Wechselwirkungen zwischen Adenylierungs- und Peptidyl Carrier Protein-Domänen in nicht-ribosomalen Peptidsynthetasen sowie biochemische und strukturelle Untersuchungen zu gespaltenen Inteinen
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2010-09-07
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Die aktuelle Antibiotikaforschung basiert trotz großer Fortschritte auf dem Gebiet der
kombinatorischen, organischen Synthese immer noch zu einem großen Teil auf
Naturstoffbibliotheken bakteriellen oder pilzlichen Ursprungs. Innerhalb dieser Naturstoffe
sind nichtribosomale Peptide (NRPs) eine enorm wichtige bioaktive Substanzklasse. Neben
antibiotischen Eigenschaften können sie weiterhin immunsuppressive, antifungale und
tumorunterdrückende Aktivität entfalten. NRPs werden von Multi-Domänen Proteinen den so
genannten nichtribosomalen Peptidsynthetasen (NRPS) in einer Art Fließbandmechanismus
aufgebaut. Zwar sind die individuellen NRPS-Domänen biochemisch und strukturell sehr gut
untersucht, jedoch sind die für das detaillierte Verständnis der Naturstoffbiosynthese
essentiellen Wechselwirkungen zwischen den einzelnen Domänen sowohl strukturell, als auch
mechanistisch noch kaum verstanden.
In dieser Arbeit gelang der erste experimentelle Nachweis von Interaktionen zwischen
einer Adenylierungs- mit einer in cis vorliegenden Peptidyl Carrier Protein-Domäne aus
einem NRPS Initiationsmodul. Mit biochemischen Methoden, wie partiellen tryptischen
Verdauen, Gelfiltrationschromatographie und chemischen Markierungsassays, wurde
festgestellt, dass der 4’-Phosphopantetheinarm der PCP-Domäne sich in unterschiedlichen
Positionen während des Katalysezyklus befindet und zwar abhängig vom Zustand der
Adenylierungs-Domäne. Die produktive Wechselwirkung zwischen den beiden Domänen
benötigt sowohl eine post-translational modifizierte holo-Peptidyl Carrier Protein-Domäne,
als auch eine spezielle Konformation der Adenylierungs-Domäne, die Thioesterkonformation.
Die hier durchgeführten Studien charakterisieren erstmalig die großen konformationellen
Bewegungen in NRPS-Proteinen und sollten den Startpunkt für ein tiefgreifendes Verständnis
des antibiotika-produzierenden Proteintemplats bilden.
Für die Untersuchung von Proteinstrukturen und -dynamiken mit spektroskopischen
Methoden, wie der NMR- oder der Fluoreszenzspektroskopie, ist die Modifikation des zu
untersuchenden Proteins mit biophysikalischen Sonden oft unvermeidlich. Für den gezielten
Einbau dieser Sonden in Proteine sind, unter anderem, gespaltene Inteine ein wichtiges
Werkzeug der Chemischen Biologie. Die von gespaltenen Inteinen vermittelte Protein trans-
Spleißreaktion verbindet die N- und C-terminal zu den individuellen Inteinhälften
vorliegenden Polypeptidsequenzen, die N- und C-Exteine, über eine native Peptidbindung und
erlaubt damit den definierten Aufbau eines Proteins aus mehreren Segmenten.
Mit dem natürlich gespaltenen DnaE Intein aus Nostoc punctiforme (Npu) wurde in dieser
Arbeit das bisher schnellste trans-spleißende Intein biochemisch mit gereinigten Proteinen
charakterisiert. Neben der hohen monomolekularen Reaktionsrate von 1,1 ± 0,2 s-1 bei 37°C
zeigte es mit verschiedenen Exteinsequenzen robuste Spleißausbeuten von 50 - 90% in dem
Temperaturbereich von 6 bis 37°C. Als ein Grund für verminderte Spleißausbeuten konnte die
Bildung von löslichen Aggregaten der individuellen Inteinhälften nachgewiesen werden.
NMR-Untersuchungen ergaben, dass sowohl die natürlich gespaltenen individuellen Hälften
des Npu DnaE Inteins, als auch die des künstlich gespaltenen Synechocystis species PCC6803
DnaB Inteins keine definierte Faltung ohne das Partnerprotein aufwiesen. Für erstere konnte
bei Komplexbildung der Hälften und nach der Spleißreaktion der Übergang in eine gefaltete
Konformation nachgewiesen werden. Zusätzlich wurde mit dem SPLICEFINDER-System
eine Methode entwickelt, die es schnell und unkompliziert erlaubt parallel mehrere
Insertionspositionen von gespaltenen Inteinen in Zielproteinen auf ihre Spleißaktivität zu
überprüfen. Für eine Anwendung dieses Systems, der segmentellen Isotopenmarkierung von
Proteinen für NMR-Untersuchungen, konnte ein einfaches Verfahren zur Bestimmung der
Markierungseffizienz etabliert werden. Es ist anzunehmen, dass die in dieser Arbeit
durchgeführten Studien zu gespaltenen Inteinen deren Einsatzbreite für die selektive
Modifikation von Proteinen signifikant erhöhen werden.
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Table of contents
Keywords
Domäneninteraktion, NRPS, Antibiotikaforschung, A-Domäneninhibitoren, ungefaltete proteine, gespaltene Inteine