Biophysikalische Einblicke in die Wechselwirkungen von lipidierten Signalproteinen mit Membranen und Regulatorproteinen

Abstract

Die Übertragung von extrazellulären Signalen über die Plasmamembran durch die Aktivierung von Rezeptorproteinen sowie nachgeschalteten membranassoziierten und zytosolischen Proteinen stellt einen der wichtigsten Mechanismen für die Regulation biologischer Prozesse dar. Eine zentrale Rolle spielen dabei die lipidierten Src-Kinasen und Ras-Proteine, die das Signal von den aktivierten Rezeptorproteinen verstärken bzw. auf zytosolische Effektorproteine übertragen. Dadurch werden intrazelluläre Signalkaskaden eingeleitet, die unterschiedliche Prozesse in der Zelle steuern. Dies spiegelt jedoch gleichzeitig das onkogene Potential der lipidierten Signalproteine wider, da anormale Signaltransduktionen durch die Überexpression oder eine aktivierende Mutation in diesen Proteinen häufig im Zusammenhang mit Krebserkrankungen stehen. Da die Lokalisation der lipidierten Ras-Proteine und Src-Kinasen an der Plasmamembran essentiell für die Aktivität dieser Signalproteine ist, stellt die Inhibierung von deren Membranassoziation einen potentiellen Therapieansatz dar. Daher ist es von großer Bedeutung, die Interaktionen zwischen den Lipoproteinen und Membranen sowie die Regulation dieser Wechselwirkungen besser zu verstehen. Zu diesem Zweck wurde der Einfluss physiologisch relevanter Faktoren, wie die Membranzusammensetzung und molekulare Chaperone, auf die Bindung und Lokalisation der lipidierten Proteine/Peptide an Membranen unter Verwendung verschiedener mikroskopischer und spektroskopischer Methoden untersucht. Zunächst wurden hierfür mithilfe der Expressed Protein Ligation in Kombination mit einem synthetischen Lipopeptid präparative Mengen des posttranslational modifizierten K-Ras4B-Proteins in hoher Reinheit hergestellt. Die Interaktionsstudien von K-Ras4B mit phosphatidylserinhaltigen Modellmembranen und riesigen Plasmamembranvesikeln haben gezeigt, dass die selektive Lokalisation und charakteristische Clusterbildung von K-Ras4B in der flüssig-ungeordneten Lipiddomäne phasenseparierter Membransysteme weitestgehend unabhängig von der Membranzusammensetzung ist, was auf einen allgemeinen Prozess des membrangebundenen K-Ras4B -Proteins hindeutet. Im Gegensatz dazu wird die laterale Verteilung und Organisation von N-Ras in Membransystemen mit koexistierenden flüssig-geordneten und -ungeordneten Lipidphasen im Wesentlichen durch die Linienspannung an den Phasengrenzflächen, die in natürlichen Membranen klein ist, reguliert. Nach dem Einbau in die flüssig-ungeordnete Phase akkumuliert N-Ras an der Domänengrenze und bildet Cluster in dieser Region, wodurch die energetisch ungünstige Linienspannung reduziert wird. Zudem wurden die Wechselwirkungen zwischen Calmodulin, das an der Dissoziation von K-Ras4B von der Plasmamembran beteiligt ist, und der hypervariablen Region von K-Ras4B untersucht, um neue Einblicke in die strukturellen Änderungen von Calmodulin zu erhalten. Dabei wurde gezeigt, dass sich die zentrale Helix von holo-Calmodulin teilweise entfaltet, was die Bildung eines globulären Komplexes bei der Bindung des farnesylierten und polybasischen Peptids ermöglicht. Darüber hinaus konnte mithilfe von Druck als milder Störparameter die Energielandschaft von Calmodulin unter dem Einfluss von Ca2+ und der hypervariablen Region von K-Ras4B genauer untersucht werden. Dabei konnten sowohl für apo- als auch holo-Calmodulin sowie für den holo-Calmodulin/K-Ras4B-Komplex partiell entfaltete und stärker solvatisierte Konformationssubzustände bei höheren Drücken entdeckt werden, die eine wichtige Rolle bei der Erkennung und Bindung von Liganden sowie Zielproteinen spielen könnten. Zudem wurde gezeigt, dass die Ca2+-Ionen bei höheren Drücke dissoziieren. Des Weiteren konnte durch eine umfangreiche Kinetikstudie ein zweistufiger Membranbindungsprozess für die myristoylierte N-terminale Sequenz von c-Src festgestellt werden. Der erste Bindungsschritt umfasst sowohl die Bildung elektrostatischer Wechselwirkungen zwischen Peptid und Membran sowie die Insertion des Myristoylankers in die Membran. Im Anschluss erfolgen laterale Umlagerungen des Peptids in der Membran, die schließlich in der Bildung von Peptid/Lipid-Clustern resultieren. Der molekulare Chaperon UNC119A konkurriert sowohl bei der Assoziation als auch bei der Dissoziation von Myr-Src mit der Membran, was darauf hindeutet, dass dieser molekulare Chaperon an dem Transfer von c-Src zwischen verschiedenen Membrankompartimenten der Zelle beteiligt ist. Schließlich konnte bestätigt werden, dass Squarunkin A die Wechselwirkung zwischen UNC119A und Myr-Src auch in Gegenwart von Membranen inhibiert. In einer weiteren Studie wurde der Effekt der molekularen Pinzette CLR01, die nicht nur die Bildung von amyloiden Fibrillen inhibiert, sondern auch eine antivirale Wirkung aufweist, auf virale Modellmembranen untersucht. Dabei wurde gezeigt, dass CLR01 durch Bindung an die phosphatidylcholinhaltigen Lipidkopfgruppen in der äußeren Lipiddoppelschicht eine positive Krümmung in der dicht gepackten Lipidphase induziert und in Kombination mit der hohen Linienspannung an der Phasengrenzfläche zur Ausstülpung der flüssig-ungeordneten Domäne führt. In einer viralen Membranhülle mit einer komplexeren Lipid- und Proteinzusammensetzung könnte CLR01 eine vollständige Zerstörung verursachen. Da Druck ein wichtiger physikalischer Parameter für die Untersuchung struktureller und dynamischer Änderungen in biologischen Systemen ist, wurde eine Hochdruckzelle für die Mikroskopie entwickelt, die bei höheren Temperaturen in einem Bereich von 0,1-100 MPa zur Visualisierung von Druckeffekten auf verschiedene biologische Systeme eingesetzt werden kann. Die Funktion dieser Hochdruckzelle wurde durch die beobachtete druckinduzierte Phasenentmischung einer Membran mit bekannter Lipidmischung validiert.