen. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die Ribozymaktivität die physikalischen Eigenschaften von Koazervaten moduliert, was eine primitive Form der Genotyp-Phänotyp-Verknüpfung in membranlosen Modell-Protozellen demonstriert. Schließlich wurde eine von einem Gruppe-I-Intron abgeleitete Ribozym-Ligase, die eine matrizenabhängige Ligationsreaktion durchführt, als allgemeine RNA-Ligase eingesetzt und für die Synthese verschiedener funktioneller RNA-Sequenzen charakterisiert. Das System wurde anschließend von Kollaborationspartnern als Ausgangspunkt für die Entwicklung von umweltgesteuerten RNA-Replikationssystemen übernommen. Zusammengenommen bieten die hier vorgestellten Daten einen Einblick in mögliche Persistenz- und Vermehrungsstrategien präbiotisch relevanter Protozellmodellen sowie einen Überblick über eine mögliche "Proto-Biosphäre" auf der frühen Erde und potentielle evolutionäre Zwischenstufen, die zur Entstehung der ersten zellulären Systeme geführt haben könnten.2023-01-01T00:00:00ZEntwicklung Übergangsmetall-freier Cycloisomerisierungen in Hexafluorisopropanol
http://hdl.handle.net/2003/42056
Title: Entwicklung Übergangsmetall-freier Cycloisomerisierungen in Hexafluorisopropanol
Authors: Jankowski, Nicholas
Abstract: Die zielgerichtete Entwicklung Metall-freier Reaktionen, um damit Übergangsmetalle in chemischen Prozessen zu substituieren, ist Thema aktueller Forschung. Dies hat den Hintergrund, dass Metall-Kontaminationen in Erzeugnissen der Industrie stark reguliert sind, da sie das Potential bergen, Menschen und Umwelt zu schädigen. Zudem wenden sich viele Zweige der Industrie nachhaltigeren Prozessen zu. Metalle sind in dieser Hinsicht ambivalent, da sie zwar sehr gut rezykliert werden können, aber die Gewinnung und Reinigung mit Belastungen verbunden ist.
Diese Arbeit zeigt eine Möglichkeit auf, wie typischerweise Metall-katalysierte Reaktionen durch BRØNSTEDT-Säuren ersetzbar sind. Dazu wird das von AUBÉ publizierte System von Acetylchlorid (AcCl) in Hexafluorisopropanol (HFIP) verwendet und auf Trimethylsilylchlorid (TMSCl) erweitert. Die Reaktion der beiden Reagenzien mit HFIP erzeugt in situ HCl. Dieses kann genutzt werden um Propargylamide zu cyclisieren. Für Propargylamide mit terminalen Dreifachbindungen werden Oxazole (und ihre Hydrochloride) gewonnen, die Reaktion von Propargylamiden mit internen Dreifachbindungen ergeben in der Mehrzahl Oxazoline mit (Z) konfigurierten exo-ständigen Doppelbindung.2023-01-01T00:00:00ZCharacterization of protein structure and dynamics by solution and solid-state NMR
http://hdl.handle.net/2003/42052
Title: Characterization of protein structure and dynamics by solution and solid-state NMR
Authors: Medina Gomez, Sara
Abstract: The study of proteins for understanding biological processes or as an approach to treating diseases has become more relevant in recent years. Different structural biology approaches can help to answer some of these questions, including nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy, which provides information at atomic resolution about the structure and dynamics on a broad range of timescales. Traditionally, protein studies are carried out by solution NMR, where many methodologies have been developed over the years that allow one to obtain a great variety of information. However, in solution NMR studies, the protein size is limited to up to 50 kDa. Using different labeling schemes and different levels of protonation in the protein, with solid-state NMR and 1H detection, we can access biologically relevant systems with a molecular size larger than 50 kDa and extract information of their structure and dynamics on a different timescale with atomic resolution. This thesis presents a combination of solution and solid-state NMR methodologies to understand the dynamical processes of the MAP kinase p38α and their changes upon ligand binding as a tool for characterizing the allosteric dynamic network present in the protein. All this was done by combining different labeling schemes and proving new methodologies for acquiring relaxation dispersion experiments that can be used for large protein systems. Furthermore, relaxation dispersion techniques in solid-state NMR are used to characterize the modulation of dynamics by inter- and intramolecular interaction for the SH3 domain of chicken α-spectrin by introducing a mutation in the RT loop. Furthermore, this work presents the characterization of the secondary structural element for the N-terminal domain of RhoGDI1, a domain thought to be disordered in the apo form and ordered in complex with the GTPase client. However, with the experimental chemical-shift information, we proved it to have a secondary structure before complex formation.2023-01-01T00:00:00ZStruktur und Dynamik von Modellbiomembranen unter verschiedenen physikalischen und chemischen Bedingungen
http://hdl.handle.net/2003/42049
Title: Struktur und Dynamik von Modellbiomembranen unter verschiedenen physikalischen und chemischen Bedingungen
Authors: Kriegler, Simon
Abstract: Plasmamembranen umgeben Zellen und deren Organellen, weshalb sie in praktisch jedem Lebewesen vorkommen und wichtige biologische Funktionen übernehmen. Dabei fungieren sie als spezifische Barriere, die die Diffusion von Stoffen in und aus der Zelle regulieren. Biomembranen reagieren empfindlich auf Temperatur- und Druckänderungen sowie auf die Anwesenheit bestimmter Cosolventien. Diese Arbeit beschäftigt sich im Wesentlichen mit den Auswirkungen verschiedener Substanzen auf Modellbiomembranen in Abhängigkeit des Drucks und der Temperatur. In dieser Dissertation konnte gezeigt werden, dass in Bakterien vorkommende ungesättigte Lipide die auf dem Mars vorkommenden Umweltbedingungen überstehen, sodass prokaryotische Zellmembranen in den Salzlaken unterhalb des Südpols der Marsoberfläche überdauern könnten. Außerdem wurden die verschiedenen Anpassungen von Lipidmembranen an hohe hydrostatische sowie osmotische Drücke studiert. Die Kombination aus der Zugabe eines antimikrobiellen Peptids und einer Hochdruckbehandlung auf bakterielle Modellmembranen demonstriert einen neuen Ansatz zur Nahrungsmittelkonservierung. Ein weiteres Kapitel beschäftigt sich mit dem Einfluss bestimmter pseudo-Naturstoffe, die durch lysosomale Membranen diffundieren können, um die Aktivität der verdauenden Enzyme innerhalb von Lysosomen durch eine pH-Wert Änderung zu senken. Zuletzt befasst sich diese Arbeit mit dem Einbau von künstlichen Lipiden auf Imidazolbasis in verschiedene Phospholipidmembransysteme zur gezielten Manipulation derer Eigenschaften.2023-01-01T00:00:00ZInvestigation of signal networks that control dynamic cell shape changes
http://hdl.handle.net/2003/42044
Title: Investigation of signal networks that control dynamic cell shape changes
Authors: Nanda, Suchet
Abstract: Cells process information via complex signal networks that include multiple components. Knowledge, about the spatio-temporal organization of these components and their activity state is critical to understand how these signal networks process information. Signal networks involving Rho GTPases play a key role in the spatio-temporal coordination of cytoskeletal dynamics during cell migration. Previous studies that directly investigated the crosstalk between the major Rho GTPases Rho, Rac and Cdc42 revealed a strong increase in Rho activity after Rac1 activation. This Rac1-Rho crosstalk might play a role in mediating the tight spatio-temporal coupling between cell protrusions and retractions that are typically observed during mesenchymal cell migration. To address this question, improved sensors were developed in this thesis to measure the activity state of endogenous small GTPases of the Ras, Rap, Rac, and Rho families in living cells. Using these sensors, Rac activation was observed to be tightly and precisely coupled to local cell protrusions, followed by Rho activation during retraction. In a screen for potential crosstalk mediators, a subset of the Rho activating Lbc-type GEFs, Arhgef11 and Arhgef12, were found to be enriched at the cell periphery during protrusions-retractions cycles. Furthermore, via an optogenetic approach, these Lbc GEFs were observed to recruit to the plasma membrane by active Rac1, suggesting that they indeed might link the cell protrusion signal Rac and the cell retraction signal Rho. Furthermore, depletion of these GEFs via RNA interference impaired cell protrusion-retraction dynamics, which was accompanied with a decrease in migration distance and an increase in migration directionality. These results show that Arhgef11 and Arhgef12 facilitate effective exploratory cell migration by coordinating the cell morphogenic processes of cell protrusion and retraction by coupling the activity of the associated small GTPases Rac and Rho.
Typical activity sensor designs including the improved small GTPase activity sensors described above are limited in the number of readouts that can be combined simultaneously inside a single cell. To extend this number, a new programmable single stranded mRNA-based sensor design was developed. These sensors enable parallel measurements of multiple protein-protein interactions that are dependent on signal network activity states inside a single living cell. As a proof-of-concept, protein kinase A activity sensors were developed, which allowed to distinguish activity dynamics of their different regulatory subunits in parallel inside living cells. Furthermore, RNA scaffold- based activity sensors for small GTPases were developed which enabled monitoring of the activity kinetics of Ras and Rap during pharmacological perturbations. RNA scaffolds, which were functionalized with dominant positive Rac or Rho GTPases enabled a method to evaluate the specificity of effector molecules in parallel inside living cells. These results show that the application of programmable RNA scaffolds can provide critical information about signal network components inside individual, living cells, which cannot be obtained via available standard methods. Such information can be critical to decipher the spatio- temporal organization of complex signal networks inside cells.2023-01-01T00:00:00ZCharacterization of conformational heterogeneity via higher-dimensionality, proton-detected solid-state NMR
http://hdl.handle.net/2003/42032
Title: Characterization of conformational heterogeneity via higher-dimensionality, proton-detected solid-state NMR
Authors: Burakova, Ekaterina; Vasa, Suresh K.; Linser, Rasmus
Abstract: Site-specific heterogeneity of solid protein samples can be exploited as valuable information to answer biological questions ranging from thermodynamic properties determining fibril formation to protein folding and conformational stability upon stress. In particular, for proteins of increasing molecular weight, however, site-resolved assessment without residue-specific labeling is challenging using established methodology, which tends to rely on carbon-detected 2D correlations. Here we develop purely chemical-shift-based approaches for assessment of relative conformational heterogeneity that allows identification of each residue via four chemical-shift dimensions. High dimensionality diminishes the probability of peak overlap in the presence of multiple, heterogeneously broadened resonances. Utilizing backbone dihedral-angle reconstruction from individual contributions to the peak shape either via suitably adapted prediction routines or direct association with a relational database, the methods may in future studies afford assessment of site-specific heterogeneity of proteins without site-specific labeling.2022-09-23T00:00:00ZImaging-based analysis of 5-methylcytosine at low-repetitive genomic loci using transcription activator-like effector probes
http://hdl.handle.net/2003/42021
Title: Imaging-based analysis of 5-methylcytosine at low-repetitive genomic loci using transcription activator-like effector probes
Authors: Jung, Anne
Abstract: 5-Methylcytosine (5mC) is the main epigenetic modification of mammalian genomes. It plays significant roles during cell development and differentiation and is involved in the regulation of essential cellular processes such as the control of gene expression. Dysregulation of methylation can lead to aberrant epigenetic patterns associated with a variety of diseases. To analyze cellular 5mC in situ, fluorescently labeled transcription-activator-like effector (TALE) proteins can be used as 5mC-sensitive probes in imaging studies. TALEs are DNA-binding proteins that provide sequence and 5mC selectivity via a domain of modular repeats, each recognizing a specific nucleobase. This enables the design of TALE probes for sequence-specific analysis of 5mC in user-defined target sequences. In imaging studies, 5mC-sensitive and 5mC-insensitive TALE pairs are used in co-stainings to allow the analysis of 5mC independently of changes in target accessibility. However, until now this has been limited to highly repetitive genomic DNA sequences. To extend this approach for the analysis of 5mC in low-repetitive coding gene loci, this work develops a straightforward signal amplification strategy to increase the imaging sensitivity with TALEs. This is achieved by additional immunostaining of the employed TALE probes, enabling the imaging of only 32 theoretical repeat sequences in the low repetitive MUC4 gene locus. In co-staining experiments, this allows the detection of 5mC changes in this locus between cell types with different methylation levels, introduced by DNA methyltransferase knockouts or overexpression. The ability to detect 5mC differences in this small number of target sequences opens up new perspectives for the analysis of 5mC in non-repetitive genomic loci, providing new insights into the regulation of gene expression.2023-01-01T00:00:00ZTotal syntheses of keramaphidin B and nominal njaoamine I & studies towards the total synthesis of providencin
http://hdl.handle.net/2003/42020
Title: Total syntheses of keramaphidin B and nominal njaoamine I & studies towards the total synthesis of providencin
Authors: Spohr, Simon Marcel
Abstract: After the discovery of manzamine A, a macrocyclic marine alkaloid, Baldwin and Whitehead proposed the biogenesis of a whole class of natural products arising from partly reduced alkylpyridine derivatives. Although manzamine A was quickly conquered by total synthesis around the turn of the millennium, a family of alkaloids emerging early in the biogenesis of these natural products remained elusive. In a total synthesis campaign, alkaloids of the ingenamine estate were targeted, pursuing an approach purely based on chemical logic. Therein, a Michael/Michael cascade was developed forging the common tricyclic core in diastereoselective fashion. Furthermore, the transformation proved highly flexible concerning the introduction of requisite handles for macrocyclization. For the total synthesis of keramaphidin B the macrocyclization strategy relied on the use of ring-closing alkyne metathesis (RCAM) for the 13-membered macrocycle and ring-closing olefin metathesis (RCM) for the 11-membered macrocycle. While the RCAM proved highly reliable, the RCM reaction had to be optimized carefully. Eventually, however, the inaugural total synthesis of keramaphidin B was accomplished in 19 steps along the longest linear sequence (LLS) and 0.93% overall yield. As the more recently discovered njaoamines carry an additional Lewis basic amine functionality in the quinoline annulated to one of the macrocycles, the use of RCM became less inviting. After the identification of vic-dibromoalkenes as sufficient alkyne surrogates, nominal njaoamine I was synthesized employing two subsequent RCAMs in 21 steps LLS and 1.14% overall yield. The total synthesis revealed a positional misassignment of the triple bond in the 17-membered macrocycle, which was revised by an in-depth NMR study.
