Kinetischer Mechanismus der menschlichen Thymidylatkinase

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde menschliche Thymidylatkinase (TmpK) vollständig kinetisch charakterisiert. TmpK spielt sowohl bei der Therapie der HIV-Infektion als auch im Kampf gegen Krebs eine herausragende Rolle als Zielenzym für antivirale und cytostatische Medikamente. Die Aufmerksamkeit wurde speziell auf den kinetischen Mechanismus der Aktivierung des antiviralen Agens 3'-Azido-2',3'-dideoxy-thymidinmonophosphat (AZTMP), dem monophosphorylierten Analog des bestbekannten Anti-HIV-Medikaments 3'-Azido-2',3'-dideoxythymidin (AZT, Zidovudin, Retrovir), und des natürlichen Substrats 2'-Deoxythymidinmonophosphat (dTMP), dem Vorläufer des für die DNA-Synthese essentiellen 2'-Deoxythymidintriphosphats (dTTP), durch humane wt-TmpK gerichtet. Daneben wurde der kinetische Mechanismus von zwei Mutanten humaner TmpK (hsTmpKR200A/F105Y und hsTmpKR200A/R16G/145-148 E. coli lid), die AZTMP besser aktivieren als der Wildtyp, untersucht. Die kinetischen Daten konnten auf der Grundlage eines für NMP-Kinasen akzeptierten minimalen Reaktionsschemas mit durch einen induced fit Mechanismus hervorgerufenen offenen und geschlossenen Konformationen interpretiert werden. Der Vergleich des kinetischen Mechanismus von humaner wt-TmpK mit dTMP und AZTMP ergab, daß der Grund für die schlechte Aktivierung von AZTMP in diesem induced fit Mechanismus zu suchen ist. Die Geschwindigkeit der für das Erreichen des geschlossenen aktiven Enzymzustands notwendigen Konformationsänderung ist bei der Umsetzung von AZTMP im Vergleich zu dTMP 1000-fach reduziert. Diese Konformationsänderungen konnten durch die eingeführten Mutationen wesentlich beschleunigt werden. In diesem Zusammenhang erlaubten quenched-flow Experimente in Vebindung mit steady-state Experimenten die erstmalige präzise Bestimmung der Geschwindigkeiten von Konformationsänderungen bei einer NMP-Kinase. Neben enzymdynamischen Ergebnissen konnten auch statische Gleichgewichtsdaten über die Nukleotidbindungseigenschaften von TmpK mit Hilfe kalorimetrischer (isotherme Titrationskalorimetrie, ITC) und fluoreszenzspektroskopischer Methoden erhalten werden. Für die fluoreszenzspektroskopische Bestimmung von Dissoziationskonstanten wurde neben dem bekannten fluoreszierenden Bisubstratanalog P1-(5'-Thymidyl)-P5-(5'-adenosyl-(2'-3'-N-methylanthraniloyl))pentaphosphat (TP5A-mant) für die Untersuchung der ATP/ADP-Bindestelle von TmpK das in dieser Arbeit entwickelte und synthetisierte neue Fluorophor P(ß)-(N'-Methylanthraniloylaminohexyl)-aminothymidin-5'-diphosphat (P(ß)-MAHA-TDP) verwendet. Damit war erstmalig fluoreszenzspektroskopisch die Bestimmung von Dissoziationskonstanten für Substrate der NMP/NDP-Bindestelle möglich. Ferner konnten mit Hilfe dieser Fluorophore auch die Assoziations- und Dissoziationsratenkonstanten für binäre Enzym-Nukleotid-Komplexe ermittelt werden. In Verbindung mit den Bindungsdaten für die ternären Komplexe (Michaelis-Konstanten) ergab sich für die Umsetzung von dTMP durch humane wt-TmpK eine positive und für AZTMP eine negative Kooperativität. Neben diesen detaillierten Studien an humaner TmpK konnten als Vergleich auch steady-state kinetische Parameter (KM und kcat-Werte) der partiell aktivierten Monophosphate von 3'-Fluoro-2',3'-dideoxythymidin (FLT, Alovudin) und 2',3'-Dideoxy-2',3'-didehydrothymidin (d4T, Stavudin) mit Thymidylatkinasen aus E. coli, S. cerevisae und Maus bestimmt werden.