Kinetische und funktionelle Studien am molekularen Chaperon ClpB aus Thermus thermophilus - Schlee, Sandra (Universität Dortmund, 2003)
Das molekulare Chaperon ClpB aus T. thermophilus gehört zu der AAA+-Familie derATPasen, die konservierte Nukleotidbindungsdomänen enthalten und ringförmige Oligomerebilden. Die Aufgabe von ClpB in der Zelle ist es, in funktioneller Kooperation mit demDnaK-System Proteinaggregate aufzulösen und zu reaktivieren.Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle der beiden Nukleotidbindungsdomänen (NBD) von ClpBfür die Chaperonaktivität, Oligomerisierung, Nukleotidbindung und ATPase-Aktivität zucharakterisieren. Wie Gelfiltrationsanalysen zeigen unterliegt ClpB einem dynamischenOligomerisierungsgleichgewicht, welches durch das gebundene Nukleotid und dieIonenstärke beeinflusst wird. Fluoreszenztitrationen mit dem fluoreszierendenNukleotidanalogon mant-ADP belegen, dass die Bindungsaffinität der hochaffinen NBD2stark vom oligomeren Zustand von ClpB abhängig ist. Auch die Analyse der ATPase-Aktivität deutet auf Kooperativität zwischen den beiden NBDs hin. Mit Hilfe von Stopped-Flow-Messungen mit mant-ADP und Fluoreszenzanisotropiemessungen mit AlexamarkiertemClpB wurde ein Bindungsmodell entwickelt, welches die welchselseitigeAbhängigkeit von Oligomerisierung und Nukleotidbindung beschreibt.Studien mit Modellsubstraten Luziferase und a-Glucosidase belegen außerdem, dass ClpBdirekt mit aggregierten Proteinen wechselwirkt. Die Isolation eines spezifischen ClpB-DnaKKomplexesin Ko-Elutionsexperimenten weist darauf hin, dass ClpB und DnaK einenKomplex bilden und in einer konzertierten Aktion auf aggregierte Substratproteine einwirken.
Keywords: Chaperone; Kinetik; Fluoreszenz; Nukleotidbindung; Stopped-Flow; 540