Furanocembranoids are a diverse family of diterpenes. Their macrocyclic framework features, in most cases, a furan and butenolide moiety of some sort. One of the most intriguing molecules found within this class is providencin. Apart from its highly oxygenated nature it is recognized easily by the trans-fused cyclobutane bearing an allylic alcohol and an exocyclic methylene unit. Despite numerous efforts to bring this target down by total synthesis, providencin remains elusive. In particular the exceptionally high ring-strain of the macrocycle and the highly functionalized cyclobutane represent major challenges in an attempted synthesis. Herein, a new route towards the cyclobutane sector of providencin was established, which was used to evaluate the application of RCAM in the context of macrocyclization. At the centerpiece, an Ir-catalyzed photosensitized [2+2] cycloaddition was harnessed to build the furanyl-cyclobutanol fragment. Stereochemical relay of a neighboring stereocenter onto the cyclobutane rendered this approach asymmetric. Furthermore, this handle served as the linchpin to open the thus constructed bicycle via oxidative cleavage. Subsequent functionalization of the furan with a highly electrophilic hypoiodite reagent opened entry into a 2-iodofuran paramount for coupling requisite handles for macrocyclization. At this stage, Suzuki coupling was found to be optimal and an alkyne-bearing E-olefinic fragment could be introduced into the molecule. After accessing a viable diyne it became clear that the macrocycle was too strained to be forged by RCAM, because this reaction is largely entropically driven. These setbacks notwithstanding, a Suzuki coupling could be carried out with potassium vinyltrifluoroborate giving rise to an intermediate, which is expected to be elaborated into providencin via a literature known route previously established in the group of Mulzer.2023-01-01T00:00:00ZModification of peptides for improved membrane permeability and side chain diversity
http://hdl.handle.net/2003/42004
Title: Modification of peptides for improved membrane permeability and side chain diversity
Authors: Openy, Oweta Joseph Noah
Abstract: Fortschritte in der Arzneimittelforschung haben zur raschen Entdeckung potenter Hit-Peptide geführt, die bevorzugte Gerüste für die gezielte Beeinflussung von Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPI) oder Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungsstellen darstellen, bei denen es sich in der Regel um große, funktionslose hydrophobe Schnittstellen handelt. Hit-Peptide, die typischerweise in den chemischen Raum der "beyond- rule-of-five" (bRo5) fallen und hauptsächlich aus kanonischen Aminosäuren bestehen, haben in der Regel eine schlechte Pharmakokinetik und Membranpermeabilität.
In Kapitel 2 haben wir versucht, die Membranpermeabilität von Peptiden durch den Einbau von (hetero)aromatischen Linkern in das Peptidgerüst zu verbessern. Als Modellpeptid wurde Sanguinamid A (1) ausgewählt, ein membrandurchlässiges zyklisches Peptid marinen Ursprungs mit einer angemessenen berichteten oralen Bioverfügbarkeit (F = 7 ± 4 %), das einen Thiazolring in seinem Rückgrat aufweist. Sein cysteinhaltiges homodetisches Peptidanalogon wurde als Negativkontrolle entwickelt, während das tert-Butylglycin-haltige Analogon, Danamid F (2, F = 51 ± 9%), unsere Positivkontrolle war. Auf eine Verbindungsbibliothek, die aus Pyridin, Pyridin-N-Oxid und 3-Aminobenzoesäure-Linkern bestand, folgte ein Screening der Membranpermeabilität mittels IAM-Chromatographie. Das Pyridin-haltige Analogon 21 wies einen mit Sanguinamid A vergleichbaren IAM-Wert auf, was auf eine gute Membranpermeabilität hindeutet. Darüber hinaus zeigten1 H-NMR-Studien bei variabler Temperatur, dass die Amide im Rückgrat von 21 ein Wasserstoffbrückenbindungs-HB-Netzwerk bilden könnten, das sich von dem von Sanguinamid A unterscheidet, aber dynamisch ist, um Chamäleonität zu ermöglichen.
In Kapitel 3 befassten wir uns mit der späten Funktionalisierung von Peptiden, um unnatürliche Aminosäuren (UAAs) mit Hilfe von Katritzky-Salzen einzuführen. Bei dieser Methode wurden Lysinreste in Katritzky-Salze umgewandelt, gefolgt von photochemischen Giese-Reaktionen unter milden Bedingungen. Die Methode war mit allen kanonischen Aminosäuren und handelsüblichen Harzen und Linkern kompatibel, mit Ausnahme des 2-Chlornitrit-Chlorid-Harzes. Es wurde über einen breiten Substratbereich berichtet, und die Nützlichkeit der Methode wurde durch die selektive Modifizierung eines von zwei Lysinresten des Histon-3-Schwanzpeptids (Reste 1-10), eines von zwei Ornithinresten des zyklischen antibiotischen Peptids Gramicidin S und die Modifizierung des längeren p53-Peptids (15-29) nachgewiesen.2023-01-01T00:00:00ZStabilität ausgewählter Flüssig-Flüssig- Phasentrennungen in biomolekularen Systemen
http://hdl.handle.net/2003/42001
Title: Stabilität ausgewählter Flüssig-Flüssig- Phasentrennungen in biomolekularen Systemen
Authors: Ostermeier, Lena
Abstract: Die Flüssig-Flüssig-Phasentrennung (englisch: liquid-liquid phase separation, LLPS) hat sich als Schlüsselmechanismus für die intrazelluläre Organisation erwiesen, wobei zahlreiche aktuellere Studien wesentliche Erkenntnisse über die Rolle der LLPS im Bereich der Zellbiologie geliefert haben. Es gibt zudem Hinweise darauf, dass die LLPS mit einer Reihe von Erkrankungen, einschließlich neurodegenerativer Krankheiten, in Verbindung gebracht werden kann. Die pathologische Aggregation des α-Synucleins, die in kausalem Zusammenhang mit der PARKINSON-Krankheit steht, kann durch Tröpfchenkondensation erfolgen, welche schließlich schrittweise in den amyloiden Zustand übergeht. Es wurde im Rahmen dieser Dissertation untersucht, wie der Fibrillierungsprozess des α-Synucleins, etwa durch die Zugabe des antimikrobiellen Peptids LL-III, beeinflusst werden kann.
Darüber hinaus kann eine Flüssig-Flüssig-Phasentrennung auch zur Bildung von biomolekularen Kondensaten führen, welche als eine der anfänglichen Kompartimentierungsstrategien von Zellen gelten, die auch heute noch bei der Bildung von nicht-membranartigen Kompartimenten in biologischen Zellen vorherrschen. Daher wurden im Rahmen dieser Dissertation die Auswirkungen extremer Umweltbedingungen, insbesondere hochaggressiver Marssalze (Perchlorat und Sulfat) und hohen Drucks, auf die Bildung biomolekularer Proteinkondensate untersucht.
Eine ähnliche Art der Tröpfchen, die wässrigen Zweiphasensysteme, können zudem mit biokatalytischen Reaktionen in Verbindung gebracht werden. Schließlich ist die gezielte Anpassung des Reaktionsmediums eine interessante Alternative zur Modulation der kinetischen Eigenschaften biokatalytischer Reaktionen. Deshalb wurde die kombinierte Wirkung eines wässrigen Zweiphasensystems und eines hohen hydrostatischen Drucks auf die Kinetik der FDH-katalysierten Oxidation von Formiat zu CO2 im Rahmen dieser Dissertation studiert.2023-01-01T00:00:00ZRibozyme activity modulates the physical properties of RNA–peptide coacervates
http://hdl.handle.net/2003/41990
Title: Ribozyme activity modulates the physical properties of RNA–peptide coacervates
Authors: Le Vay, Kristian Kyle; Salibi, Elia; Ghosh, Basusree; Tang, TY Dora; Mutschler, Hannes
Abstract: Condensed coacervate phases are now understood to be important features of modern cell biology, as well as valuable protocellular models in origin-of-life studies and synthetic biology. In each of these fields, the development of model systems with varied and tuneable material properties is of great importance for replicating properties of life. Here, we develop a ligase ribozyme system capable of concatenating short RNA fragments into long chains. Our results show that the formation of coacervate microdroplets with the ligase ribozyme and poly(L-lysine) enhances ribozyme rate and yield, which in turn increases the length of the anionic polymer component of the system and imparts specific physical properties to the droplets. Droplets containing active ribozyme sequences resist growth, do not wet or spread on unpassivated surfaces, and exhibit reduced transfer of RNA between droplets when compared to controls containing inactive sequences. These altered behaviours, which stem from RNA sequence and catalytic activity, constitute a specific phenotype and potential fitness advantage, opening the door to selection and evolution experiments based on a genotype–phenotype linkage.2023-06-16T00:00:00ZSynthese und Charakterisierung von funktionalisierten Hydrogel Matrices und deren Anwendung in der Kultivierung von neuralen Stammzellen
http://hdl.handle.net/2003/41956
Title: Synthese und Charakterisierung von funktionalisierten Hydrogel Matrices und deren Anwendung in der Kultivierung von neuralen Stammzellen
Authors: Stamm, Nils
Abstract: Durch die immer älterwerdende Bevölkerung steigt mit hohem Alter auch die Anzahl an Krankheiten, welche mit einem Verlust von Zellen verbunden sind. Die Verwendung von Stammzellen stellt eine Möglichkeit zur Regeneration der verlorenen Zellen dar. Die begrenzte Verfügbarkeit von Stammzellen mit fortschreitendem Alter macht eine Kultivierung dieser Stammzellen in vitro notwendig. Zur Kultivierung von Stammzellen eignen sich Hydrogele, welche mit ihren mechanischen Eigenschaften dem natürlichen Gewebe ähneln. Wegen ihrer vielfältigen Eigenschaften finden Hydrogele Anwendung in vielen Bereichen der Medizin, aber auch im alltäglichen Leben. Durch die Verwendung von vollsynthetischen Präpolymeren auf Basis von 4 Acryloylmorpholin und N,N` Bis(methacryloyl)cystamid durch die Vernetzung mit Poly(ethylenglykol)diacrylat wurden verschieden funktionalisierte Hydrogele hergestellt und das Verhalten von neuralen Stammzellen während der Kultivierung auf diesen Hydrogelen untersucht. Die Untersuchung von neuralen Stammzellen und Tumorzellen auf kationischen Hydrogelen zeigte eine Erhöhung der Adhäsion der Zellen in Abhängigkeit der kationischen Ladung. Zusätzlich war es für neurale Stammzellen möglich die Kombination von kationischen Gruppen mit dem Wachstumsfaktor FGF zu untersuchen und einen synergistischen Effekt zwischen diesen Komponenten nachzuweisen, wodurch die Adhäsion und Überlebensfähigkeit der Stammzellen enorm gesteigert wurde. Neben dem bereits beschriebenen Polymersystem wurde ebenfalls ein weiteres Polymersystem auf Basis von Thiolactonen entwickelt.2023-01-01T00:00:00ZGauging the strength of the molecular halogen bond via experimental electron density and spectroscopy
http://hdl.handle.net/2003/41935
Title: Gauging the strength of the molecular halogen bond via experimental electron density and spectroscopy
Authors: Otte, Felix; Kleinheider, Johannes; Grabe, Bastian; Hiller, Wolf; Busse, Franziska; Wang, Ruimin; Kreienborg, Nora M.; Merten, Christian; Englert, Ulli; Strohmann, Carsten
Abstract: Strong and weak halogen bonds (XBs) in discrete aggregates involving the same acceptor are addressed by experiments in solution and in the solid state. Unsubstituted and perfluorinated iodobenzenes act as halogen donors of tunable strength; in all cases, quinuclidine represents the acceptor. NMR titrations reliably identify the strong intermolecular interactions in solution, with experimental binding energies of approx. 7 kJ/mol. Interaction of the σ hole at the halogen donor iodine leads to a redshift in the symmetric C–I stretching vibration; this shift reflects the interaction energy in the halogen-bonded adducts and may be assessed by Raman spectroscopy in condensed phase even for weak XBs. An experimental picture of the electronic density for the XBs is achieved by high-resolution X-ray diffraction on suitable crystals. Quantum theory of atoms in molecules (QTAIM) analysis affords the electron densities and energy densities in the bond critical points of the halogen bonds and confirms stronger interaction for the shorter contacts. For the first time, the experimental electron density shows a significant effect on the atomic volumes and Bader charges of the quinuclidine N atoms, the halogen-bond acceptor: strong and weak XBs are reflected in the nature of their acceptor atom. Our experimental findings at the acceptor atom match the discussed effects of halogen bonding and thus the proposed concepts in XB activated organocatalysis.2023-06-05T00:00:00ZUnderstanding mechanisms of membrane protein Prm1 for membrane fusion during cell-cell fusion of Saccharomyces cerevisiae
http://hdl.handle.net/2003/41914
Title: Understanding mechanisms of membrane protein Prm1 for membrane fusion during cell-cell fusion of Saccharomyces cerevisiae
Authors: Shek, Anson Hao Tian2023-01-01T00:00:00ZOrganolithiumchemie in der Mikrowelle: Hochreaktive, kommerzielle Lithiumalkyle unter extremen Reaktionsbedingungen
http://hdl.handle.net/2003/41909
Title: Organolithiumchemie in der Mikrowelle: Hochreaktive, kommerzielle Lithiumalkyle unter extremen Reaktionsbedingungen
Authors: Scheel, Rebecca
Abstract: Im Fokus dieser Dissertation stand die Untersuchung von kommerziellen Lithiumorganylen unter hohen Reaktionstemperaturen und insbesondere unter Einfluss von Mikrowellenstrahlung. Die Verwendung von unpolarem Lösungsmittel und stabilen Lithiumalkylen liefert einen Zugang zur mikrowellenbasierten Deprotonierung verschiedener Substratklassen. Neben der Metallierung von besonders inerten Substraten konnte ein Einblick in die Mehrfachmetallierung von Aromaten gewonnen werden und in diesem Zusammenhang auch Liganden zur Deaggregation der Lithiumalkyle untersucht werden, die sich unter den gegebenen Bedingungen als stabil herausgestellt haben. Neben den dargestellten Deprotonierungsreaktionen stand die genauere Betrachtung verschiedener Mechanismen und Reaktivitäten im Vordergrund und konnte so einen Einblick in Deaggregations- und Deprotonierungsprozesse der Lithiumalkylchemie geben.2023-01-01T00:00:00Z“Metal-modified base pairs” vs. “metal-mediated pairs of bases”: not just a semantic issue!
http://hdl.handle.net/2003/41826
Title: “Metal-modified base pairs” vs. “metal-mediated pairs of bases”: not just a semantic issue!
