TIRF-anisotropy microscopy: homo-FRET and single molecule measurements

Abstract

Lichtmikroskopie wird durch die Beugung von Licht auf eine Auflösung von etwa der halben Wellenlänge des Lichtes begrenzt. Neuere Methoden der Fluoreszenzmikroskopie umgehen diese Beugungsgrenze, indem die Position einzelner fluoreszierender Moleküle mit einer Genauigkeit bestimmt wird, die weit über der Auflösungsgrenze konventioneller Lichtmikroskopie liegt. Um diese Auflösung zu erreichen, wird eine Bildfolge von fluoreszierenden Molekülen aufgenommen, die zu einem hochauflösenden Mikroskopiebild rekonstruiert wird. Die erhöhte Auflösung kann dann benutzt werden um die räumliche Verteilung von Proteinen in Zellen auf einer Submikrometerskala zu untersuchen. Um die räumliche Organisation von Plasmamembranproteinen zu untersuchen, wurden in der vorliegenden Arbeit Lokalisationsmikroskopie mit Polarisationsmessungen und interner Totalreflexionsmikroskopie (englisch: total internal reflection fluorescence microscopy, TIRF microscopy) kombiniert. Das entwickelte Mikroskop wurde sowohl in Ensemble-Messungen eingesetzt um die Proteinorganisation mittels Förster Resonanz Energietransfer (FRET) auf der Nanometerebene zu untersuchen, als auch in Einzelmolekülmessungen um molekulare Orientierungen zu betrachten. TIRF Mikroskopie wurde mit Fluoreszenzanisotropiemessungen kombiniert um die räumliche Verteilung der kleinen GTPase Ras und ihren aktiven Mutanten zu untersuchen. In Ensemble-Messungen führt FRET zu einer Depolarisation des emittierten Fluoreszenzsignals, so dass Distanzen auf der Nanometerskala untersucht werden können. Es konnte gezeigt werden, dass Anisotropiemessungen sowohl in konventioneller Weitfeldanregung als auch in TIRF-Anregung durch den hohen Hintergrund beeinträchtigt und dadurch Rückschlüsse auf die Proteinorganisation erschwert werden. Anisotropiemessungen wurden auch auf Einzelmolekülebene durchgeführt. Auf Einzelmolekülebene entspricht die Messung der Polarisation einer Messung der zweidimensionalen Orientierung der Moleküle. Stufenweises Bleichen von Molekülen zeigte, dass Polarisationsmessungen die Detektion von homo-FRET in Einzelmolekülmessungen erlauben. Photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM) wurde mit Polarisationsmessungen kombiniert. Der Einfluss der Photoselektion wurde für eine typische Probe untersucht, indem die Polarisation des Anregungslichtes gedreht wurde und die Verteilung der Orientierungen der Moleküle bestimmt wurde. Es konnte gezeigt werden, dass die Polarisation des Anregungslichtes einen Einfluss auf Einzelmolekülmessungen hat. Für eine nichtzufällige Verteilung der Fluorophore kann dieser Einfluss zu falschen Rückschlüssen führen.