Brandherm, Sven2024-08-022024-08-022024http://hdl.handle.net/2003/4263410.17877/DE290R-24470Die Ser/Thr-Kinase Akt (Proteinkinase B) ist ein zentraler Regulator im PI3K/Akt/mTOR-Signalnetzwerk, der am häufigsten aktivierten Signalkaskade bei malignen humanen Erkrankungen. Die durch Akt vermittelte Signaltransduktion stellt einen wesentlichen Bestandteil grundlegender physiologischer Prozesse dar, zu denen Zellproliferation, Überleben, Stoffwechsel und Proteinbiosynthese zählen. Veränderungen in den Akt-regulierenden Proteinen wie PI3K und PTEN können zu einer Akt-Hyperaktivität führen und die Genese verschiedene Krankheiten begünstigt, darunter Brust-, Eierstock-, Darm- und Prostatakrebs, Diabetes sowie neurodegenerative Erkrankungen. Ebenso können diese bösartigen Erkrankungen mit der Überexpression der AKT-Gene oder der seltenen Akt1E17K-Mutation in assoziiert werden, welche zu einer konstitutiven Aktivierung des Enzyms führt. In diesem Kontext wurde Akt als ein vielversprechendes Ziel für die Präzisionsmedizin identifiziert. Obwohl die Entwicklung von Akt-Inhibitoren mehr als zwei Jahrzehnte andauert, hat lediglich der ATP-kompetitive Inhibitor Capivasertib in einer Phase III Studie als Ergänzung zu einer Fulvestrant-basierten Therapie bei fortgeschrittenem Brustkrebs vielversprechende Ergebnisse gezeigt und ist bislang der einzige Akt-Inhibitor, der eine Zulassung durch die FDA erhielt. Neben orthosterischen Akt-Inhibitoren wurden auch allosterische Liganden entwickelt, die an der Schnittstelle zwischen der regulatorischen PH-Domäne und der katalytischen Kinasedomäne mit einer einzigartig Bindungstasche interagieren und so eine hochselektive Inhibition von Akt ermöglichen. Allerdings sind alle klinischen Studien im onkologischen Kontext mit allosterischen Akt-Inhibitoren bislang gescheitert, hauptsächlich aufgrund unzureichender Wirksamkeit oder dosislimitierender Toxizität. Um die inhärenten Beschränkungen der ersten Generation von Akt-Inhibitoren zu überwinden, hat die AG RAUH eine innovative Strategie für die gezielte Adressierung von Akt durch kovalent-allosterische Akt-Inhibitoren (CAAIs) entwickelt. Diese Kategorie von Inhibitoren ist so konzipiert, dass sie die einzigartige allosterische Bindungstasche in Akt adressiert und dadurch eine außergewöhnliche Aktivität und Selektivität gewährleistet. Darüber hinaus alkylieren CAAIs Cysteinseitenketten in der Aktivierungsschleife von Akt, wodurch die Verweildauer am Zielprotein maximiert und somit die pharmakodynamische Wirkung verstärkt wird. Die pharmakokinetische Evaluation des Prototypen-CAAIs Borussertib ergab jedoch ein optimierungsbedürftiges Profil, das durch eine unzureichende Löslichkeit und Permeabilität und damit eine eingeschränkte Bioverfügbarkeit beschrieben werden kann. Diese Arbeit beschreibt das Struktur-basierte Design, die Synthese und die umfassende Charakterisierung neuartiger, kovalent-allosterischer Akt-Inhibitoren und Sondenmoleküle. Die Analyse verfügbarer Co-Kristallstrukturen der in der AG RAUH entwickelten CAAIs sowie von Bindungsmodellen, die auf literaturbekannten allosterischen Akt-Inhibitoren basieren, führte zur Konzeption neuartiger potentiell kovalent-allosterischer Akt-Inhibitoren. Infolgedessen wurde eine konvergente Synthesestrategie entwickelt, die es ermöglichte, potentielle CAAIs auf der Grundlage eines westlichen Molekülbausteins, der von einem Pharmakophor mit gemeinsamen Merkmalen