Authors: Lippert, Bernhard
Abstract: A “nucleobase pair” is not identical with a “pair of basic ligands”, as only in the first case, the existence of inter-base hydrogen bonds is implied. The cross-linking of two nucleobases or two basic ligands by a metal ion of suitable geometry produces either “metal-modified” or “metal-mediated” species, but in the author’s opinion, this difference is not always properly made. This commentary is an attempt to provide a clearer distinction between the two scenarios.2022-01-29T00:00:00ZTargeting oncogenic KRasG13C with nucleotide-based covalent inhibitors
http://hdl.handle.net/2003/41415
Title: Targeting oncogenic KRasG13C with nucleotide-based covalent inhibitors
Authors: Goebel, Lisa; Kirschner, Tonia; Koska, Sandra; Rai, Amrita; Janning, Petra; Maffini, Stefano; Vatheuer, Helge; Czodrowski, Paul; Goody, Roger S.; Müller, Matthias Philipp; Rauh, Daniel
Abstract: Mutations within Ras proteins represent major drivers in human cancer. In this study, we report the structure-based design, synthesis, as well as biochemical and cellular evaluation of nucleotide-based covalent inhibitors for KRasG13C, an important oncogenic mutant of Ras that has not been successfully addressed in the past. Mass spectrometry experiments and kinetic studies reveal promising molecular properties of these covalent inhibitors, and X-ray crystallographic analysis has yielded the first reported crystal structures of KRasG13C covalently locked with these GDP analogues. Importantly, KRasG13C covalently modified with these inhibitors can no longer undergo SOS-catalysed nucleotide exchange. As a final proof-of-concept, we show that in contrast to KRasG13C, the covalently locked protein is unable to induce oncogenic signalling in cells, further highlighting the possibility of using nucleotide-based inhibitors with covalent warheads in KRasG13C-driven cancer.2023-04-12T00:00:00ZEntropy driven disorder–order transition of a metal–organic framework with frustrated flexibility
http://hdl.handle.net/2003/41412
Title: Entropy driven disorder–order transition of a metal–organic framework with frustrated flexibility
Authors: Pallach, Roman; Weiß, Jan-Benedikt; Vollmari, Katrin; Henke, Sebastian
Abstract: Flexible metal–organic frameworks (MOFs), showing a reversible phase change behavior in response to guest adsorption or temperature, provide unique opportunities for molecular separation or energy storage applications. Herein, we investigate the complex guest- and temperature-responsive behavior of a functionalized MOF-5 derivative. The material is characterized by a geometrically rigid network structure that is decorated with dispersion energy donating hexyloxy substituents. Distinguished by the phenomenon of frustrated flexibility, the functionalized MOF-5 derivative switches between a highly crystalline, cubic structure and a semi-crystalline, aperiodically distorted structure depending on guest adsorption and temperature. Via a combination of several variable temperature global and local structure techniques (x-ray diffraction, x-ray total scattering, and Fourier-transform IR spectroscopy), detailed insights into the complementary disorder–order transitions of the framework backbone and the dangling hexyloxy substituents are provided. Our results set the stage for the discovery of new responsive MOFs exhibiting a more complex phase change behavior interfacing periodic and aperiodic structural changes.2023-04-13T00:00:00ZGrubbs-Carbene aus der gem-Hydrierung von Alkinen und Totalsynthese von Prorocentin
http://hdl.handle.net/2003/41408
Title: Grubbs-Carbene aus der gem-Hydrierung von Alkinen und Totalsynthese von Prorocentin
Authors: Zachmann, Raphael Jonas
Abstract: Der erste Teil dieser Arbeit befasst sich mit der geminalen Hydrierung, welche die einzigartige Möglichkeit bietet, interne Alkine direkt in Metallcarbenkomplexe umzuwandeln. Es konnte mit [(NHC)(Cymol)RuCl2] erstmalig ein zweites Katalysatorsystem identifiziert werden, welches zur lichtgetriebenen Bildung von Grubbs-Carbenen befähigt ist. Diese Entdeckung war maßgeblich für die Entwicklung einer „hydrierenden Metathese“ von Eninen sowie zweier neuartiger Syntheserouten zur Herstellung von Metallcarbenkomplexen des Hoveyda-Grubbs-Typs.
Im zweiten Teil sind die Synthese und die strukturelle Revision des polyketidischen Naturstoffs Prorocentin beschrieben. Vor Beginn dieser Arbeit wurde bereits eine mögliche Fehlzuordnung in der vom Isolationsteam vorgeschlagenen Struktur diskutiert. Unser Projekt begann daher mit der Reevaluation sämtlicher verfügbarer NMR-Daten, wobei wir Prorocentin einer wahrscheinlicheren Isomerstruktur zuordnen konnten. Diese Hypothese konnte anhand konvergenter Totalsynthesen beider Verbindungen zweifelsfrei bestätigt werden.2023-01-01T00:00:00ZSelective monosubstitution on a trichlorosilane with highly reactive organolithium compounds in a microflow reactor
http://hdl.handle.net/2003/41360
Title: Selective monosubstitution on a trichlorosilane with highly reactive organolithium compounds in a microflow reactor
Authors: Achternbosch, Moritz; Zibula, Lukas; Schmidt, Annika; Krieger, Waldemar; Kockmann, Norbert; Strohmann, Carsten
Abstract: Organolithium compounds have been used successfully in flow chemistry since the recent past. Most of the studies dealt with the use in halogen-lithium exchanges. So far, however, there has been a lack of use in substitution reactions. The use of flow microreactors makes the highly reactive organolithium compounds more controllable and thus creates new synthetic possibilities.2022-12-27T00:00:00ZElementspezifische Effekte relevanter alkali-metallorganischer Verbindungen
http://hdl.handle.net/2003/41345
Title: Elementspezifische Effekte relevanter alkali-metallorganischer Verbindungen
Authors: Seymen, Rana
Abstract: Heutzutage gibt es verschiedene Werkzeuge, die es dem Chemiker/der Chemikerin ermöglichen die Grenzen der klassischen, konzeptionellen Methoden zu überschreiten. Sie erlauben es, die Individualität jedes Moleküls zu berücksichtigen und die speziellen Eigenschaften für jedes Molekül zu nuancieren. Die hier vorliegende Arbeit nutzt diesen Fortschritt der Technologie und verwendet eine Kombination von theoretischen und experimentellen Methoden, um Fragestellungen der Organik nachzugehen. Mittels Einkristall-Röntgenstrukturanalyse in hoher Auflösung, quantenmechanischen Berechnungen und elektronischen Bindungsanalysen wird ein tiefer Einblick in die molekulare Struktur von heteroatom-funktionalisierten, benzylischen Lithiumorganylen gegeben und die so gewonnenen Ergebnisse für die Synthese von chiralen Verbindungen nutzbar gemacht.
Durch die Variation verschiedener Stellschrauben konnten hierbei unterschiedliche Einflüsse auf das carbanionische Zentrum von einfachen benzylischen Verbindungen beobachtet werden. Zunächst wurde der Einfluss von Alkalimetallen mittels elektronischer Bindungsanalysen untersucht. Hierbei konnte eine starke Abhängigkeit der elektronischen Bindungssituation von den verwendeten Alkalimetallen beobachtet werden. Mit steigendem Ionenradius nimmt auch die Delokalisation der negativen Ladung in das aromatische System zu. Durch weitere theoretische Untersuchungen zu lithiierten, funktionalisierten Benzylverbindungen konnte festgestellt werden, dass die negative Ladung über die Phenylgruppe delokalisiert ist und somit der Resonanzstabilisierung ein erheblicher Beitrag zukommt. Zudem haben die strukturelle Anordnung und die Position des Lithiumkations einen großen Einfluss auf den Effekt der Resonanzstabilisierung. Die elementspezifische Stabilisierung durch Heteroatome in der Position zum carbanionischen Zentrum zeigen unterschiedliche Wirkungen. Die Elemente aus der zweiten Periode (C, N, O) haben sogar eine repulsive Wirkung, während die Elemente der dritten Periode (Si, P, S) stabilisierend wirken. Für Verbindungen mit dem Heteroatom Silicium konnte die Bevorzugung einer Punktladung am carbanionischen Zentrum beobachtet werden. Währenddessen ist die negative Ladung bei den Heteroelementen Phosphor und Schwefel weniger am carbanionischen Kohlenstoffatom lokalisiert. Generell zeigen die elementspezifischen Effekte keine Sensitivität auf strukturelle Änderungen oder auf die Position des Metalls.
Der Einsatz eines Heterozyklus forciert nicht nur eine bestimmte strukturelle Anordnung, sondern verursacht auch eine stärkere Ladungsverschiebung in den Ring. Dies eröffnet das Potential unabhängig von elementspezifischen Effekten eine stabile Konfiguration am metallierten Kohlenstoff aufzubauen. Eine Vielzahl der hier isolierten und vorgestellten Molekülstrukturen im Festkörper validieren die theoretischen Untersuchungen und ermöglichen einen großen, systematischen Vergleich im Hinblick auf Stabilisierungseffekte. Zusätzlich konnte ein tieferer Einblick in Zersetzungsprozesse, in unterschiedliche Reaktivitäten und sogar in die mechanistische Untersuchung der elektrophilen Addition eines Ketons an ein carbanionisches Zentrum gegeben werden. Die Grundlage hierfür war die Molekülstruktur im Festkörper des lithiierten Benzylthiopyridins mit einer Vorkoordination zum Hexamethylaceton. Mittels der Funktionalisierung von Benzylthiopyridin mit unterschiedlichen Elektrophilen konnte ein neuer Zugang zu enantiomerenangereicherten, schwefelhaltigen Verbindungen eingeführt werden. Die enantiomeren und diastereomerenreinen Kristalle mit dem Liganden (R,R)-TMCDA dienen dabei als Transmissionsriemen für eine stereospezifische Umsetzung.
Durch die Nutzung theoretischer und experimenteller Instrumente konnte diese Arbeit einen weiteren wichtigen Beitrag zu den Untersuchungen der Stabilisierungseffekte und zu dem stereochemischen Verlauf von heteroatomsubstituierten Lithiumorganylen liefern.2022-01-01T00:00:00ZFlüssig-Flüssig-Phasenübergänge in biomolekularen Systemen
http://hdl.handle.net/2003/41338
Title: Flüssig-Flüssig-Phasenübergänge in biomolekularen Systemen
Authors: Fetahaj, Zamira2022-01-01T00:00:00ZStudien zur Totalsynthese des marinen Tetraterpenoids Gukulenin A und Darstellung substituierter Cyclohepta[d][1,3]dioxin-7-one durch intramolekulare Alkin-de Mayo-Reaktion
http://hdl.handle.net/2003/41331
Title: Studien zur Totalsynthese des marinen Tetraterpenoids Gukulenin A und Darstellung substituierter Cyclohepta[d][1,3]dioxin-7-one durch intramolekulare Alkin-de Mayo-Reaktion
Authors: Bednarzick, Ulf
Abstract: Der erste Teil der vorliegenden Dissertation befasst sich mit den Studien zur Totalsynthese von Gukulenin A, einem marinen Tetraterpenoid, über dessen Isolierung, Strukturaufklärung und biologische Evaluierung die Arbeitsgruppe um Rho et al. im Jahr 2010 berichtete. Der strukturell anspruchsvolle Naturstoff wurde aus dem roten Meeresschwamm Phorbas gukhulensis isoliert, welcher nahe der Insel Gageodo vor der südkoreanischen Küste beheimatet ist. Die präzedenzlose Molekülarchitektur von Gukulenin A ist durch ein pseudodimeres Tetraterpen-Grundgerüst sowie hochsubstituierte Cyclopentanoide und α-Tropolone charakterisiert. Daneben besticht das Tetraterpenoid durch eine bemerkenswerte Zytotoxizität gegenüber unterschiedlichen menschlichen Krebszelllinien im nanomolaren Bereich.
Ausgehend von (–)-Piperiton konnte der Zugang zu einem fortgeschrittenen Gukulenin A-Vorläufer in Form eines C2-dissymmetrischen Bis-α-Tropolonetheracetals erschlossen werden. Schlüsselschritte der 26-stufigen „ex-chiral-pool“-Synthese waren eine ringkontrahierende Meinwald-Umlagerung, eine photochemisch induzierte Zweikohlenstoffatom-Ringerweiterung durch intramolekulare Alkin-de Mayo-Reaktion, eine präzedenzlose Kupfer(II)-vermittelte Lactolether-Methanolyse sowie eine abschließende Alken-Homometathese.
Ziel des zweiten Teils der Arbeit war es, das Anwendungsspektrum der intramolekularen Alkin-de Mayo-Reaktion zum Aufbau mittelgroßer Carbocyclen durch die Etablierung eines Acetal-basierten und potenziell spaltbaren Linker-Systems zu erweitern. In diesem Zusammenhang wurden die Grenzen der photochemisch induzierten Zweikohlenstoffatom-Ringerweiterung unter Anwendung eines Methylenacetals als verknüpfendes Linker-Templat durch explorative Substratvariationsstudien ergründet. Durch die Bestrahlung der synthetisch leicht zugänglichen vinylogen Carbonsäure-Derivate konnten die korrespondierenden siebengliedrigen Cyclohepta[d][1,3]dioxin-7-one erhalten werden. Zudem ließ sich der Kurs der Photochemie durch einen Lösungsmittelwechsel beeinflussen und die Alkin-de Mayo-Reaktion in Abhängigkeit des Substrats gezielt unterbrechen. Auf diese Weise konnten die entsprechenden Bicyclo[3.2.0]heptenoide vereinzelt durch Enon–Alkin-(2+2)-Photocycloaddition zugänglich gemacht und als stabile Verbindungen isoliert werden.; Der erste Teil der vorliegenden Dissertation befasst sich mit den Studien zur Totalsynthese von Gukulenin A, einem marinen Tetraterpenoid, über dessen Isolierung, Strukturaufklärung und biologische Evaluierung die Arbeitsgruppe um Rho et al. im Jahr 2010 berichtete. Der strukturell anspruchsvolle Naturstoff wurde aus dem roten Meeresschwamm Phorbas gukhulensis isoliert, welcher nahe der Insel Gageodo vor der südkoreanischen Küste beheimatet ist. Die präzedenzlose Molekülarchitektur von Gukulenin A ist durch ein pseudodimeres Tetraterpen-Grundgerüst sowie hochsubstituierte Cyclopentanoide und α-Tropolone charakterisiert. Daneben besticht das Tetraterpenoid durch eine bemerkenswerte Zytotoxizität gegenüber unterschiedlichen menschlichen Krebszelllinien im nanomolaren Bereich.
Ausgehend von (–)-Piperiton konnte der Zugang zu einem fortgeschrittenen Gukulenin A-Vorläufer in Form eines C2 dissymmetrischen Bis-α-Tropolonetheracetals erschlossen werden. Schlüsselschritte der 26-stufigen „ex chiral-pool“-Synthese waren eine ringkontrahierende Meinwald-Umlagerung, eine photochemisch induzierte Zweikohlenstoffatom-Ringerweiterung durch intramolekulare Alkin-de Mayo-Reaktion, eine präzedenzlose Kupfer(II)-vermittelte Lactolether-Methanolyse sowie eine abschließende Alken-Homometathese.
