Physiologische Charakterisierung und Expression von humanen Tyrosylprotein Sulfotransferasen

Abstract

Die Sulfatierung von Tyrosyl-Resten in Proteinen ist die häufigste posttranslationale Modifikation dieser Aminosäure und ihr physiologischer Einfluss ist bisher erst in wenigen Fällen geklärt. Es zeigte sich, dass die sulfatierten Tyrosyl-Reste z. B. bei der effektiven Abwehr von Pathogenen, der Blutgerinnung, der Entzündungshemmung und dem Verdau von Nahrung eine Rolle spielen. Über die Enzyme, die den Sulfuryl-Transfer auf Tyrosyl-Reste von Proteinen katalysieren, ist bisher wenig bekannt. Im ersten Teil der Arbeit wurden deshalb die Tyrosylprotein Sulfotransferasen physiologisch charakterisiert. Die Lokalisation von hTPST1-GFP-Fusionsproteinen in COS-7-Zellen erfolgte im Golgi-Apparat. Weiterhin konnte nachgewiesen werden, dass es sich bei der Schubspannung, die aufgrund des Blutflusses auf die gefäßabschließenden Endothelzellen (HUVEC) einwirkt, um einen Regulator für die Expression beider TPST-Isoformen in diesen Zellen handelt. Bei geringer Schubspannung (entsprechend einem kapillären, venösen oder leicht arteriellen Blutfluss) liegt in HUVECs hauptsächlich TPST1 vor. Bei höherer Schubspannung (entsprechend dem venösen und arteriellen Blutfluss) wechselt die Isoform, es wird TPST2 verstärkt exprimiert. Dieser Wechsel der Isoformen induziert durch die Schubspannung ist zusätzlich zeitabhängig. Die Verringerung der TPST1-Expression erfolgt erst nach längerer Applikation des Stimulus. Die Expression von TPST2 in HUVECs wird bereits nach wenigen Stunden erhöht. Es konnte auch gezeigt werden, dass die Regulation der Expression über verschiedene Signalkaskaden innerhalb der Endothelzelle verläuft. So wird die Verringerung der TPST1-Expression durch einen Inhibitor von Tyrosyl Kinasen verhindert. Die Steigerung der Expression von TPST2 bei höheren Schubspannungswerten wird vollständig durch die Zugabe eines Protein Kinase C-Inhibitors unterdrückt. Dieser Isoform-Wechsel der TPSTs in Abhängigkeit vom Blutfluss könnte einen entscheidenden Einfluss auf die posttranslationale Modifikation ihrer Substrate haben, was sich danach wiederum auf die lebensnotwendigen physiologischen Prozesse, in denen diese Substrate involviert sind, auswirkt. Im zweiten Teil der Arbeit sollten beide Isoformen löslich, also ohne Transmembrandomäne, exprimiert werden. In den Hefezellen P. pastoris X-33 wurden beide Isoformen in löslicher Form exprimiert. Es gelang die Anreicherung der Proteine mittels Immobilisierter Metallionen-Affinitätschromatografie (IMAC). In dem in der Literatur beschriebenen Aktivitätsassay für TPSTs zeigten beide Enzyme eine Bindung an PAPS, die auf die native Faltung der Proteine schließen lässt. Zusätzlich konnte nachgewiesen werden, dass die Übertragung des Sulfuryl-Restes vom Donor PAPS auf das Akzeptor-Molekül Hirudin erfolgt. Damit standen am Ende der Arbeit beide hTPSTs löslich und aktiv zur Verfügung.