aus literaturbeschriebenen allosterischen Akt-Inhibitoren abgeleitet wurde, und eines östlichen Molekülbausteins, der bereits für den Prototyp Borussertib entwickelt wurde, darzustellen. Die Syntheseroute ermöglichte die Derivatisierung der Verbindungen in einem späten Schritt, was zur erfolgreichen Synthese von insgesamt 24 Derivaten führte. Das Ziel der ersten Serie neuartiger CAAIs bestand darin, geeignete Substitutionsmuster zu identifizieren, die sich durch eine gute in vitro Potenz sowie verbesserte PK-Eigenschaften auszeichnen. Alle getesteten Verbindungen zeigten während der biochemischen Charakterisierung ein bemerkenswertes Inhibitionspotential gegenüber den drei Akt-Isoformen, was auf einen kovalenten Bindungsmodus hindeutet, der anschließend durch kinetische und massenspektrometrische Experimente bestätigt werden konnte. Zelluläre Untersuchungen ausgewählter Verbindungen ergaben eine konzentrationsabhängige Herunterregulation von pAkt1 und pAkt2 sowie deren nachgestellten Substraten, die bereits bei geringeren Konzentrationen im Vergleich zu klinischen Kandidaten beobachtet wurden. Im Zuge der pharmakokinetischen Charakterisierung zeigte sich, dass acht der neu entwickelten CAAIs im Caco-2-Assay eine signifikant geringere Effluxrate im Vergleich zum Prototyp Borussertib und somit eine verbesserte intestinale Permeabilität aufwiesen. Für den Großteil der neuen Verbindungen konnte eine exzellente Stabilität in Anwesenheit von murinen Lebermikrosomen sowie eine hinreichend gute Stabilität in Gegenwart von Glutathion nachgewiesen werden. In Anbetracht des überdurchschnittlich hohen Molekulargewichts und der Lipophilie der Verbindungen führten die Analysen der Löslichkeit jedoch lediglich zu moderaten Resultaten. Mit der erfolgreichen Strukturaufklärung wurde der Grundstein für einen zweiten Zyklus des SBDD gelegt. Basierend auf den elf neuen Co-Kristallstrukturen wurden weitere Derivate konzipiert und synthetisiert. Hier führte das Bestreben zum Design einer verbesserten Serie von CAAIs, wobei der Schwerpunkt auf der Optimierung der Pharmakokinetik und der Ligandeneffizienz lag. Insgesamt wurden 30 Derivate synthetisiert, die sich durch ihr meta-Substitutionsmuster im westlichen Molekülteil, sowie durch Variationen der östlichen Molekülbausteine und des reaktiven warhead unterscheiden. Die biochemische Evaluation ergab für Verbindungen mit konventionellem Acrylamid-warhead eine Präferenz für die Inhibition von Akt1 und Akt2 gegenüber Akt3. Im Gegensatz dazu zeigten Verbindungen mit 2-Fluoracrylamid-Warhead eine höhere Selektivität für Akt1 gegenüber Akt2 und Akt3. In zellulären Untersuchungen erreichten zwei der neuen CAAIs eine subnanomolare Hemmung der Brustkrebszelllinie ZR-75-1, was den ersten Fall einer derart hohen anti-proliferativen Aktivität aller bisher entwickelten CAAIs darstellt. Detaillierte Western-Blot-Analysen einer ausgewählten Serie von Verbindungen zeigten eine konzentrationsabhängige Herunterregulierung von pAkt1, pAkt2 und deren nachgeschalteter Substrate bei geringeren Konzentrationen im Vergleich zu den klinischen Kandidaten Capivasertib und Miransertib. Eine schlüssige in vitro PK-Studie offenbarte eine akzeptable kinetische Löslichkeit für 13 der 28 getesteten Derivate, wobei Liganden mit α-fluorierten Acrylamiden die vielversprechendsten Ergebnisse lieferten. Die Mehrzahl der CAAIs wies eine murine Plasmastabilität von > 90% auf, wobei