Ziel des zweiten Teils der Arbeit war es, das Anwendungsspektrum der intramolekularen Alkin-de Mayo-Reaktion zum Aufbau mittelgroßer Carbocyclen durch die Etablierung eines Acetal-basierten und potenziell spaltbaren Linker-Systems zu erweitern. In diesem Zusammenhang wurden die Grenzen der photochemisch induzierten Zweikohlenstoffatom-Ringerweiterung unter Anwendung eines Methylenacetals als verknüpfendes Linker-Templat durch explorative Substratvariationsstudien ergründet. Durch die Bestrahlung der synthetisch leicht zugänglichen vinylogen Carbonsäure-Derivate konnten die korrespondierenden siebengliedrigen Cyclohepta[d][1,3]dioxin-7-one erhalten werden. Zudem ließ sich der Kurs der Photochemie durch einen Lösungsmittelwechsel beeinflussen und die Alkin-de Mayo-Reaktion in Abhängigkeit des Substrats gezielt unterbrechen. Auf diese Weise konnten die entsprechenden Bicyclo[3.2.0]heptenoide vereinzelt durch Enon–Alkin-(2+2)-Photocycloaddition zugänglich gemacht und als stabile Verbindungen isoliert werden.2022-01-01T00:00:00ZFunctionalized Zeolitic Imidazolate Frameworks
http://hdl.handle.net/2003/41317
Title: Functionalized Zeolitic Imidazolate Frameworks
Authors: Song, Jianbo
Abstract: Metal-organic frameworks (MOFs) are showing various structure flexibility in response to external stimuli (e.g., pressures and temperatures). Their responsiveness can be manipulated by the substitution of the functional groups at the organic linker of the frameworks. Some MOFs are recently reported to be able to melt and form glasses, and their melting behavior is also related to functionalizing the linkers. Thus, the mechanisms of controlling responsiveness and melting behaviors of MOFs by linker functionalization (using benzo and cyano groups) have been studied in this work. The high-pressure behavior of a series of Zeolitic Imidazolate Frameworks (ZIFs) of ZIF 62 (M(im)2-x(bim)x, M = Zn2+/Co2+, im– = imidazolate, bim– = benzimidazolate, 0.02 x 0.37) has been studied through in situ high pressure powder X-ray diffraction. The ZIF-62 derivatives are observed to contract reversibly from an open pore (op) to a closed pore (cp) phase under hydrostatic mechanical pressure. Importantly, the observed op-to-cp phase transition switches from the typical first order (discontinuous) to second order (continuous) with increasing the bim– fraction (to 17.5%). Rietveld refinements revealed that the second order transition is achieved by a continuous linker rotation. The mechanism that the void volume and the pore size of the material can be tuned continuously by adjusting the pressure was demonstrated. To investigate the melting mechanism, a series of derivates of ZIF-4 (Zn(im)2) containing various amounts of cyano-functionalized imidazolate linkers was synthesized. The incorporation of electron-withdrawing cyano groups results in a drastic decrease in the melting temperatures. Density function theory (DFT) calculations revealed that the cyano groups weaken the dissociation of Zn–N bonds in the melting process. Remarkably, a particular liquid-liquid transition (LLT) of prototypical ZIF-4 remains in all cyano derivatives. The kinetic fragility of ZIF liquids has been demonstrated to be correlated with their micropore volume. Overall, this work provides a guideline for controlling the mechanical responsiveness and melting behavior of MOFs by linker functionalization. The mechanically tunable MOFs open new possibilities for their application in pressure-switchable devices, membranes, and actuators. The porous glasses produced through controllable melting can further facilitate the manufacture of functionalized MOF glasses.2023-01-01T00:00:00ZA high-throughput effector screen identifies a novel small molecule scaffold for inhibition of ten-eleven translocation dioxygenase 2
http://hdl.handle.net/2003/41311
Title: A high-throughput effector screen identifies a novel small molecule scaffold for inhibition of ten-eleven translocation dioxygenase 2
Authors: Palei, Shubhendu; Weisner, Jörn; Vogt, Melina; Gontla, Rajesh; Buchmuller, Benjamin; Ehrt, Christiane; Grabe, Tobias; Kleinbölting, Silke; Müller, Matthias; Clever, Guido H.; Rauh, Daniel; Summerer, Daniel
Abstract: Ten-eleven translocation dioxygenases (TETs) are the erasers of 5-methylcytosine (mC), the central epigenetic regulator of mammalian DNA. TETs convert mC to three oxidized derivatives with unique physicochemical properties and inherent regulatory potential, and it initializes active demethylation by the base excision repair pathway. Potent small molecule inhibitors would be useful tools to study TET functions by conditional control. To facilitate the discovery of such tools, we here report a high-throughput screening pipeline and its application to screen and validate 31.5k compounds for inhibition of TET2. Using a homogenous fluorescence assay, we discover a novel quinoline-based scaffold that we further validate with an orthogonal semi-high throughput MALDI-MS assay for direct monitoring of substrate turnover. Structure–activity relationship (SAR) studies involving >20 derivatives of this scaffold led to the identification of optimized inhibitors, and together with computational studies suggested a plausible model for its mode of action.2022-09-02T00:00:00ZDeep sea osmolytes in action: their effect on protein-ligand binding under high pressure stress
http://hdl.handle.net/2003/41296
Title: Deep sea osmolytes in action: their effect on protein-ligand binding under high pressure stress
Authors: Kamali, Armin; Jahmidi-Azizi, Nisrine; Oliva, Rosario; Winter, Roland
Abstract: Because organisms living in the deep sea and in the sub-seafloor must be able to cope with hydrostatic pressures up to 1000 bar and more, their biomolecular processes, including ligand-binding reactions, must be adjusted to keep the associated volume changes low in order to function efficiently. Almost all organisms use organic cosolvents (osmolytes) to protect their cells from adverse environmental conditions. They counteract osmotic imbalance, stabilize the structure of proteins and maintain their function. We studied the binding properties of the prototypical ligand proflavine to two serum proteins with different binding pockets, BSA and HSA, in the presence of two prominent osmolytes, trimethylamine-N-oxide (TMAO) and glycine betaine (GB). TMAO and GB play an important role in the regulation and adaptation of life in deep-sea organisms. To this end, pressure dependent fluorescence spectroscopy was applied, supplemented by circular dichroism (CD) spectroscopy and computer modeling studies. The pressure-dependent measurements were also performed to investigate the intimate nature of the complex formation in relation to hydration and packing changes caused by the presence of the osmolytes. We show that TMAO and GB are able to modulate the ligand binding process in specific ways. Depending on the chemical make-up of the protein's binding pocket and thus the thermodynamic forces driving the binding process, there are osmolytes with specific interaction sites and binding strengths with water that are able to mediate efficient ligand binding even under external stress conditions. In the binding of proflavine to BSA and HSA, the addition of both compatible osmolytes leads to an increase in the binding constant upon pressurization, with TMAO being the most efficient, rendering the binding process also insensitive to pressurization even up to 2 kbar as the volume change remains close to zero. This effect can be corroborated by the effects the cosolvents impose on the strength and dynamics of hydration water as well as on the conformational dynamics of the protein.2022-06-24T00:00:00ZA protein-based method for he encapsulation of synthetic cytoplasms
http://hdl.handle.net/2003/41292
Title: A protein-based method for he encapsulation of synthetic cytoplasms
Authors: Seidel, Hans2021-01-01T00:00:00ZTheory of biochemical information processing with transients
http://hdl.handle.net/2003/41268
Title: Theory of biochemical information processing with transients
Authors: Yadav, Manish
Abstract: Cells in tissues and organisms operate in dynamic environments, continuously sensing and responding to time-varying chemical signals. In order to accurately interpret the complex information from their environment, biochemical networks in single cells actively process these extracellular signals in real-time. The current concept of biochemical computations places a strong focus on attractor based information processing in cells. Recent studies however have shown that cells generate completely opposite phenotypic responses depending upon frequency of the growth factor, independent of growth factor identity. This breaks down the steady-state description of biochemical information processing. Therefore, we propose to describe biochemical networks embedded in non-stationary environments as non-autonomous systems whose solutions are the dynamic input-dependent trajectories. We show that memory arising through metastable states will enable the system to integrate time-varying signals such that, inputs resulting in different phenotypic responses will be uniquely encoded in phase-space trajectories. The extracellular information of different phenotypes is spread throughout the large signaling networks and represented by characteristically different classes of phase-space trajectories. This encoded information will further be decoded downstream by early response genes (ERG) in real-time, where we show that the feed-forward structure of ERG is sufficient for this task.2022-01-01T00:00:00ZDevelopment and evaluation of small molecule- and bifunctional modulators targeting the ribonuclease L for RNA degradation
http://hdl.handle.net/2003/41257.2
Title: Development and evaluation of small molecule- and bifunctional modulators targeting the ribonuclease L for RNA degradation
Authors: Hwang, Jimin
Abstract: Ribonucleases are one of the critical regulatory enzymes of RNA-involved metabolism in cells and are becoming promising therapeutic targets due to the importance of RNA in many disease mechanisms. In particular, ribonuclease L (RNase L) has attracted great attention as a regulatory enzyme engaged in innate immune responses against viral infections. RNase L plays a vital role in the antiviral response by degrading RNAs, which is suppressed by viruses over evolution. Therefore, activating the RNase L and associated innate immunity by using small molecule-based strategies are one of the promising therapeutic approaches for not only antiviral effect but also RNase L-related anticancer effect. Meanwhile, RNase L-inhibition associates therapeutic potential in treating autoimmune and inflammatory disorders. Although a few small molecule-based RNase L modulators have been reported, the scarcity of potency and selectivity of reported modulators highly requires a thorough optimization and discovery of new scaffolds as well as development of new approaches. In this study, we pursued our efforts in acquiring potent small-molecule modulators of RNase L via two different strategies. The first approach based on small molecule-ligand pursued improved potency of ligands. The second approach was to introduce new chemical modalities to modulate RNase L activity via bifunctional molecules. In the small molecule-ligand approach, we assessed whether scaffold-based design, structure-activity relationship (SAR) study, and rational design could facilitate the generation of a more potent modulator. The scaffold-based design yielded chemically intriguing scaffolds but with no RNase L activity change. The SAR approach yielded compounds which revealed improved binding to RNase L and showed RNase L-mediated cellular downstream effects. The rational design led to a promising fusion scaffold of RNase L modulators, 2-((pyrrol-2-yl)methylene)thiophen-4-one, and compounds which exhibited 30-fold improved inhibitory effect than reported compound in in vitro biochemical evaluation and a potent cellular inhibitory effect. In our second approach, the three bifunctional molecules consist of a homodimerizer, a heterobivalent molecule, and the PROTAC molecule. The homodimerizer resulted in limited improvement of activator potency while heterobivalent molecule did not lead to activity change. Lastly, PROTAC molecules to degrade an RNase L-inhibiting protein have been synthesized. The effect of the PROTAC molecules on the RNase L activation will be evaluated in a future study. We focused on multiple approaches to modulate the challenging but promising target RNase L. This study will contribute to the development of new chemical entities for a potent RNase L modulator and thus for an innate immunity modulator.2023-01-01T00:00:00ZCoordination cages for fullerene encapsulation
http://hdl.handle.net/2003/41267
Title: Coordination cages for fullerene encapsulation
Authors: Hasegawa, Shota
Abstract: In this dissertation, synthesis of coordination cages (Pd2L4, Pd4L6) for fullerene encapsulation is described. Chemical and physical properties of fullerene C60(s) encapsulated inside the coordination cages were investigated. In chapter 1, the background of the research is introduced. The scope of this thesis is described in chapter 2. In chapter 3, synthesis of a Pd2L4 coordination cage and generation and stabilization of C60•– inside the synthesized cationic coordination cage is discussed. In chapter 4, encapsulation capability scope of the Pd2L4 cage is described. Further, synthesis of C60Pd(0) complexes using the Pd2L4 coordination cage as a supramolecular mask is showcased in chapter 5. In chapter 6, synthesis of a pill-shaped Pd4L6 coordination cage and guest uptake and topochemical reaction between two nano-confined C60s. In the last chapter, conclusion of this thesis is described.2022-01-01T00:00:00ZThe role of granzymes in natural killer cell cytotoxicity
http://hdl.handle.net/2003/41266
Title: The role of granzymes in natural killer cell cytotoxicity
Authors: Bönnemann, Vivian
Abstract: Natural killer (NK) cells are innate immune cells that defend the human body against viral infections and tumor growth. NK cells exhibit two pathways to kill aberrant cells: the granule-mediated pathway and the death receptor-mediated pathway. Upon target cell contact, NK cells release granules that contain cytotoxic proteins such as granzymes. Although the main contributor granzyme B (GrzB) of the granule-mediated pathway has been investigated extensively, the role of the other four human granzymes A, H, K and M in NK cell cytotoxicity is less understood.
