Molecular insights into Bacillus anthracis anthrax lethal complex

Abstract

Bacillus anthracis secretes the major virulent factor anthrax complex toxin, which is responsible for high mortality in mammals. This tripartite complex comprises three soluble proteins: the protective antigen (PA) and two enzymes, the lethal factor (LF) and edema factor (EF). After proteolytic activation by host proteases, PA oligomerizes into octamers and/or heptamers on the cell surface and the LF as well as EF bind competitively to the pre-pore oligomer surface. After a receptor-mediated endocytosis, the pre-pore complex rearranges in a narrow pore channel that delivers the two unfolded enzymes into the cytosol. There, the LF and EF lead to the inactivation of the mitogen-activated protein kinases (MAPKKs) and the dysregulation of the level of cellular cAMP, respectively. So far, only fragmented information about the heptameric PA in complex with LF are available. Particularly, complex organization and subunits interaction, remain unclear. In this work, I apply cryo-electron microscopy (cryo-EM) to solve the structure of the fully loaded complex of PA with LF (PA7LF3) in the pre-pore conformation. Our data demonstrate features of LF molecules assembling in the PA7LF3 complex, showing for the first time three different complex combinations, namely PA7LF2+1A PA7LF2+1A’ and PA7LF2+1B. These complexes vary on the 3D LF organization on the PA. Our structural analysis defines LF-LF and PA-LF interactions revealing a new potential interaction interface at the C-terminus of LFs. Finally, we demonstrate an intermediate conformation of LF which was not previously predicted. These results show for the first time that the PA7LF3 can generate three different complex states. This work adds another milestone on the intricated mechanism of the anthrax complex translocation, which culminates in the release of LF and EF into the host cytoplasm.

Das Bakterium Bacillus anthracis sorgt durch die Sekretierung seines Toxins, dem Anthrax Komplex, der den Hauptteil des virulenten Faktors ausmacht, für eine hohe Mortaliät in allen Säugern. Dabei besteht der Komplex aus den folgenden drei löslichen Proteinen: dem schützenden Antigen (protective antigen, PA) sowie zwei Enzymen, dem letalen Faktor (lethal factor, LF) und dem Edema Faktor (edema factor, EF). Nach einer proteolytischen Aktivierung des Komplexes von Wirtsproteasen oligomerisiert das PA an der Zelloberfläche zu Octameren und/oder Heptameren. Dabei binden der LF sowie der EF kompetitiv an die Zelloberfläche und bilden so einen Prä-Porzustand. Die Bindung zu einem Rezeptor initiiert weiter die Endozytose, nach welcher der Prä- Porzustand zu einem schmalen Porenkanal umgelagert wird und die beiden ungefalteten Enzyme in das Zytosol gelassen werden. Nach der Rückfaltung der Enzyme in deren nativen und enzymatisch aktiven Zustand im Zytosol sorgt der LF für die Inaktivierung der mitogen-activierenden Protein Kinasen (MAPKKs) und der EF zu einem unregelmäßigen Level an zellulärem cAMP. Bis Heute gibt es nur limitierende Informationen zu dem kompletten PA7 Komplex mit dem LF (PA7LF3), wobei insbesondere die Komplexformierung sowie die intramolekularen Interaktionen der einzelnen Untereinheiten noch unklar sind. In dieser Arbeit habe ich mithilfe der Kryo-Elektronenmikroskopie (cryo-EM) die Struktur des gesamten Komplexes im Prä-Porenzustand bestehend aus PA und LF (PA7LF3) gelöst, wodurch die intermolekularen Interaktionen zwischen LF-LF sowie LF-PA näher untersucht werden konnten und noch unbekannte Komplexformierungen beobachtet werden konnten. Hier konnten insgesamt drei neue Kombinationsmöglichkeiten des Komplexes beobachtet werden: PA7LF(2+1A), PA7LF(2+1A’) und PA7LF(2+1B). Die Strukturanalyse dieser neuen Komplexformierungen zeigten zudem noch unbekannte Konformationen von LF im gebunden Zustand des heptameren PA, die entlang der gesamten Kette Interaktionen aufzeigte. Zudem wies ausschließlich eine der drei LF Moleküle in dem PA α-clamp-gebunden Zustand die offene Konformation auf, in der eine erweiterete Flexibilität der C-terminalen Domäne beobachtet wurde. Die beiden anderen LFs hingegen, zeigen eine neue Konformation und befinden sich in einem sogenannten Intermediären Zustand zwischen der Toxinassemblierung und der Translokation. Durch die Präsenz beider Konformationszustände der LFs in dem PA7LF3 Komplex kann von einem neuen Modell der Translokation ausgegangen werden, in dem die LFs in Abhängigkeit ihrer Konformation durch den PA7 Kanal in die Wrtszelle transloziert werden.