fünf Inhibitoren eine geringe intrinsische clearance und eine außergewöhnliche Resistenz gegenüber konjugierenden Enzymen des Phase II-Metabolismus zeigten. Der abschließende Caco-2-Assay indizierte für neun der getesteten CAAIs eine orale Bioverfügbarkeit. Schließlich wurde der frontrunner der neuen Serie einem direkten Vergleich mit klinisch fortgeschrittenen Inhibitoren in einem Brustkrebszellpanel unterzogen, das aus 29 genetisch-annotierten Brustkrebszelllinien bestand. Diese Analyse offenbarte die herausragende Wirksamkeit und Überlegenheit des getesteten CAAI, die auf dem kovalent-allosterischen Wirkmechanismus beruhen. In einer abschließenden Strukturanalyse wurden fünf der neuartigen Inhibitoren mit Akt1 Co-kristallisiert, wobei bisher unbekannte Wechselwirkungen zwischen den Liganden und dem Protein identifiziert werden konnten. In einem weiteren Projekt wurde während der Strukturaufklärung der neuartigen CAAIs eine weitere Disulfidbrücke in der PH-Domäne von Akt1 identifiziert. Die Tatsache, dass es sich bei diesen Cysteinen um redox-sensitive Aminosäuren handelt, die möglicherweise für die Aktivierung von Akt essentiell sind, bildete die Grundlage für die Entwicklung von neuartigen Liganden auf Basis der zuvor dargestellten westlichen Molekülbausteine.Das rationale Design führte zur Synthese eines fokussierten Sets von neun Verbindungen, von denen drei mit einem reaktiven Acrylamid-warhead ausgestattet waren, um die Cysteinseitenketten der PH-Domäne zu adressieren. Die biochemische Charakterisierung dieser potentiell kovalent-allosterischen Akt-Inhibitoren zeigten eine signifikante Steigerung der Potenz gegenüber den drei Akt-Isoformen verglichen mit ihren reversiblen Gegenstücken. Auf zellulärer Ebene resultierte dies in EC50-Werten im niedrigen nanomolaren Bereich. In einer umfassenden Western-Blot-Analyse konnte die konzentrationsabhängige Herunterregulierung von pAkt1 und pAkt2 sowie der Akt-nachgeschalteten Substraten demonstriert werden. Abschließende Strukturaufklärungen bestätigten den antizipierten kovalent-allosterischen Wirkmechanismus und die irreversible Alkylierung einer Cysteinseitenkette in der PH-Domäne von Akt1. Zusätzlich erlaubte die Verwendung eines Akt2-Mimikrykonstrukts einen einzigartigen Einblick in die allosterische Interdomänen-Bindungstasche von Akt2. Im weiteren Verlauf dieser Arbeit wurden auf Grundlage der zuvor entwickelten CAAIs drei Biotin-konjugierte Sondenmoleküle entworfen und synthetisiert, welche die Grundlage zur Etablierung eines Akt-gerichteten target occupancy Assays bilden. In initialen zellulären Studien konnte trotz des hohen Molekulargewichts der Sonden, die Zellgängigkeit demonstriert werden. Zur Validierung der Funktion als selektive Sonden für Akt wurde schließlich eine Reihe von immunologischen Western-Blot-Analysen durchgeführt. Durch Inkubation sowohl von Zelllysaten als auch von lebenden Zellen in Gegenwart dieser Sondenmoleküle konnte die konzentrationsabhängige und selektive Markierung von Akt durch die dargestellten Sondenmoleküle nachgewiesen werden. Ebenso konnte in kompetitiven Ansätzen mit allosterischen und kovalent-allosterischen Akt-Inhibitoren eine konzentrationsabhängige Verdrängung der Referenzverbindungen beobachtet werden.deWirkstoffdesignMedizinische ChemieChemische BiologieKovolante KinaseinhibitorenProteinkinase BAKTStruktur-basiertes Design570540PhDThesisWirkstoffPharmazeutische ChemieKinasen