In this thesis, we created fluorescent localization reporters to compare the activity of GrzB to the other four human granzymes within single target cells. The reporters not only visualize whether there is granzyme activity within the target cells, they also provide information about the kinetics. In this study, we observed that NK92 cells mainly kill their targets by using GrzB with partial support of GrzA. If GrzB is knocked out, GrzA acts as the only backup for GrzB and can induce apoptosis on its own. Although the granzymes H, K and M are expressed by all NK cells investigated in this study, they do not play a role for NK92 cytotoxicity, but rather in target cell killing by primary human NK cells. Here, we found different relevance of granzymes for resting (M > A > K > H) and activated (A > M > K > H) primary NK cells. In addition, CD56bright primary NK cells exhibit a higher GrzK content compared to CD56dim NK cells, but even though CD56bright NK cells also release higher levels of GrzK, target cells are still dominantly killed via GrzB. These results therefore further contribute to the understanding of the complexity of NK cell cytotoxicity.2023-01-01T00:00:00ZQuantification of gas-accessible microporosity in metal-organic framework glasses
http://hdl.handle.net/2003/41265
Title: Quantification of gas-accessible microporosity in metal-organic framework glasses
Authors: Frentzel-Beyme, Louis; Henke, Sebastian; Kolodzeiski, Pascal; Weiß, Jan-Benedikt; Schneemann, Andreas
Abstract: Metal-organic framework (MOF) glasses are a new class of glass materials with immense potential for applications ranging from gas separation to optics and solid electrolytes. Due to the inherent difficulty to determine the atomistic structure of amorphous glasses, the intrinsic structural porosity of MOF glasses is only poorly understood. Here, we investigate the porosity features (pore size and pore limiting diameter) of a series of prototypical MOF glass formers from the family of zeolitic imidazolate frameworks (ZIFs) and their corresponding glasses. CO2 sorption at 195 K allows quantifying the microporosity of these materials in their crystalline and glassy states, also providing excess to the micropore volume and the apparent density of the ZIF glasses. Additional hydrocarbon sorption data together with X-ray total scattering experiments prove that the porosity features of the ZIF glasses depend on the types of organic linkers. This allows formulating design principles for a targeted tuning of the intrinsic microporosity of MOF glasses. These principles are counterintuitive and contrary to those established for crystalline MOFs but show similarities to strategies previously developed for porous polymers.2022-12-14T00:00:00ZDynamical basis of cellular sensing and responsiveness to spatial-temporal signals
http://hdl.handle.net/2003/41255
Title: Dynamical basis of cellular sensing and responsiveness to spatial-temporal signals
Authors: Nandan, Akhilesh Padmanabhan
Abstract: Under physiological conditions, cells continuously sense and migrate in response to chemoattractant signals that are noisy, conflicting, and changing over time and space. This suggests cells exhibit seemingly opposed characteristics, such as robust maintenance of polarized state longer than the signal duration, while still remaining adaptive to novel signals. However, the dynamical mechanism that enables such sensing capabilities is still unclear. In this thesis, I propose a generic dynamical mechanism based on critical positioning of receptor signaling network in the vicinity of saddle-node of a sub-critical pitchfork bifurcation (SubPB mechanism). The critical organization leads to the emergence of a dynamical "ghost" that gives transient memory in the polarized response, as well as the ability to continuously adapt to changes in signal localization. Using weakly nonlinear analysis, an analytical description of the necessary conditions for the existence of this mechanism in a general receptor network is provided. Comparing to three classes of existing mathematical models for polarization that operate on the principle of stable attractors, I demonstrate that the metastability arising from "ghost" in the SubPB mechanism uniquely enables sensing dynamic spatial-temporal signals in a history-dependent manner. By using a physical model that couples signaling to morphology, I demonstrate how this mechanism enables cells to navigate in changing environments. Using the well characterized Epidermal growth factor receptor (EGFR) sensing network in epithelial cells, I demonstrated that the described transient memory in signaling mimics working memory in neurons, enabling cells to process non-stationary signals.2022-01-01T00:00:00ZSupplement to Functional improvement of stem cell derived hepatocyte-like cells after targeted FXR gene regulatory network manipulation
http://hdl.handle.net/2003/41254
Title: Supplement to Functional improvement of stem cell derived hepatocyte-like cells after targeted FXR gene regulatory network manipulation
Authors: Feuerborn, David2023-02-15T00:00:00ZFunctional improvement of stem cell derived hepatocyte-like cells after targeted FXR gene regulatory network manipulation
http://hdl.handle.net/2003/41253
Title: Functional improvement of stem cell derived hepatocyte-like cells after targeted FXR gene regulatory network manipulation
Authors: Feuerborn, David
Abstract: Primary human hepatocytes (PHH) are important for clinical therapy as well as for studies in pharmacology and toxicology. Hepatocyte-like cells (HLC) derived from pluripotent stem cells offer the perspective of an unlimited supply of PHH, however, genome- and proteome-wide analyses demonstrated that HLC still show major differences compared to PHH. More recently it was shown that, HLC express hepatocyte- and non-hepatocyte-associated genes within the same cells, indicating that HLC reside in a hybrid state that can be targeted by bioinformatics-guided intervention [1]. In this context, it remains to be clarified whether cell line or differentiation protocol-specific differences lead to comparable hybrid states and if the reported hybrid state is a common feature among HLC. In this thesis, HLC obtained by two different protocols from three different induced pluripotent stem cell lines (iPSC) were compared using genome-wide transcriptomics. Furthermore, it was demonstrated that interventions to improve HLC differentiation by targeting the FXR gene regulatory network (GRN) increased the expression of hepatocyte-associated genes and suppressed undesired non-liver genes in HLC, thereby increasing their similarity to PHH. However, this has yet only been shown on the transcriptomic level. Here, functional assays of bile acid secretion and lipid droplet formation were performed to confirm that an FXR targeting intervention strategy does indeed increase the similarity of HLC to PHH.2023-02-15T00:00:00ZDesign, synthesis, and evaluation of small molecules and associated bifunctional conjugates targeting the protein–RNA interaction of LIN28 and let-7
http://hdl.handle.net/2003/41230
Title: Design, synthesis, and evaluation of small molecules and associated bifunctional conjugates targeting the protein–RNA interaction of LIN28 and let-7
Authors: Hommen, Pascal
Abstract: RNAs have evolved as prominent targets to tackle challenging topics in the field of chemical biology and medicinal chemistry. Concomitantly, RNA binding proteins (RBPs) are emerging as a new class of drug targets given the essential regulatory functions of RBPs in deciding cell fates. Despite the increasing understanding of the importance of RBPs, limited chemical tools are available to probe the biological functions of RBPs, which raises the need for the development of effective and selective tool compounds targeting RBPs. The LIN28–let-7 interaction is one of the most well-investigated protein–RNA interactions to date. Due to its association with a poor cancer prognosis, LIN28 is a potential new anticancer target. Among the current collection of reported LIN28 inhibitors, potent molecules with clear mechanisms of inhibition are lacking. Additionally, most reported LIN28 inhibitors were identified via high throughput screening of different formats against molecular libraries that were not tailored to target RBPs. Therefore, there is a need to diversify the discovery approaches for RBP-targeting molecules. In this context, small-molecule-based approaches were adopted to engage the challenging topic of targeting the miRNA-binding protein LIN28. Furthermore, we designed an intriguing bifunctional molecule in which an affinity-enhancing moiety was linked to a known LIN28 small-molecule inhibitor to build bifunctional molecules to improve efficacy. Inspired by a rationale, first established in targeting protein–protein interactions, hotspot amino acids were identified through an analysis of LIN28–let-7 crystal structure and a virtual alanine scan to design the corresponding affinity-enhancing moieties consisting of peptides. Conjugation between the designed peptides and the known LIN28 inhibitors led to enhanced binding affinity. In other approaches, we investigated compounds of three chemical scaffolds intending to study the structural features required for LIN28 inhibition, as well as identifying suitable small molecules to be used in the bifunctional molecule approach. After the initial investigation, chromeno[4,3-c]pyrazoles were used as the small molecule components to be conjugated to a peptide moiety through CuAAC chemistry. After screening for optimal linker length and the amino acid composition of the peptide, compound 111 was identified as a potent bifunctional molecule disrupting the LIN28–let-7 interaction. The resulting novel class of chromenopyrazole–peptide conjugates showed improved properties in comparison with peptide-based probes. Therefore, proving the design strategy of the study and underlining the advantageous properties of conjugated entities over nonconjugated inhibitors2022-01-01T00:00:00ZComputational methodologies for DNA-encoded libraries
http://hdl.handle.net/2003/41229
Title: Computational methodologies for DNA-encoded libraries
Authors: Chines, Silvia
Abstract: Die Entdeckung von Arzneimitteln ist ein langwieriger und sehr kosten- und ressourcenintensiver Prozess. Daher wurden Screening-Technologien (physisch und virtuell) eingesetzt, um solche Prozesse zu optimieren und zu beschleunigen. DNA-kodierte Bibliotheken (DELs) haben sich in den letzten 30 Jahren als Alternative zum Hochdurchsatz-Screening herauskristallisiert, da sie zahlreiche Vorteile bieten. Die DEL-Technologie birgt jedoch drei große Herausforderungen: der Erhalt des DNA-Barcodes, die Abdeckung des chemischen Raums und die Identifizierung der Hits. Diese Faktoren werden durch die Größe der DNA-kodierten Bibliotheken und die daraus resultierende Menge der erzeugten Daten noch erschwert. Daher wurden chemoinformatische Ansätze verwendet, wie die KNIME-Analytics Platfrom. Im ersten Kapitel dieser Arbeit (Chemistry selection) wird ein Algorithmus vorgestellt, der den Raum der chemischen Reaktionen kartiert und sortiert, um Reaktionen auszuwählen, die potenziell für die DELSynthese verwendet werden können. Solche Reaktionen müssen Anforderungen erfüllen, welche die Integrität des DNA-Barcodes gewährleisten. Darüber hinaus beschreibt der Algorithmus die Reaktionen anhand spezieller molekularer Deskriptoren, die den Kern der Reaktion, d. h. den Teil der Reaktanten, der in Produkte umgewandelt wird, berücksichtigen. Auf der Grundlage solcher Deskriptoren wurden die Reaktionen geclustert, um den chemischen Reaktionsraum abzubilden. Aus den Clustern konnten Reaktionen erfolgreich auf DNA-kodierte Substrate angewendet werden. Im zweiten Kapitel (Building blocks selection) wurde die KNIME Analytics Platform eingesetzt, um die Bausteine (BBs) für die Bibliothekssynthese auszuwählen, mit dem Ziel, die strukturelle Vielfalt zu erhöhen. Virtuelle Bibliotheken konnten entsprechend der ausgewählten BBs und der etablierten DNA-kompatiblen Chemien aufgelistet werden. Die Reaktionen wurden mit Datenbanken arzneimittelähnlicher Verbindungen verglichen. Im dritten Kapitel (DNA-encoded library validation by molecular docking) wurden die Hit-Moleküle mit molekularer Docking-Software validiert. Drei Proteine wurden detailliert beschrieben und ihre jeweiligen Hits wurden als Liganden im Docking-Verfahren verwendet. Die Anwendung des Dockings als Validierungsmethode erwies sich als nützlich für die Bestätigung von Treffern, für die2022-01-01T00:00:00ZMaximized axial helicity in a Pd2L4 cage: inverse guest size-dependent compression and mesocate isomerism
http://hdl.handle.net/2003/41220
Title: Maximized axial helicity in a Pd2L4 cage: inverse guest size-dependent compression and mesocate isomerism
Authors: Bloch, Witold M.; Horiuchi, Shinnosuke; Holstein, Julian J.; Drechsler, Christoph; Wuttke, Axel; Hiller, Wolf; Mata, Ricardo A.; Clever, Guido H.
Abstract: Helicity is an archetypal structural motif of many biological systems and provides a basis for molecular recognition in DNA. Whilst artificial supramolecular hosts are often helical, the relationship between helicity and guest encapsulation is not well understood. We report a detailed study on a significantly coiled-up Pd2L4 metallohelicate with an unusually wide azimuthal angle (∼176°). Through a combination of NMR spectroscopy, single-crystal X-ray diffraction, trapped ion mobility mass spectrometry and isothermal titration calorimetry we show that the coiled-up cage exhibits extremely tight anion binding (K of up to 106 M−1) by virtue of a pronounced oblate/prolate cavity expansion, whereby the Pd–Pd separation decreases for mono-anionic guests of increasing size. Electronic structure calculations point toward strong dispersion forces contributing to these host–guest interactions. In the absence of a suitable guest, the helical cage exists in equilibrium with a well-defined mesocate isomer that possesses a distinct cavity environment afforded by a doubled Pd–Pd separation distance.2023-01-19T00:00:00ZInhibition of glucose uptake in NK cells enhances their serial killing capacity
http://hdl.handle.net/2003/41219
Title: Inhibition of glucose uptake in NK cells enhances their serial killing capacity
Authors: Picard, Lea Katharina
Abstract: Glucose-transporter (GLUT)-inhibitors, like Glutor and Glupin, effectively inhibit the proliferation of different tumor cells, making them potential candidates for cancer therapies. Therefore, assessing the impact of GLUT-inhibitors on NK cell function is crucial, as these cells play an important role in anti-tumor response. Seahorse analysis of the energetic phenotype of NK cells treated with Glutor or Glupin showed decreased glycolysis. To further examine the effect of both inhibitors on NK cell effector functions, resting or pre-activated human NK cells were stimulated through CD16 in the presence or absence of Glutor or Glupin. This acute inhibition of the GLUT had no significant effect on NK cell cytotoxicity, cytokine secretion or killing capacity against tumor cells. To analyze possible long-term effects, we cultured freshly isolated NK cells for 3 weeks in the presence or absence of Glutor or Glupin. We could detect a lack of proliferation in case of Glutor-treatment, whereas Glupin-treated NK cells displayed a delayed proliferation. Analysis of various surface receptors showed that long-term treatment with Glutor or Glupin led to an altered NK cell phenotype compared to the control. Furthermore, we examined the cytotoxic and immunoregulatory function of these NK cells: Long-term treatment with Glutor reduced the degranulation and IFN- secretion after stimulation via CD16 or NKp30. Interestingly, Glupin did not affect degranulation in comparison to the control cells, whereas the IFN- secretion was significantly diminished after stimulation via CD16 or NKp30. Furthermore, the serial-killing capacity of long-term treated NK cells with Glupin was higher than that of control cells. Experiments regarding the usage of other fuels, like glutamine or fatty acids, revealed that NK cells did not use fatty acids to fulfil their functions and that glutamine seems to be not responsible for this increased serial killing capacity. RNA-sequencing data together with the analysis of NAD+/NADH concentrations of Glupin-treated NK cells suggests a possible role of CD38 and NAD+ in the serial killing capacity of NK cells. Further, RNA-sequencing of Glutor-treated NK cells displayed a cell cycle arrest, which could explain the lack of proliferation. These data identify Glupin as a suitable candidate for cancer therapy.2022-01-01T00:00:00ZTracing protein native radicals under in vitro and in vivo conditions via EPR
http://hdl.handle.net/2003/41218
Title: Tracing protein native radicals under in vitro and in vivo conditions via EPR
Authors: Meichsner, Shari Lorraine
Abstract: Although more than a hundred thousand protein structures are registered in the Protein Data Bank, there are still more open questions than answers. One of these proteins that have captivated researchers for decades is ribonucleotide reductase, short RNR. Due to its central role in every living organism, RNR has been the focus of research on several occasions, but many questions remain unanswered despite numerous studies. Moreover, information about RNR structure in its natural environment, namely living cells, is entirely lacking. A method that can be used for protein structure elucidation is electron paramagnetic resonance, shortly EPR. EPR is also widely used for RNR studies since the enzyme has a native radical that is used for catalysis. In this work, state-of-the-art EPR spectroscopy was used to address some of the open questions related to RNR. Advanced EPR techniques were used to determine the structure of the stable tyrosyl radical Y122• in E. coli class Ia RNR in living whole E. coli cells at high resolution. Furthermore, EPR was used to investigate the in vivo radical distribution of RNR. In addition to in-cell EPR, three other applications of magnetic resonance spectroscopy are highlighted in this work. First, insights into the development process of a new spin label are given, using RNR as a model system. Through these studies, azidophenylalanine was identified as a suitable candidate that could contribute to the field of in-cell protein structure elucidation via spin labeling. Second, a high-pressure apparatus was used to study the effect of pressure on E. coli RNRs structure by EPR. Finally, independently of RNR, cw-EPR was used to characterize the long-lived C60 radical anion generated in a molecular coordination cage.2022-01-01T00:00:00ZSynthese und Charakterisierung bioabbaubarer, polymerer Nanopartikel für biomedizinische Anwendungen
http://hdl.handle.net/2003/41217
Title: Synthese und Charakterisierung bioabbaubarer, polymerer Nanopartikel für biomedizinische Anwendungen
Authors: Olszowy, Yannik
Abstract: Krebserkrankungen zählen neben Herz-Kreislauferkrankungen immer noch zu den häufigsten
frühzeitigen Todesarten weltweit. Ein wichtiges Ziel der modernen Tumortherapie ist daher die
Entwicklung neuartiger Wirkstoffe und Diagnostika. Dabei kann auch die Formulierung dieser
Stoffe einen signifikanten Einfluss auf die Effizienz einer Therapie bzw. eines diagnostischen
Verfahrens besitzen. Besonders vernetzte polymere Nanopartikel sind dabei seit einigen
Jahrzehnten in den Fokus der Forschenden gerückt. Diese Nanopartikel bestehen zumeist aus
einer hydrophilen Hülle und einem vernetzten, hydrophoben Kern. In dieser Arbeit wurden
solche Nanopartikel mit einem hydrophilen Segment bestehend aus Poly(2-Oxazolin)en
dargestellt, da die Peptid-ähnliche Struktur dieser Polymere zu exzellenter Bio- und
Blutkompatibilität der Nanopartikel führen sollte. Das hydrophobe Segment wurde durch eine
RAFT-Polymerisation aufgebaut, da durch die einfache Synthese Acrylat-basierter Monomere
ein breites Spektrum an Modifikationen ermöglicht werden sollte. Die Kernvernetzung der
Nanopartikel sollte reversibel sein, um mögliche Akkumulation der Nanopartikel im Körper zu
verhindern. Daher wurden Disulfid-haltige Vernetzer verwendet, welche unter den reduktiven
intrazellulären Bedingungen abgebaut werden sollten. Nach ausgiebiger Untersuchung und
Optimierung dieses Nanopartikelsystems, sowie dessen Abbauverhalten, wurden im letzten
Schritt erste Modifikationen für konkrete biomedizinische Anwendungen im Bereich der
Tumortherapie und -diagnostik durchgeführt und evaluiert.; Alongside cardiovascular diseases, cancer is still one of the most common causes of premature
death worldwide. An important goal of modern tumor therapy is therefore the development of
novel active substances and diagnostics. The formulation of these substances can also have a
significant influence on the efficiency of a therapy or diagnostic procedure. Particularly
crosslinked polymeric nanoparticles for this purpose have been the focus of researchers for
several decades. These nanoparticles mostly consist of a hydrophilic shell and a crosslinked
hydrophobic core. In this work, such nanoparticles were synthesized with a hydrophilic segment
consisting of poly(2-oxazoline)s, as the peptide-like structure of these polymers should lead to
excellent biocompatibility and blood compatibility. The hydrophobic segment was constructed
by RAFT-polymerization, as the facile synthesis of acrylate-based monomers should allow a
wide range of modifications. The core crosslinking of the nanoparticles should be reversible to
prevent possible accumulation of the nanoparticles in the body. Therefore, disulfide containing
crosslinkers were used, which should be degraded under the reductive intracellular conditions.
