Biological characterization of farnesyl-mediated protein-protein interactions

Abstract

Das prenyl-bindende Protein PDEδ spielt eine wichtige Rolle in der zellulären Verteilung von diversen prenylierten Proteinen. Ein prominenter Bindungspartner ist die kleine GTPase KRas. Eine Punktmutation in diesem Proto-Onkogen ist in ca. 30% aller Tumoren zu finden und führt zu einem unkontrollierten Wachstums- und Differenzierungsprozess der Zellen. Die Behandlung von KRas-abhängigen Tumoren durch gezielte KRas-Inhibierung erweist sich als äußert schwierig, weshalb andere Behandlungsmöglichkeiten benötigt werden. Eine vielversprechende Methode ist die Unterbindung der korrekten, zelluläre Lokalisierung von KRas durch die Inhibition der Interaktion von KRas und PDEδ. Durch die Fehllokalisierung von KRas kommt es zu reduziertem Zellwachstum und Zelltod in KRas-abhängigen Krebszelllinien. Vorangegangene Studien konnten zeigen, dass pikomolare PDEδ-Inhibitoren jedoch nur mikromolare zelluläre Aktivität aufweisen. Diese Aktivitätslücke lässt sich durch einen weiteren, allosterisch-bindenden Interaktionspartner von PDEδ namens Arl2 erklären. Dieser stabilisiert eine inaktive Konformation von PDEδ und erzwingt die Freigabe von Bindungspartnern und Inhibitoren. Um dem entgegenzuwirken und den inhibitorischen Effekt auf PDEδ zu erhöhen, könnte das Konzept des gezielten Proteinabbaus auf die pikomolaren Inhibitoren angewandt werden. Dabei soll durch die Rekrutierung einer E3 Ubiquitin-Ligase eine Ubiquitinierung von PDEδ stattfinden, durch die der Abbau von PDEδ induziert wird. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Inhibitoren basierend auf dem Prinzip des gezielten Proteinabbaus synthetisiert und mittels biophysikalischen und zellbasierten Testsystemen validiert. Zunächst wurden proteindegradierende Substanzen entworfen, um die zelluläre PDEδ-Konzentration zu reduzieren. Dazu wurden ausgehend vom pikomolaren PDEδ-Inhibitor Deltasonamide 1 und dem E3-Ligase-bindenden Pomalidomide PROTACs (engl. proteolysis targeting chimeras) synthetisiert. Pomalidomide rekrutiert Cereblon, eine E3-Ubiquitin-Ligase, die in artifizielle Nähe zu PDEδ gebracht wird und für den Abbau von PDEδ sorgt. Nachdem gezeigt werden konnte, dass die Affinität zu PDEδ nur leicht beeinträchtig ist, wurde der Effekt der Verbindungen auf Zellen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die PDEδ-PROTACs zu reduzierten PDEδ-Mengen von bis zu 84% Reduktion nach 24-stündiger Behandlung führen. Durch simultane Inhibition des Proteasoms während der Behandlung mit dem PDEδ-PROTAC konnte gezeigt werden, dass der Abbau über das Proteasom stattfindet. Nach Behandlung mit den PROTAC-Substanzen konnten auch nanoLuc-PDEδ und mCherry-PDEδ-Fusionskonstrukte erfolgreich abgebaut werden. Die unterschiedlichen Konstrukte ermöglichen einen detaillierteren Einblick in die Dynamiken des PDEδ-Abbaus. Die Selektivität der Substanzen wurde mittels massenspektrometrischer Proteom-Analyse untersucht. Von 4800 quantifizierten Proteinen wurde nur die zelluläre PDEδ-Menge vermindert. Dieses Ergebnis lässt darauf schließen, dass der erhaltene PDEδ-PROTAC sehr selektiv für den Abbau von PDEδ ist. Zusätzlich wurde festgestellt, dass der aktive und inaktive PROTAC, sowie Deltasonamide 1 die zelluläre Menge von Proteinen des Mevalonat-(Cholesterol)-Biosynthesewegs erhöhen. Eine Reactom-Analyse zeigte, dass die Expression von vielen der hochregulierten Proteine von einem SRE-abhängigen (engl. sterol regulatory element) Promotor gesteuert wird. Alle Substanzen stimulierten die SRE-abhängige Expression und erhöhten nicht nur die Proteinmengen der Enzyme, sondern bewirkten auch eine Anhäufung von Metaboliten des Cholesterol-Biosyntheseweges. Vermutlich stören die Substanzen die korrekte Lokalisierung eines prenylierten Bindungspartners von PDEδ und induzieren so diesen Phänotyp. Diese Arbeit zeigt, dass gezielter Proteinabbau ein vielversprechendes Konzept zur Regulierung von Proteinmengen und deren Aktivität ist. Die erhaltenen PDEδ-PROTACs können als molekulare Werkzeuge eingesetzt werden, um zelluläre PDEδ-Mengen zu reduzieren und dessen Dynamik und Funktion weiter aufzuklären. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Bindesstelle und -partner von Spindly, einem Protein, das an der Kinetochor-Organisation beteiligt ist, innerhalb des Rod-ZW10-Zwilch-Komplexes identifiziert. Dazu wurden photoaktivierbare Farnesylanaloga synthetisiert und Spindly artifiziell mit diesen modifiziert. Durch Bestrahlung mit Licht wird eine kovalente Bindung zwischen farnesyliertem Spindly und dem unbekannten Bindungspartner erzeugt, wodurch dieser massenspektrometrisch identifiziert werden kann. Diese Erkenntniss hilft den komplexen Prozess der Chromosomensegregation weiter aufzuklären und zeigt eine neue Klasse von Farnesyl-bindenden Proteinen.