Identification and characterization of small molecules inducing cellular reactive oxygen species accumulation

Abstract

The human cell is constantly confronted with reactive oxygen species (ROS), which are oxygen-containing chemical intermediates readily reacting with different biomolecules. ROS can originate from exogenous sources, but are also produced within cells, e.g. as part of their metabolism. Depending on the concentration, ROS can either act as important signaling molecules or induce oxidative stress, thereby harming cellular components. Thus, cells utilize a multitude of antioxidant mechanisms to maintain redox homeostasis. As ROS play an important role in the development and propagation of cancer, modulation of cellular ROS levels, e.g. via small molecules, may have the potential to induce cancer-selective cytotoxicity. In the course of this thesis, novel fast-acting small-molecule inducers of cellular ROS accumulation were identified by means of phenotypic screening. A counter-screen for glutathione-reactive compounds led to the discovery of 4,5-dihalo-2-methylpyridazin-3-ones and 2,3,4,5(6)-tetrachloro-6(5)-methylpyridines as potent depleters of cellular glutathione. Furthermore, an in-depth characterization of a 2,4-diaminopyrimidine-based compound class was conducted to identify the molecular target and elucidate the mode of action. Structure-activity relationship studies improved both potency and water solubility of the original hit compound and eliminated bioactivities unrelated to its ROS-inducing properties. The optimized compound DP68 was found to strongly elevate cellular superoxide levels without affecting hydrogen peroxide concentrations, indicating an interference with superoxide dismutation. However, an inhibition of the enzymatic activity of superoxide dismutases by DP68 was not observed. Target identification studies of DP68 were conducted, using affinity-based chemical proteomics and different profiling techniques to investigate the compound’s influence on cellular morphology, thermal stability of proteins and the (phospho)proteome. Thereby, DP68 was identified as novel antagonist of the σ1 receptor, which however does not mediate ROS induction. Furthermore, DP68 was found to interact with HEAT repeat-containing proteins, including phosphatidylinositol 3-kinase-related kinases. In addition, DP68 induced a phosphorylation of superoxide dismutase 1, which may influence its cellular localization. DP68 induced cytotoxicity in cancer cell lines and non-malignant primary cells, which may depend on its superoxide-inducing properties.

Die menschliche Zelle gerät dauerhaft mit reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in Kontakt. Dabei handelt es sich um sauerstoffhaltige chemische Intermediate, die spontan mit verschiedensten Biomolekülen reagieren können. ROS können sowohl aus exogenen Quellen stammen, aber auch in Zellen selbst, z.B. als Nebenprodukt ihres Metabolismus, entstehen. Abhängig von ihrer Konzentration können ROS sowohl als Signalmoleküle fungieren, oder oxidativen Stress auslösen und zelluläre Komponenten schädigen. Aus diesem Grund verfügen Zellen zur Erhaltung ihrer Redoxhomöostase über eine Vielzahl antioxidativer Mechanismen. Da ROS auch bei der Entstehung und Ausbreitung von Tumoren wichtige Rollen spielen, könnte ihre Modulation, zum Beispiel durch niedermolekulare Substanzen, das Potential zur Induktion krebsselektiver Zytotoxizität innehaben. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden mithilfe eines phänotypischen Screens neuartige schnellwirksame niedermolekulare Substanzen identifiziert, die die zelluläre ROS-Konzentration erhöhen. Ein weiterer Screen zur Detektion glutathionreaktiver Substanzen führte zur Identifizierung von 4,5-Dihalogen-2-methylpyridazin-3-onen und 2,3,4,5(6)-Tetrachlor-6(5)-methylpyridinen, die eine zelluläre Glutathiondepletion induzieren. Des Weiteren wurden ausführliche Studien einer 2,4-Diaminpyrimidin-basierten Substanzklasse durchgeführt, um das Zielmolekül zu identifizieren und den Wirkmechanismus aufzuklären. Die Untersuchung der Struktur-Aktivitätsbeziehung führte zur Verbesserung der Potenz sowie der Wasserlöslichkeit und zur Eliminierung von Bioaktivitäten, die nicht mit der ROS-induzierenden Eigenschaft in Verbindung stehen. Untersuchungen der optimierten Substanz DP68, zeigte eine starke Erhöhung zellulärer Superoxidlevel ohne Änderung der Wasserstoffperoxidkonzentration, welches darauf hinweist, dass die Substanz mit der Superoxiddismutation interferieren könnte. Eine Inhibition der enzymatischen Aktivität von Superoxiddismutasen durch DP68 wurde jedoch nicht festgestellt. Zur Identifizierung der molekularen Zielstruktur von DP68 wurden Studien mittels affinitätsbasierter chemischer Proteomik und verschiedener Profilingtechniken, die den Einfluss der Substanz auf die zelluläre Morphologie, die thermische Stabilität von Proteinen und das (Phospho)proteom untersuchen, durchgeführt. Dabei wurde DP68 als neuartiger Antagonist des σ1-Rezeptors identifiziert, jedoch steht diese Interaktion nicht mit der ROS-Induktion in Verbindung. Desweiteren interagiert DP68 mit verschiedenen Proteinen, die „HEAT repeat“-Strukturmotive enthalten, z.B. mit Kinasen der „Phosphatidylinositol 3-kinase-related kinase“-Familie. Zusätzlich wurde die eine Phosphorylierung der Superoxiddismutase 1 nach Behandlung mit DP68 festgestellt, welches einen Einfluss auf dessen zelluläre Lokalisation haben könnte. DP68 induzierte Zytotoxizität sowohl in Krebszelllinien, als auch in nicht-malignen Primärzellen, welche auf seiner superoxidinduzierenden Eigenschaft beruhen könnte.