After extensive investigation and optimization of this nanoparticle system, as well as its
degradation behavior, the final step was to perform and evaluate initial modifications for
specific biomedical applications in the field of tumor therapy and diagnostics.2022-01-01T00:00:00ZSupplement to RISM-based pressure-dependant computational spectroscopy
http://hdl.handle.net/2003/41214
Title: Supplement to RISM-based pressure-dependant computational spectroscopy
Authors: Pongratz, Tim2023-01-01T00:00:00ZAmphiphile Block-Copolymere und eine Affinitäts-Aufreinigung für die DNA-kodierte Chemie
http://hdl.handle.net/2003/41206
Title: Amphiphile Block-Copolymere und eine Affinitäts-Aufreinigung für die DNA-kodierte Chemie
Authors: Götte, Katharina
Abstract: Die Kombination von molekularbiologischen Methoden, wie der genetischen Kodierung, Selektion, DNA-Amplifikation und DNA-Sequenzierung, mit der kombinatorischen organischen Chemie konnte große Sammlungen an Molekülen, sogenannte DNA-kodierte Bibliotheken, für die Identifikation von bioaktiven Molekülen ermöglichen. Dabei besteht eine große Herausforderung in der nur geringen Abdeckung des chemischen Raumes durch die notwendige Kompatibilität der verwendeten organischen Reaktionen mit dem DNA-Barcode. So können stark saure, oder oxidierende Bedingungen, sowie hohe Temperaturen zu einem Verlust der Integrität der genetischen Kodierung führen, wodurch eine Identifizierung von bioaktiven Molekülen erschwert wird. Zudem muss eine hohe Reinheit der Molekülbibliothek vorliegen, um die Identifikation falsch positiver Hits in Selektionsassays zu reduzieren. Um diese Herausforderungen anzugehen, wurden in dieser Arbeit amphiphile Block-Copolymere für die Synthese einer DNA-kodierten Substanzbibliothek verwendet, sowie eine neue Aufreinigungs-Methode etabliert und angewendet. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden amphiphile Block-Copolymere eingesetzt, die in Wasser hydrophobe Reaktionsräume bilden und eine aktive katalytische Einheit, wie eine Sulfonsäure oder einen Palladium-Komplex, tragen. Dadurch sollte der hydrophile DNA-Barcode getrennt von dem reaktiven hydrophoben Reaktionsmedium vorliegen und somit eine Erweiterung des chemischen Raumes durch die Povarov-Reaktion, eine Boc-Entschützung, eine Pictet-Spengler-Reaktion, sowie eine Suzuki-Miyaura-Kreuzkupplung an DNA-Konjugaten ermöglicht werden. Da Proben aus chemischen Reaktionen an DNA-Konjugaten oftmals nicht ausreichend durch die verfügbaren Methoden aufgereinigt werden konnten, wurde im weiteren Verlauf dieser Arbeit eine neue Aufreinigung basierend auf einer dispersen Festphasenextraktion entwickelt. Schließlich konnte durch die etablierten Copolymer-vermittelten chemischen Reaktionen und der neuen Aufreinigungs-Methode eine 105.288-Mitglieder große DNA-kodierte Molekülbibliothek hergestellt und eine deutliche Verbesserung der Reinheit erzielt werden. Die starke Hydrophilie des DNA-Stranges birgt Einschränkungen in der Wahl des Lösungsmittels und somit der durchzuführenden chemischen Reaktion, da viele Reaktionen nur unter Ausschluss von Wasser erfolgreich ablaufen. Daher sollten in dem letzten Teil der Arbeit nicht-funktionalisierte amphiphile Block-Copolymere eingesetzt werden, um ein Vermischen von DNA-Konjugaten in organischen Lösungsmitteln zu ermöglichen. Diese Copolymer-DNA-Interaktion könnte eine neue Herangehensweise für die Durchführung von chemischen Reaktionen an DNA-Konjugaten in organischen Lösungsmitteln liefern.2022-01-01T00:00:00ZTargeting PRMT5 protein-protein interactions with peptidic modulators
http://hdl.handle.net/2003/41205
Title: Targeting PRMT5 protein-protein interactions with peptidic modulators
Authors: Krzyzanowski, Adrian
Abstract: Protein arginine methyltransferase 5 (PRMT5) is an important enzyme, methylating arginine residues of its substrates. PRMT5 is involved in a very large number of various cellular process, and has strong ties to a plethora of health disorders. PRMT5 mediates a number of protein-protein interactions (PPIs) with diverse adaptor proteins, such as the obligate binding partner MEP50, and adaptor proteins RioK1, pICln and COPR5. Modulation of PRMT5 PPIs appears as an attractive alternative to the inhibition of the active methylation site, giving an opportunity for significantly more precise targeting of the PRMT5 functionality in cells. This thesis describes pathways for development of peptidomimetics intended for the inhibition of various PPIs formed by PRMT5 or its adaptor protein MEP50. PPI between PRMT5 and MEP50 was investigated using available structural data to design inhibitory peptides. The compounds were synthesised and evaluated using biophysical and enzymatic assays. None of the synthesised compounds showed any activity in the employed assays. In the second part, the thesis describes the analysis of a potential PPI between SUZ12 and MEP50. A number of SUZ12 fragments spanning different protein regions were synthesised and tested for the direct interaction with the PRMT5-MEP50 complex. The analysis indicated that the short SUZ12 sequence CPWCTL is responsible for the interaction with the methyltransferase complex. Further analysis with the binding sequence and control proteins showed very strong non-specific interactions. In light of the obtained results any further peptidomimetic development based on the SUZ12 sequence was not pursued. The final chapters of the thesis focus on the PPIs between PRMT5 and adaptor proteins RioK1, pICln and COPR5. A consensus sequence GQF[D/E]DA[D/E], identified in the terminal regions of the adaptor proteins, was determined to be responsible for mediating the interactions with PRMT5. Biophysical assays and X-ray crystallography allowed to characterise the binding interface and revealed that the consensus sequence binds to the non-catalytic TIM barrel domain of PRMT5. The biophysical data were then used for the design of highly stable macrocyclic PRMT5 adaptor protein interaction inhibitors. Optimisation of the molecular structure resulted in a potent cyclic PRMT5 binder (KD = 89 nM). The developed molecule could inhibit the PPI between PRMT5 and full length pICln when tested in vitro (IC50 = 654 nM). Examination of the compound activity in cellular lysates revealed a surprising selectivity towards the inhibition of the PRMT5 interactions with RioK1 over the interactions with pICln. The developed compound did not supress the enzymatic activity of the methyltransferase and did not inhibit the interaction with MEP50.2022-01-01T00:00:00ZInvestigating a role for EDI3 in tumor growth and metastasis in breast cancer using a doxycycline-inducible knockdown system
http://hdl.handle.net/2003/41196
Title: Investigating a role for EDI3 in tumor growth and metastasis in breast cancer using a doxycycline-inducible knockdown system
Authors: Glotzbach, Annika
Abstract: Metastasis remains a major problem for tumor therapy. In endometrial and ovarian cancer, metastasis and worse survival was found to be associated with elevated EDI3 (GPCPD1; GDE5; GDPD6) expression in primary tumors. EDI3 is a glycerophosphodiesterase which cleaves glycerophosphocholine (GPC) to form choline and glycerol-3-phosphate (G3P) and is therefore considered one of the key enzymes involved in choline metabolism. Altered choline metabolism is a recognized metabolic hallmark of cancer and was reported in breast, ovarian, and prostate cancers. Previously, in vitro studies revealed that silencing EDI3 transiently in various breast cancer cell lines resulted in altered choline metabolism and impaired cellular migration, attachment, and spreading. However, stable constitutive EDI3 knockdown led to compensation of metabolite levels over time, which was accompanied by a loss of the migration phenotype. Therefore, in the present work a doxycycline (Dox) inducible EDI3 knockdown system was established in luciferase-expressing ER-HER2+ breast cancer cells, which reduces compensatory effects and allows to investigate EDI3 in tumor growth and metastasis in vivo. To create cell lines in which EDI3 is inducibly silenced, stable luciferase-expressing HCC1954 cells were generated and subsequently transduced with lentiviral particles, which resulted in three different Dox-inducible EDI3 knockdown cell lines containing independent EDI3-targeting shRNA oligos. Dox treatment led to a time and dose dependent decrease in EDI3 RNA and protein expression. Mass spectrometry analyses revealed that induced EDI3 knockdown also led to dose dependent alterations in endogenous choline metabolites and phospholipid levels. Using various in vitro assays, it could be shown that EDI3 knockdown resulted in significant reduction in colony formation and proliferation, processes which are relevant in the formation of metastasis. Furthermore, EDI3 silencing rendered cells more susceptible towards anoikis. However, Dox-induced EDI3 knockdown had only little effect on adhesion and no effect on migration. To investigate EDI3’s role in tumor growth and metastasis in vivo, different tumor models were established in immunodeficient mice. The subcutaneous tumor model showed no significant effect on primary tumor growth. However, in a mouse model for peritoneal metastasis, luminescence imaging revealed lower signals indicative of less metastasis formation in the EDI3 knockdown condition. Furthermore, it could be shown that silencing EDI3 was associated with reduced tumor burden, less ascites fluid and longer survival time. Altogether, this thesis provides, for the first time, in vivo evidence that supports a role for EDI3 in metastasis formation, which further emphasizes the importance of choline and glycerophospholipid metabolism in this process.2022-01-01T00:00:00ZRism-based pressure-dependent computational spectroscopy
http://hdl.handle.net/2003/41194
Title: Rism-based pressure-dependent computational spectroscopy
Authors: Pongratz, Tim
Abstract: Spectroscopic measurements are an indispensable tool in chemical analysis; even under extreme conditions such as high hydrostatic pressures, they can provide valuable insights. Theoretical methods that can reliably reproduce observables in solution can be used to validate the obtained results. A common theoretical model is the Reference Interaction Site Model (RISM), which was used in this work. In the first part, a previously developed method for calculating IR frequencies with the embedded cluster(EC)-RISM under equilibrium conditions was extended to non-equilibrium thermodynamics for IR spectroscopy. The pressure-dependent IR frequency shifts of TMAO and the cyanide anion were investigated as model systems. Furthermore, EC-RISM was used here for the first time to calculate EPR observables at ambient conditions. First, experiments with the geometrically optimized structure showed that EC-RISM gives significantly better results than a standard continuum calculation despite a large deviation from the experiment. A significant improvement in the direction of the experimental values was achieved by using a large number of snapshots from an ab initio molecular dynamics simulation (AIMD) instead of a single geometry. In general, in the context of the theoretical description of high-pressure effects on proteins, the critical question can be raised whether using force fields parameterized for ambient conditions is appropriate for high-pressure conditions. To answer this question, the pressure dependence of the peptide backbone was investigated in the third part, and the small molecules N-methyl acetamide (NMA) and Ac-Gly/Ala-NHMe were used as model systems. In this work, it was shown that EC-RISM is a suitable method of choice for the calculation of spectroscopic observables in solution. Especially when non-ambient conditions are to be examined, EC-RISM shows its strength since it is relatively easily extensible, e.g., high-pressure environments.2022-01-01T00:00:00ZDifferentiation of distinct mesoderm subtypes from regulatory interactions between FGF and BMP signaling
http://hdl.handle.net/2003/41184
Title: Differentiation of distinct mesoderm subtypes from regulatory interactions between FGF and BMP signaling
Authors: Gattiglio, Marina
Abstract: Distinct mesodermal precursors arise during gastrulation in a precise temporal and spatial manner. In the mouse, the cells differentiating earlier in a more proximal position form the precursors for the heart and vasculature, followed in a more distal position by precursors of the urogenital system and then the musculoskeletal system. Mesoderm patterning is controlled by signals such as BMP4, produced by the extraembryonic ectoderm, and FGFs and WNTs produced by the epiblast itself. How do these signals interact in this process and whether cell-cell crosstalk can influence mesoderm patterning is still largely unknown.
