Characterizing mitochondrial signaling networks by quantitative proteomics

Abstract

Die Mitochondrien der Hefe besitzen über 1000 Proteine, von denen mehr als 99% durch nukleäre DNA und nur der Rest durch mitochondriale DNA kodiert wird. Um das Mitochondrium erreichen zu können, ist eine effiziente Protein-Zell-Signalweiterleitung notwendig, um die Moleküle nicht nur an das Organell selbst, sondern auch an eines der vier Subkompartimente des Mitochondriums korrekt zu adressieren. Mitochondriale Protein-Fehlzuordnung ist mit verschiedenen Krankheiten wie Alzheimer und Parkinson assoziiert. Um den Proteintransport in die Mitochondrien besser zu verstehen, wurde ein wichtiger Komplex namens Mitochondrial Processing Peptidase (MPP) gestört, um die proteomische Dynamik unter diesen Bedingungen zu untersuchen. Die MPP ist notwendig, um Proteine fertig zu stellen, die nukleär codiert sind und die innere Membran oder die Matrix der Mitochondrien als Ziel haben. Mit einem funktional eingeschränktem MPP war es möglich, Proteine, die diesem Weg folgen, sicher zuzuordnen und die Lokalisierung dieser Proteine in einem Subkompartiment zu bestimmen. Da auch Phosphorylierungen eine wichtige Rolle bei der zellulären Signalübertragung spielen, wurde das Phosphoproteom untersucht, was mögliche Phosphorylierungsstellen, die am zellulären Wachstum von Hefe beteiligt sind, offenbarte. Mit dem Ziel die (Phospho-)Proteomabdeckung der mitochondrialen Proben [HG-1] zu erhöhen, wurde eine neue Methode der Bottom-up Proteomik entwickelt, da die klassische Methode durch Lücken in der Proteomabdeckung die Möglichkeit reduzierte, dynamische biologische Systeme zu verstehen. Subtilisin wurde aufgrund seiner breiten Schnittstellen-Spezifität als proteolytisches Enzym ausgewählt, was die Wahrscheinlichkeit erhöhte, verborgene Bereiche des (Phospho-)Proteoms zu enthüllen. In der Tat war es mit Subtilisin möglich, die Proteomabdeckung zu erhöhen und Phosphorylierungsstellen zu erreichen, die noch nicht mit herkömmlichen proteolytischen Enzymen abgedeckt waren. Subtilisin wurde weiter untersucht und die Kompatibilität mit Label-Techniken (TMT, iTRAQ und label-free) und In-depth Proteomik-Untersuchungen wurde bestätigt, wobei Subtilisin sich als ein leistungsfähiges Werkzeug erwies, um dynamische Systeme in Mitochondrien und zelluläre Signalweiterleitung besser zu verstehen.