Membranlokalisation von Rab-Proteinen durch RabGEFs

Abstract

Insgesamt mehr als 60 humane Rab-Proteine lokalisieren an spezifischen Organellen und regulieren den intrazellulären vesikulären Transport. In der inaktiven GDP-gebundenen Form existieren Rabs im Zytosol im Komplex mit dem Solubilisierungsfaktor GDI, der die C-terminalen hydrophoben Geranylgeranylreste gegen das wässrige Milieu des Zytosols abschirmt, wobei der Prenylanker Voraussetzung für die reversible Membranassoziation von Rab:GTP nach Aktivierung durch ein GEF ist. Rab-Proteine koordinieren als molekulare Schalter die Teilschritte vesikulärer Transportprozesse wie Abschnürung, Transport, Andocken und Fusion des Vesikels. Sowohl die Signalweiterleitung durch spezifische Interaktion mit Effektorproteinen als auch die Aktivierung und Deaktivierung durch GEFs bzw. GAPs ist im mechanistischen Detail bereits sehr gut verstanden. Gegenstand langjähriger Diskussion ist dagegen der zelluläre Mechanismus der spezifischen Lokalisation der 60 unterschiedlichen Rab-Proteine an ihre jeweilige Zielmembran. Neuere Untersuchungen haben mittels biochemischer Verfahren anhand des Legionellenproteins DrrA gezeigt, dass GEFs durch die Rab-Aktivierung GDI aus dem hochaffinen Rab:GDP:GDI-Komplex prinzipiell freisetzen können. Somit ist eine spezifische Membranrekrutierung von Rab-Proteinen durch membranständige GEFs denkbar. Die vorliegende Arbeit untersucht mittels zellbiologischer Ansätze die Rolle von GEFs hinsichtlich der spezifischen Membranlokalisation von Rab-Proteinen und korreliert die erhaltenen Ergebnisse mit biochemischen Analysen. Das endosomale Rab5 und sein GEF Rabex-5 wurden dabei als initiales Modellsystem gewählt. Die artifizielle mitochondriale Fehllokalisation von Rabex-5 bewirkt die spezifische Rekrutierung von Rab5A. Diese Rekrutierung ist sowohl von der Fähigkeit das Substrat Rab5A zu erkennen als auch von der enzymatischen Aktivität des GEFs abhängig. Weiterhin konnte mittels gezielt gewählter Rab5-Mutanten gezeigt werden, dass die GDI-vermittelte Extraktion des Rabs für die anschließende spezifische Lokalisation des Rabs durch das GEF essentiell ist. Zusätzlich führt eine verminderte GEF-Aktivität durch Einführung von Punktmutationen gleichermaßen zu einer Reduktion der GDI-Freisetzungsaktivität und korreliert darüber hinaus mit der verminderten Fähigkeit das Rab-Protein effizient an Organellen zu rekrutieren. Dies verdeutlicht die signifikante Korrelation dieser drei vermeintlich unabhängigen Prozesse. Die Bedeutung von GEFs für die spezifische Rekrutierung von Rabs konnte durch die systematische Ausweitung des experimentellen Systems auf die GEFs DrrA und Rabin8 und ihre Substrate Rab1 bzw. Rab8 zusätzlich untermauert werden. Die zellbiologische und biochemische Analyse der erwähnten GEFs und ihrer Rab-Substrate lässt somit den Schluss zu, dass die GEF-vermittelte Rab-Lokalisation ein genereller Mechanismus zur spezifischen subzellulären Rekrutierung von Rab-Proteinen an eine distinkte Organellenmembran darstellt.