Here I address this question with a 2D cell culture model that employs primed pluripotent stem cells resembling mouse epiblast cells and differentiates them with precise concentrations of different signaling molecules in a chemically defined medium. By titrating BMP4, I observe that high concentrations of BMP4 promote the expression of proximal mesoderm markers, while intermediate to low concentrations favour distal and pan-mesoderm markers. The opposite effect is seen with a titration of FGF. A scRNAseq analysis revealed that endogenous FGF signaling lead to the differentiation of heterogeneous mixtures of cell types, and that their proportions were affected by the dose of exogenous FGF. Furthermore, higher doses of exogenous FGF reduced the expression of BMP ligands in the cells, and promoted the expression of selected WNT ligands and endogenous FGFs, indicating the existence of a positive FGF feedback loop. Cells associated with high FGF signaling levels were also found to be spatially clustered in the cultures, suggesting that this loop could generate coherent clusters of cells with discrete identities in a cell population. Based on these findings, I propose a molecular mechanism for the FGF feedback loop. Together, these results indicate that the patterning of the mesoderm is dependent on a combination of external signaling and cell-cell crosstalk.; Während der Gastrulation entstehen distinkte mesodermale Vorläuferzellen in einer präzisen zeitlichen und räumlichen Abfolge. In der Maus bilden Zellen, die früh aus proximalen Positionen differenzieren, die Vorläufer von Herz und Gefäßsystem, während später aus distalen Positionen Vorläufer des urogenitalen Systems und anschließend des Bewegungsapparats gebildet werden. Die Identität mesodermaler Zellen wird durch Signale wie BMP4, die vom extraembryonalen Ektoderm produziert werden, sowie von FGFs und WNTs, die vom Epiblast selbst produziert werden, kontrolliert. Wie diese Signale interagieren und ob Zell-Zell-Kommunikation die Mesodermbildung beeinflusst, ist größtenteils unbekannt.
Um diese Frage zu beantworten verwende ich ein 2D-Zellkulturmodell aus epiblastartigen Mausstammzellen, die mit verschiedenen Konzentrationen bestimmter Signalmoleküle in einem chemisch definierten Medium differenziert werden. BMP4-Titrierung zeigte, dass hohe Konzentrationen von BMP4 die Expression proximaler Mesodermmarker unterstützen, während mittlere bis geringe Konzentrationen distale und panmesodermale Marker begünstigen. Das Gegenteil wird durch FGF-Titrierung ersichtlich. Die Analyse von scRNAseq-Daten zeigte, dass endogene FGF-Signale zur Differenzierung heterogener Zelltypen führen, deren Verhältnis von der Dosis von exogenem FGF abhängt. Zudem reduzierten höhere Dosen exogenen FGFs die Expression von BMP-Liganden in den Zellen und unterstützten die Expression einiger bestimmter WNT-Liganden und endogenen FGFs, was die Existenz eines positiven FGF-Feedback-Loops impliziert. Zellen, die mit einem hohen FGF-Signal-Level assoziiert sind, waren außerdem innerhalb der Kultur räumlich geclustert, was die Vermutung nahelegt, dass der FGF-Feedback-Loop kohärente Zellcluster mit diskreten Identitäten innerhalb einer Zellpopulation generiert. Basierend auf diesen Erkenntnissen schlage ich einen molekularen Mechanismus für den FGF-Feedback-Loop vor. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass die mesodermale Identität in Abhängigkeit einer Kombination von externen Signalen und Zell-Zell-Kommunikation bestimmt wird.2022-01-01T00:00:00ZPlasmadiagnostische Untersuchungen an einer modifizierten Mikrowellenplasmafackel (MPT) und Einsatz der MPT-OES zur elementspezifischen Detektion
http://hdl.handle.net/2003/41183
Title: Plasmadiagnostische Untersuchungen an einer modifizierten Mikrowellenplasmafackel (MPT) und Einsatz der MPT-OES zur elementspezifischen Detektion
Authors: Prokisch, Christian1999-01-01T00:00:00ZStructural insights into muscle organisation by electron cryo-tomography
http://hdl.handle.net/2003/41176
Title: Structural insights into muscle organisation by electron cryo-tomography
Authors: Wang, Zhexin
Abstract: Movement is the essence of life in the animal realm. Skeletal muscle is an essential tissue specialised for movement. Muscle cells are multi-nucleated cells containing bundles of myofibrils, which are segmented into the smallest contractile units, named sarcomeres. While sarcomeres are known to contain thin (actin) and thick (myosin) filaments, the detailed architecture, especially the high-resolution and 3-dimensional (3D) information, remains obscure. In this thesis, I obtained the first high-resolution 3D pictures of the sarcomere using cryo-focused ion beam milling (cryo-FIB-milling) and electron cryo-tomography (cryo-ET). The sarcomere organisation highlights a molecular plasticity which ensures efficient muscle contraction in different environments. Furthermore, from these native 3D images, I determined the first structures of the ruler protein, nebulin, to a resolution of 4.5 Å, which establishes the molecular basis for its functions in thin filament stabilisation, length control and myosin-binding regulation. The in situ structures also revealed a double-head conformation of myosin that reveals inherent variability to increases myosin’s capability for binding to the thin filaments. Collectively, my thesis research provides unique insights into muscle structures that allow improved dynamic modelling of muscle contraction and muscle diseases. This research also establishes a new cryo-FIB-ET approach for structurally characterising muscle components in different types of muscles and diseased states.2022-01-01T00:00:00ZRecursion quantification analysis reveals a cellular morphodynamics - ERK activity recursive relationship
http://hdl.handle.net/2003/41175
Title: Recursion quantification analysis reveals a cellular morphodynamics - ERK activity recursive relationship
Authors: Campos-Medina, Manuel
Abstract: One of the enigmas of cellular biology is the process by which eukaryotic cells,
abandoning their unitary role, organize to form complex systems of organs. Despite
the details of such pattern emergence process are yet to be elucidated, there is a
significant degree of coordination among adjacent cells. For decades, several proteins
have been monitored to track cellular communication. Although advancements have
been made regarding our understanding of the internal cellular signaling network,
there is no clear answer regarding how cells can communicate. One of the most
studied families of proteins is the Extracellular-signal-regulated-kinases. Due to its
myriad interactions and influence over most major cellular processes, it has been
established as a central node in the cellular signaling network. However, the number
of studies regarding its dynamic behavior is limited. Although its connection with
cellular morphodynamics has also been well-documented, there is no consensus on
the time scale of their relationship.
By studying ERK's dynamics upon growth factor stimulation, we found that the
local cellular environment influences ERK's activation tendencies. Nonetheless, this
effect is more significant at low growth factor concentrations. We employed a nonlinear
dynamics multidimensional analysis to explore the existence of recurring
patterns within ERK dynamics and cellular morphodynamics. We focused on the highfrequency
components of each of these dynamics during the basal state of cells and
after either EGF or HRG stimulation. After cells were exposed to cell-fate-decision
induing dosages of growth factors, our analysis showed an increase in the persistence
of ERK dynamics and cellular morphodynamics recurrence patterns. Furthermore,
we found that the recurrences that exist within ERK dynamics and cellular
morphodynamics occur at similar time scales. Moreover, our results showed that these
two dynamic processes are intrinsically related, and their relationship is not modified
upon growth factor stimulation.
By extending the recurrence analysis to neighboring cells' dynamic behavior,
we corroborated our findings on the influence of the local cellular environment on ERK
dynamics and cellular morphodynamics. ERK dynamics in neighboring cells kept their
communication pattern after EGF stimulation. However, cellular morphodynamics
between neighboring cells synchronized only after stimulation with low concentrations
of EGF.
Our work sets the framework for conceiving ERK dynamics and cellular
morphodynamics as inseparable processes. It also sheds light on conceptualizing
cellular communication as a process that could occur via physiological concentrations
of EGF among MCF-7 cells.; Eines der Rätsel der Zellbiologie ist der Prozess, durch den sich eukaryotische
Zellen unter Aufgabe ihrer einheitlichen Rolle zu komplexen Organsystemen
organisieren. Obwohl die Einzelheiten eines solchen Musterbildungsprozesses noch
nicht geklärt sind, gibt es ein erhebliches Maß an Koordination zwischen benachbarten
Zellen. Seit Jahrzehnten werden verschiedene Proteine überwacht, um die zelluläre
Kommunikation zu verfolgen. Obwohl unser Verständnis des internen zellulären
Signalnetzwerks Fortschritte gemacht hat, gibt es keine klare Antwort darauf, wie
Zellen kommunizieren können. Eine der am meisten untersuchten Proteinfamilien ist
die der extrazellulären signalregulierten Kinasen. Aufgrund ihrer unzähligen
Interaktionen und ihres Einflusses auf die meisten wichtigen zellulären Prozesse hat
sie sich als zentraler Knotenpunkt im zellulären Signalnetzwerk etabliert. Die Zahl der
Studien zu ihrem dynamischen Verhalten ist jedoch begrenzt. Obwohl sein
Zusammenhang mit der zellulären Morphodynamik gut dokumentiert ist, gibt es keinen
Konsens über die Zeitskala ihrer Beziehung.
Bei der Untersuchung der ERK-Dynamik nach Stimulation durch
Wachstumsfaktoren haben wir festgestellt, dass die lokale zelluläre Umgebung die
Aktivierungstendenzen von ERK beeinflusst. Dieser Effekt ist jedoch bei niedrigen
Konzentrationen des Wachstumsfaktors stärker ausgeprägt. Wir setzten eine
multidimensionale Analyse der nichtlinearen Dynamik ein, um die Existenz
wiederkehrender Muster innerhalb der ERK-Dynamik und der zellulären
Morphodynamik zu untersuchen. Wir konzentrierten uns auf die hochfrequenten
Komponenten jeder dieser Dynamiken während des Grundzustands der Zellen und
nach EGF- oder HRG-Stimulation. Nachdem die Zellen einer den Zellzustand
beeinflussenden Dosis von Wachstumsfaktoren ausgesetzt wurden, zeigte unsere
Analyse eine Zunahme der Persistenz der ERK-Dynamik und der zellulären
Morphodynamik-Rezidivmuster. Darüber hinaus stellten wir fest, dass die
Wiederholungen innerhalb der ERK-Dynamik und der zellulären Morphodynamik auf
ähnlichen Zeitskalen auftreten. Darüber hinaus zeigten unsere Ergebnisse, dass diese
beiden dynamischen Prozesse eng miteinander verbunden sind und ihre Beziehung
durch die Stimulation mit Wachstumsfaktoren nicht verändert wird.
Indem wir die Rekurrenzanalyse auf das dynamische Verhalten benachbarter
Zellen ausdehnten, konnten wir unsere Erkenntnisse über den Einfluss der lokalen
zellulären Umgebung auf die ERK-Dynamik und die zelluläre Morphodynamik
untermauern. Die ERK-Dynamik in benachbarten Zellen behielt ihr
Kommunikationsmuster nach der EGF-Stimulation bei. Die zelluläre Morphodynamik
zwischen benachbarten Zellen synchronisierte sich jedoch nur nach Stimulation mit
niedrigen EGF-Konzentrationen.
Unsere Arbeit bildet den Rahmen, um die ERK-Dynamik und die zelluläre
Morphodynamik als untrennbare Prozesse zu begreifen. Sie wirft auch ein Licht auf
die Vorstellung, dass zelluläre Kommunikation ein Prozess ist, der durch
physiologische EGF-Konzentrationen zwischen MCF-7-Zellen stattfinden könnte.2022-01-01T00:00:00ZStructural basis for specific inhibition of the deubiquitinase UCHL1
http://hdl.handle.net/2003/41164
Title: Structural basis for specific inhibition of the deubiquitinase UCHL1
Authors: Grethe, Christian; Schmidt, Mirko; Kipka, Gian-Marvin; O’Dea, Rachel; Gallant, Kai; Janning, Petra
Abstract: Ubiquitination regulates protein homeostasis and is tightly controlled by deubiquitinases (DUBs). Loss of the DUB UCHL1 leads to neurodegeneration, and its dysregulation promotes cancer metastasis and invasiveness. Small molecule probes for UCHL1 and DUBs in general could help investigate their function, yet specific inhibitors and structural information are rare. Here we report the potent and non-toxic chemogenomic pair of activity-based probes GK13S and GK16S for UCHL1. Biochemical characterization of GK13S demonstrates its stereoselective inhibition of cellular UCHL1. The crystal structure of UCHL1 in complex with GK13S shows the enzyme locked in a hybrid conformation of apo and Ubiquitin-bound states, which underlies its UCHL1-specificity within the UCH DUB family. Phenocopying a reported inactivating mutation of UCHL1 in mice, GK13S, but not GK16S, leads to reduced levels of monoubiquitin in a human glioblastoma cell line. Collectively, we introduce a set of structurally characterized, chemogenomic probes suitable for the cellular investigation of UCHL1.2022-10-10T00:00:00ZThe impact of alkyl- and alkoxy-functionalization on the responsive behaviour of metal-organic frameworks: from conventional to frustrated flexibility
http://hdl.handle.net/2003/41162
Title: The impact of alkyl- and alkoxy-functionalization on the responsive behaviour of metal-organic frameworks: from conventional to frustrated flexibility
Authors: Pallach, Roman
Abstract: The investigation of functional materials, which can change their physical properties depending on external triggers is of ongoing interest for various fields of materials research. Metal-organic frameworks (MOFs) are porous coordination polymers constructed of inorganic building units (e.g., metal-ions, metal-oxo-clusters) joined by organic building units (e.g., multidentate carboxylates), also called linkers. A particular subclass of MOFs are flexible MOFs, which undergo structural changes as a function of external stimuli. This behaviour arises from a delicate balance between enthalpic (e.g., dispersion interactions) and entropic (e.g., vibrational motions) contributions, which can be modified and controlled by the introduction of additional functional groups at the organic building unit of the framework.
In this work, alkyl-, alkoxy-, and methoxy-alkoxy group functionalization of the organic building unit was utilized to modulate and study the influence of sidechain length and polarity on the structural responsivity of two fundamentally different MOF platforms. Of these, one is intrinsically flexible (DMOF-1), while the other one is structurally rigid (MOF-5).
