Identifikation Mitose- und Zytoskelett-modulierender Substanzen mittels vorwärts gerichteter chemischer Genetik

Abstract

Der Zellzyklus sowie die Mitose werden durch ein komplexes Netzwerk von Proteinen reguliert und angetrieben. Fehler in diesen Prozessen können zu einer deregulierten Proliferation und folglich zur Entstehung von Krebszellen führen. Bestandteile des Zytoskeletts sind nicht nur von entscheidender Bedeutung während der Mitose sondern auch in nachfolgenden Prozessen der Krebsentstehung. Chemische Substanzen, die modulierend auf den Zellzyklus, die Mitose und Bestandteile des Zytoskelettes wirken können, sind daher von großem Interesse in der Krebstheraphie. Ein Ziel dieser Arbeit war die Validierung und Bewertung in der Abteilung vorhandener High Content Screens zur Identifikation solcher Substanzen innerhalb Naturstoff-basierter Substanzbibliotheken. Daher wurde in einem Pilotprojekt ein paralleler Screen von 1500 Naturstoffen mittels des MDCK-F3- und des BSC-1 Phänotyp-Screens durchgeführt. Die Identifikation mehrerer bekannter Naturstoffe mit antimitotischer und Zytoskelettmodulierender Wirkung zeigte hierbei eine besondere Eignung des BSC-1 Phänotyp- Screens. Ein weiteres Ziel war die nähere Charakterisierung der biologischen Wirkung von, durch das High Content Screening identifizierten Substanzen. Mit Podoverin A, Maistemonin und Coreanosid F1 konnten mittels des BSC-1 Phänotyp-Screens innerhalb der Naturstoff- Substanzbibliothek unbeschriebene Bioaktivitäten dieser Substanzen erkannt werden. Nachfolgend konnte Podoverin A als antimitotische Substanz mit inhibitorischer Wirkung auf die zelluläre MT-Dynamik charakterisiert werden. Die Naturstoffe Maistemonin und Coreanosid F1 hingegen führten zu Modulationen der zellulären Aktinfilament-Organisation. Maistemonin, Coreanosid F1 und Podoverin A stellen daher interessante Leitstrukturen für die Synthese Naturstoff-basierter Substanzbibliotheken dar. Mittels des BSC-1 Phänotyp-Screens wurde daraufhin eine von Dr. Andrey Antonchick synthetisierte Naturstoff-basierte Substanzbibliothek aus 39 Spirooxindolen getestet. Die potentiell antimitotische Wirkung der hierdurch identifizierten Substanz (-)-6k konnte im weiteren Verlauf bestätigt werden. Neben einer Induktion von G2/M-Zellzyklusarrest führte die Substanz zu einer Inhibition der zellulären MT-Dynamik, wobei insbesondere eine Modulation der räumlichen Organisation des MT-Zytoskelettes auffallend war. Hierbei waren multiple MTOCs in BSC-1 Zellen und analog hierzu eine multipolare Mitose in HeLa-L Zellen erkennbar. Trotz der bekannten, inhibitorischen Wirkung des Spirooxindols Spirotrypostatin auf die αβ-Tubulin-Dynamik war die Wirkung von (-)-6k andersartig. Anhand eines etablierten ELISA Assays konnte außerdem eine für gewisse Spirooxindole typische, inhibitorische Wirkung der Substanz auf die p53/MDM2 Proteininteraktion ausgeschlossen werde. Somit gilt für die Substanz (-)-6k ein vorher unbeschriebenes Wirkprinzip der Spirooxindole als sehr wahrscheinlich. Die Identifikation des Zielproteins bietet einen interessanten Einstieg für weitere Untersuchungen zu dem Wirkstoff (-)-6k. Mittels des High Content Screenings einer, aus 150 THPs bestehenden Substanzbibliothek wurden Tubulexin A, B und C als antimitotische Substanzen identifiziert. Die zelluläre Untersuchung dieser Substanzen zeigte eine Induktion von G2/M-Arrest und Apoptose im niedrig mikromolaren Bereich. Außerdem inhibierten die Substanzen die MTRepolymerisation kältebehandelter BSC-1 Zellen. Die Studien zeigten somit ein gemeinsames Wirkprinzip der Tubulexine. Zur Identifikation des Zielproteins des bioaktivsten Derivates Tubulexin A wurde ein quantitativer, proteomischer Ansatz mittels SILAC basierter komparativer Affinitätschromatographie verwendet. Anhand dieses Ansatzes wurden, unter Berücksichtigung der zellulären Studien, αβ-Tubulin und CAS als potentielle Zielproteine identifiziert. Die Isolation durch die Tubulexin A Affinitätssonde konnte durch Immunodetektion bestätigt werden. Nachfolgend konnte die spezifische und physiologisch relevante Bindung von Tubulexin A an αβ Tubulin durch die inhibitorische Wirkung der Substanz auf die in vitro Tubulin-Polymerisation validiert werden. Dieses Ergebnis verdeutlichte, dass der zelluläre Effekt von Tubulexin A unabhängig von CAS erklärbar ist. Des Weiteren ist gezeigt worden, dass Tubulexin A ein potenter Ligand der Vinca Alkaloid- Bindestelle von αβ Tubulin ist: Unter den gewählten Bedingungen war dessen stöchiometrische Bindung an das Protein mit derer von Vinblastin vergleichbar. Die physiologische Wirkung von Tubulexin A betreffend ist neben einer spezifischen Bindung von αβ-Tubulin ein synergetischer Wirkmechanismus mit dem Protein CAS denkbar. Die Untersuchung eines solchen etwaigen Mechanismus bietet einen attraktiven Ausgangspunkt für weitere Studien. Aufgrund ihrer interessanten Bioaktivität, chemischen Zugänglichkeit, unverminderten Wirkung gegenüber Taxol resistente Zellen und einer möglichen synergetischen Wirkung auf αβ-Tubulin und CAS stellen die Tubulexine interessante Leitmotive für die Synthese Tubulexin-basierter Substanzbibliotheken dar. Es ist wahrscheinlich, dass hierdurch Substanzen mit größerer Potenz und erhöhter Selektivität gegenüber den Zielproteinen erhalten werden können.