Engelhard, Lena2025-12-042025-12-042025http://hdl.handle.net/2003/4441710.17877/DE290R-26185The epigenetic cytosine modifications 5-methylcytosine (mC) and 5-hydroxymethylcytosine (hmC) are key regulatory elements of mammalian genomes, occurring within CpG dinucleotides in either strand- symmetric or strand-asymmetric combinations. While reader proteins for symmetrically and hemi- modified CpG dyads have been identified, the recognition of asymmetrically modified CpGs and the potential regulatory implications of their symmetry remain unexplored. In this work, mammalian nu- clear proteins binding to hmC-containing CpG dyads were identified and characterized. A protocol for generating asymmetrically modified DNA probes was established and applied in pull-down assays coupled with mass spectrometry-based proteomics. Comparative enrichment studies were performed using promoter probes bearing symmetric or asymmetric C, mC, and hmC modifications, allowing for direct assessment of reader profiles in the same sequence, tissue and experimental contexts. In hu- man and mouse nuclear extracts, numerous tissue-specific readers of hmC-modified sequences were identified, falling into distinct, probe-specific subgroups. These include transcription factors and chro- matin regulators such as MYC and MAX, which read hmC in a sequence-dependent manner, and RFX5, which selectively discriminated between hmC symmetry states in CpG dyads. The presumably preva- lent asymmetric CpG dyad hmC/mC exhibited a distinct reader protein profile, supporting the hy- pothesis that hmC symmetry information provides unique regulatory outputs. To complement these proteomics analyses, selective enrichment and sequencing of native double-stranded DNA fragments containing hmC/mC CpG dyads was implemented, based on an evolved methyl-CpG-binding domain protein with enhanced binding specificity. This approach enabled genome-wide mapping of hmC/mC sites, offering a valuable tool for investigating their roles in chromatin biology. Together, these find- ings provide a comprehensive framework for the study of symmetric and asymmetric hmC-containing CpG dyads and lay the groundwork for elucidating their functional contributions to transcriptional regulation, development and disease.Die epigenetischen Cytosin-Modifikationen 5-Methylcytosin (mC) und 5-Hydroxymethylcytosin (hmC) sind wichtige regulatorische Elemente des Säugergenoms und kommen innerhalb von CpG-Dinukleo- tiden entweder in strangsymmetrischen oder strangasymmetrischen Kombinationen vor. Während Le- serproteine für symmetrisch- und halb-modifizierte CpG-Dyaden identifiziert wurden, sind die Erken- nung asymmetrisch-modifizierter CpGs und damit die potenziellen regulatorischen Auswirkungen ih- rer Symmetrie noch unerforscht. In dieser Arbeit wurden nukleare Säugetierproteine identifiziert und charakterisiert, die an hmC-haltige CpG-Dyaden binden. Es wurde ein Protokoll zur Erzeugung asym- metrisch modifizierter DNA-Sonden erstellt, welches in Pull-down-Analysen in Verbindung mit mas- senspektrometriebasierter Proteomik angewendet wurde. Vergleichende Anreicherungsstudien wur- den mit Promotor-Sonden durchgeführt, die symmetrische oder asymmetrische C-, mC- und hmC- Modifikationen aufwiesen, wodurch eine direkte Bewertung der Leserprofile in derselben Sequenz, demselben Gewebe und denselben experimentellen Kontexten möglich war. In nuklearen Extrakten von Mensch- und Mausgeweben wurden zahlreiche gewebespezifische Leser von hmC-modifizierten Sequenzen identifiziert, die in unterschiedliche, sondenspezifische Untergruppen fallen. Dazu gehören Transkriptionsfaktoren und Chromatin-Regulatoren wie MYC und MAX, die hmC sequenzabhängig le- sen, sowie RFX5, das selektiv zwischen hmC-Symmetriezuständen in CpG-Dyaden unterscheidet. Die vermutlich vorherrschende asymmetrische CpG-Dyade hmC/mC wies ein inividuelles Leserprotein- profil auf, was die Hypothese stützt, dass die Symmetrieinformation von hmC einzigartige regulatori- sche Ergebnisse zur Folge hat. Zur Ergänzung dieser Proteomanalysen wurde eine selektive Anreiche- rung und Sequenzierung von nativen doppelsträngigen DNA-Fragmenten, die hmC/mC-CpG-Dyaden enthalten, durchgeführt, basierend auf einem weiterentwickelten Methyl-CpG-bindenden Domänen- protein mit verbesserter Bindungsspezifität. Dieser Ansatz ermöglichte eine genomweite Kartierung von hmC/mC-Stellen und bietet ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung ihrer Rolle in der Chro- matinbiologie. Zusammen bieten diese Ergebnisse einen umfassenden Rahmen für die Untersuchung symmetrischer und asymmetrischer hmC-haltiger CpG-Dyaden und legen den Grundstein für die Auf- klärung ihrer funktionellen Beiträge zur Transkriptionsregulation, Entwicklung und Krankheit.enEpigeneticsChromatinChemical biology570540PhDThesisEpigenetikChemische Biologie