For the DMOF-1-based materials, it has been shown in the past that the implementation of alkoxy groups induces a guest- and temperature-depending switching between contracted and expanded phases. In this work, a series of purely alkyl-functionalized DMOF-1 derivatives was studied and structurally characterized in great detail by means of single crystal and powder X-ray diffraction. Furthermore, their sorption behaviour towards N2, CO2 and C3 and C4 hydrocarbons was investigated and subsequently compared to their alkoxy counterparts, which revealed significant differences that strongly relate to the different polarities of the functional groups. Particular highlights are path-depending multi-step CO2 sorption behaviours and an interesting propane/propylene gating behaviour with potential for an application in the separation of the gases, both phenomena were studied by in-situ X-ray diffraction techniques. Upon thermal treatment, the new alkyl functionalized DMOF-1 derivatives exhibit a significantly softer behaviour than their alkoxy counterparts indicating a much flatter free energy landscape for these materials in connection with weaker intra-framework interactions of the less polar alkyl groups.
In the second part of this thesis, the concept of frustrated flexibility of MOFs is introduced. Due to the incompatibility of a rigid, non-responsive MOF structure type (here MOF-5) with intra-framework dispersion forces demanding a densification of the structure a new type of responsive behaviour evolves. Controlled by chemical functionalization of the organic linkers with dispersion energy donating (DED) alkoxy groups, a series of materials is obtained, which reversibly switch between a cubic crystalline and either a non-crystalline or a rhombohedral phase. These transitions are either driven enthalpically through guest adsorption/desorption or by vibrational entropy at elevated temperatures. Importantly, frustratedly flexible behaviour is shown to be tuneable by adjusting the length and polarity of the DED groups.
Overall, the results presented herein demonstrate that linker functionalization is a powerful tool to modulate the free energy landscape of MOF materials. For intrinsically flexible MOFs this approach allows targeted fine-tuning of their flexible behaviour, while for rigid MOFs it allows for the generation of completely new and exotic responsive behaviour.2022-01-01T00:00:00ZRational design of multi-component functionalized supramolecular assemblies
http://hdl.handle.net/2003/41142
Title: Rational design of multi-component functionalized supramolecular assemblies
Authors: Yan, Qianqian
Abstract: In the past few decades, a plethora of metalla-supramolecular architectures, obtained by rational design approaches, were successfully explored. In recent years, the focus of the field has progressively expanded from the purely structural studies, towards the implementation of functions such as catalysis and sensing. In this work, a series of salen- (or salphen-) based macrocyclic architectures is obtained through the condensation of functionalized bis-salicylaldehyde derivative ligands, with diamine derivatives, followed by metal complexation with transition metal ions. The self-assembled metallacycles’ properties have been tuned by modification of the building blocks, to explore: i) chiroptical properties and assembly into nanomaterials, ii) photoredox catalysis, and iii) formation of mechanically interlocked molecules (MIMs).2022-01-01T00:00:00ZNahinfrarote und zirkular polarisierte Lumineszenz von Donor-Kupfer(I)-Akzeptorkomplexen
http://hdl.handle.net/2003/41136
Title: Nahinfrarote und zirkular polarisierte Lumineszenz von Donor-Kupfer(I)-Akzeptorkomplexen
Authors: Muthig, André
Abstract: Das Design molekularer Emitter, die effiziente nahinfrarote (NIR) und zirkular polarisierte Lumineszenz (CPL) ermöglichen, sind zwei Herausforderungen der aktuellen Forschung, welche im Rahmen dieser Arbeit durch verschiedene Ansätze untersucht wurden. Als Strukturmotiv wurden Donor-Kupfer(I)-Akzeptorkomplexe gewählt, welche sich innerhalb der vergangenen fünf Jahre zu vielversprechenden Alternativen zu den bis dato führenden Iridium(III)-emittern entwickelt haben. Die vorwiegend linearen Kupfer(I)-komplexe mit Amidodonoren und Carbenakzeptoren weisen häufig nicht den für Übergangsmetallkomplexe üblichen Emissionsprozess der Phosphoreszenz auf, sondern thermisch aktivierte verzögerte Fluoreszenz (TADF). Hierdurch lassen sich hohe strahlende Ratenkonstanten kr > 106 s 1 realisieren, welche die der phosphoreszierenden Iridium(III)-emitter bereits übertreffen. Allerdings ist der Emissionsbereich, in welchem die bislang bekannten Kupfer(I)-emitter kompetitiv mit Komplexen schwererer Metalle sind, auf den blauen bis orangen Farbbereich beschränkt. Ferner wurde diese vielversprechende Kupfer(I)-komplexklasse bisher nicht auf die Ausprägung ihrer CPL, gemessen am Emissionsdissymmetriefaktor glum, hin untersucht. Im Rahmen dieser Arbeit wurde zum einen durch das Einführen unterschiedlicher Komplexgeometrien bzw. chiraler Strukturmotive die Emission der Kupfer(I)-emitter bathochrom verschoben und CPL ermöglicht. So weisen die synthetisierten Halbsandwich- bzw. trigonalen Komplexe Phosphoreszenz im orangen bzw. NIR-Spektralbereich auf. Wohingegen mit dem [2.2]Paracyclophanyl- und dem Binaphtylmotiv zwei für Kupfer(I)-basierte TADF-Emitter vielversprechende Strukturmotive identifiziert wurden, die glum ≤ 7∙10 3 ermöglichen. Zum anderen wurden Anwendungsmöglichkeiten der hergestellten Kupfer(I)-komplexe wie die Verwendung als Einzelphotonenquellen und als Emittermaterial in OLEDs aufgezeigt.; Phase transitions in biological systems are controversially discussed. As the origin of nonlinearities, they have been suggested responsible for cellular functions including nerve pulse propagation.
In pure lipid interfaces characteristic functions, such as permeability, are modulated during a transition. These relations could have drastic implications for cells because their membranes are lipid-based. However, evidence for these transitions in cellular membranes of excitable cells - which are involved in the transmission of nerve pulses - has not been provided so far.
Within this thesis thermodynamic phase states in lipid-based interfaces are characterized based on the use of a fluorescent dye (Atto488-DPPE) as local state reporter. Optical state diagrams of artificial, lipid interfaces are recorded, and state dependent kinetics investigated.
Upon the straightforward application of this method to single, neuronal cells, a nonlinearity in the optical response is detected within the cellular membrane and identified as phase transition.
The transition is extraordinary sharp (1°C) and sensitive to pH variations in the extracellular buffer.
The existence of distinct physical phase states in cellular membranes and their highly nonlinear characteristic provides strong evidence that the membrane state is indeed crucial for excitability and conduction of nerve pulses. The results further underline that the membrane state has the potential to modify cell functionality in general as it is subject to modulation by physiologically important parameters such as pH.2022-01-01T00:00:00ZFunktionalisierte Triorganofluorsilane als Markierungsvorläufer für Kontrastmittel in der Positronen-Emissions-Tomographie
http://hdl.handle.net/2003/41123
Title: Funktionalisierte Triorganofluorsilane als Markierungsvorläufer für Kontrastmittel in der Positronen-Emissions-Tomographie
Authors: Iovkova, Ljuba2010-01-01T00:00:00ZEndohedrally functionalized heteroleptic coordination cages for phosphate ester binding
http://hdl.handle.net/2003/41114
Title: Endohedrally functionalized heteroleptic coordination cages for phosphate ester binding
Authors: Platzek, André; Juber, Selina; Yurtseven, Cem; Hasegawa, Shota; Schneider, Laura; Drechsler, Christoph; Ebbert, Kristina E.; Rudolf, Robin; Yan, Qian-Qian; Holstein, Julian J.; Schäfer, Lars V.; Clever, Guido H.
Abstract: Metallosupramolecular hosts of nanoscopic dimensions, which are able to serve as selective receptors and catalysts, are usually composed of only one type of organic ligand, restricting diversity in terms of cavity shape and functional group decoration. We report a series of heteroleptic [Pd2A2B2] coordination cages that self-assemble from a library of shape complementary bis-monodentate ligands in a non-statistical fashion. Ligands A feature an inward pointing NH function, able to engage in hydrogen bonding and amenable to being functionalized with amide and alkyl substituents. Ligands B comprise tricyclic aromatic backbones of different shape and electronic situation. The obtained heteroleptic coordination cages were investigated for their ability to bind phosphate diesters as guests. All-atom molecular dynamics (MD) simulations in explicit solvent were conducted to understand the mechanistic relationships behind the experimentally determined guest affinities.2022-09-08T00:00:00ZReconstitution of RhoGTPase membrane loading
http://hdl.handle.net/2003/41098
Title: Reconstitution of RhoGTPase membrane loading
Authors: Armstrong, Michael
Abstract: The polarisation of membrane-bound signalling molecules that control the actin cytoskeleton, such as Rho-type GTPases and phosphoinositides is essential for the spatial organisation of cell shape. However, the ubiquitous solubilisation factor RhoGDI (Guanosine Dissociation Inhibitor) sequesters the majority of RhoGTPases in the cytosol, away from the membrane. Starting from defined complexes of RhoGTPases and RhoGDI, we investigate how RhoGTPases load onto membranes.
To this end, we reconstituted the recruitment of the RhoGTPase Cdc42 to supported lipid bilayers and followed this process by multi-colour single molecule imaging. This allowed us to investigate of the effects of several suggested regulators of Cdc42 recruitment. These included regulators catalytic cycle such as activating guanosine exchange factors (GEFs), the biochemical composition and characteristics of the membrane such as charge or lipid composition, and the use of cell lysate to probe for a still unidentified GDI dissociation factor (GDF).
By capturing these events as a high time resolution, it was possible to not only understand what modulates Cdc42 recruitment, but also to decipher at what point during the recruitment process GDI dissociated.
Using reconstitution along with powerful TIRF microscopy and the development of single molecule tracking approaches we showed that RhoGTPase separate from their solubilisation factor RhoGDI prior binding to the membrane. Furthermore, once separated from RhoGDI, it is the composition of the membrane itself which regulates the binding frequency of RhoGTPases at the membrane. We go on to show that, on a supported lipid bilayer, the GEF ITSN is incapable of promoting recruiting of Cdc42 alone, nor the Cdc42:GDI complex suggesting that the catalytic and spatial cycles of the RhoGTPases not coupled in the process of RhoGTPase membrane recruitment.
Finally, through the inclusion of cell lysate in our reconstitutions and in contrast to assumptions in the field, we observe no evidence for an essential active RhoGDI displacement factor (GDFs) that facilitates RhoGDI removal.2022-01-01T00:00:00ZOptochemical control of DNA methylation erasers and readers enables kinetic insights into their domain-dependent interplay
http://hdl.handle.net/2003/41094
Title: Optochemical control of DNA methylation erasers and readers enables kinetic insights into their domain-dependent interplay
Authors: Lin, Tzu-Chen
Abstract: 5-Methylcytosine (5mC) is a central epigenetic mark of mammalian DNA. It mainly occurs in cytosine-guanine (CpG) dinucleotides and is recognized competitively by methyl-CpG binding domain (MBD) proteins and ten-eleven-translocation (TET) dioxygenases, which act as methylation readers and erasers to mediate regulatory chromatin crosstalk and epigenome editing, respectively. The dynamic reader-eraser interplay at their common substrate is therefore highly regulated for a coherent transcriptional program. However, mechanistic insights of their interplay are hampered by a lack of suitable methodology to control their activities in living cells.
This work employs light-activatable human TET1 and MBD1 to enable precise temporal control of enzymatic oxidation activity or substrate recognition. Light activation is achieved by genetic encoding of a photocaged serine that can be co-translationally incorporated at critical protein sited in mammalian cells. On the one hand, monitoring the TET1-catalyzed 5mC oxidation kinetics in vivo reveals a multifaceted domain-dependent modulation by MBD1. While the MBD domain of MBD1 negatively regulates TET1 oxidation kinetics and dominates the interplay by competing for the 5mC substrates, the third Cys-x-x-Cys (CXXC3) domain of MBD1 contrarily modulates TET1 activity by binding to nonmethylated CpGs. Intriguingly, the transcriptional repressor domain (TRD) does not influence 5mC oxidation kinetics by TET1. On the other hand, studies with light-activatable MBD1 indicate a domain-dependency of cellular mCpG binding kinetics. Depriving the nonmethylated CpG affinity of the CXXC3 domain enhances binding kinetics, whereas the absence of the TRD domain results in decreased binding kinetics. Moreover, the light-activatable MBD1 can further unveil the mechanism of MBD1-TET1 interplay by uncoupling the process from prior binding events of MBD1. Collectively, this work enables first kinetic insights into the domain-dependent interplay of methylation readers and erasers in the natural chromatin context and provides novel tools to unravel the dynamic chromatin regulation program.2022-01-01T00:00:00ZTemperatur-, hydrostatische Druck- und Kosolvenseffekte auf die Flüssig-Flüssig-Phasentrennung verschiedener Proteinsysteme
http://hdl.handle.net/2003/41088
Title: Temperatur-, hydrostatische Druck- und Kosolvenseffekte auf die Flüssig-Flüssig-Phasentrennung verschiedener Proteinsysteme
Authors: Cinar, Hasan
Abstract: Bereits vor 120 Jahren entstand die Idee, dass kondensierte, tropfenartige Granula zur Struktur des Protoplasmas beitragen. Jedoch wurde erst in den letzten 10 Jahren neben der durch "klassische" Lipid-Doppelschichtmembranen gestützte Kompartimentierung (z.B. Plasmamembran, Lysosomen, endoplasmatisches Retikulum, Mitochondrien) erkannt, dass die Flüssig-Flüssig-Phasentrennung (LLPS) von Proteinen und Nukleinsäuren eine wichtige Rolle bei der membranlosen Kompartimentierung von Zellen durch die Bildung von biomolekularen Kondensaten spielten. Solche Kondensationsprozesse sind mit zahlreichen intrazellulären Organismen an der subzellulären Organisation wie, P-bodies, Stressgranula, Keimgranula und Zentrosomen im Zytoplasma und Nukleoli, Chromatin und Cajal-Körper im Zellkern beteiligt. Unteranderem sind diese Kondensate an Membranfunktionen, wie beim Kernporenkomplex beteiligt oder man findet sie, wie im Fall der postsynaptischen Dichte, in der Nähe von Zellmembranen wieder. Im Bestreben, biomolekulare LLPS-Prozesse zu verstehen, konzentriert sich diese Arbeit auf die Gleichgewichtsthermodynamik der Flüssig-Flüssig-Phasentrennung unterschiedlicher Proteinsysteme in Abhängigkeit der Temperatur, des Druckes und unterschiedlicher Kosolvens-Bedingungen. Um die Funktion solcher LLPS-gesteuerten biologischen Kompartimentierungsvorgänge vollständig verstehen zu können, reicht jedoch die Kenntnis des Gleichgewichtsverhaltens solcher LLPS-Prozesse nicht aus. Aufgrund dessen wurde die Arbeit auf die Untersuchung der Phasenübergangskinetik der LLPS-Prozesse erweitert.2022-01-01T00:00:00Z