Structural and functional insights into the initial steps of phenazine biosynthesis - Li, Qi-Ang (Technische Universität Dortmund, 2011)
Eine relativ große Zahl von Bakterienstämmen produziert und sezerniert Derivate von stickstoffhaltigen aromatischen Metaboliten der Phenazingruppe. Nach den Ergebnissen früherer Untersuchungen wurde angenommen, dass Phenazinproduzenten diese Verbindungen lediglich als redoxaktive Antibiotika zur Steigerung ihrer Kompetitionsfähigkeit einsetzen. Neuere Studien zeigen jedoch, dass Phenazine noch andere physiologische Funktionen besitzen. So können sie als Signalmoleküle wirken und unter anoxischen Bedingungen, z.B. in den tieferen Schichten von Biofilmen, als respiratorische Pigmente eingesetzt werden, wodurch die Größe und Form von Bakterienkolonien beeinflusst wird. So tendieren die Bakterien in phenazindefizienten Pseudomonas-Kolonien dazu, sich stärker auszubreiten, um direkten Kontakt mit Luftsauerstoff zu erhalten. Weil die Phenazinbiosynthese fast ausschließlich auf Eubakterien beschränkt ist, sind die in diesen Prozess involvierten Enzyme potentiell attraktive Angriffspunkte für die pharmakologische Intervention. Chorismat ist das Vorläufermolekül für eine große Zahl von primären und sekundären Metaboliten in Bakterien und Pflanzen, z.B. für die aromatischen Aminosäuren, für Ubichinon, Folat (Vitamin B9), Menachinon (Vitamin K), die Siderophore Enterobactin und Pyochelin sowie für die Phenazine. PhzE verwendet Chorismat und Glutamin zur Erzeugung von 2-Amino-2-desoxyisochorismat (ADIC) im ersten Schritt der Phenazinbiosynthese. Im folgenden Schritt wird ADIC dann von der Isochorismat-Pyruvat-Lyase PhzD in trans-2,3-Dihydro-3-hydroxyanthranilat (DHHA) umgewandelt. In dieser Arbeit wurden die Kristallstrukturen von PhzE und PhzD sowohl in der freien als auch in der liganden- bzw. subtratgebundenen Form bestimmt. Während der Fokus in der Untersuchung der biologischen Funktion und von potentiellen regulatorischen Mechanismen von PhzE mittels einer Kombination aus biochemischen und biophysikalischen Methoden bestand, wurden auch neue Einblicke in den Substratbindungsmechanismus von PhzD gewonnen. Die erhaltenen Daten erweitern das Spektrum der strukturell charakterisierten chorismat-verwendenden Enzyme um ADIC-Synthasen. Außerdem vermitteln die strukturellen und funktionellen Untersuchungen an diesen beiden Proteinen neue Einblicke in die ersten Schritte der Phenazinbiosynthese und könnten so zukünftige Untersuchungen an möglichen Regulationsmechanismen dieses Weges leiten. Struktur und Funktion von PhzE PhzE verwendet Chorismat und Glutamin, um im ersten Schritt der Phenazinbiosynthese 2-Amino-2-desoxyisochorismat (ADIC) zu erzeugen. Das Monomer von PhzE enthält sowohl eine chorismat-umwandelnde Menachinon-Siderophor- Tryptophan-Biosynthese- (MST) als auch eine Typ-1-Glutamin-Amidotransferase- Domäne (GATase 1), welche durch einen 45 Aminosäure langen Linker miteinander verbunden sind. In dieser Arbeit werden die Kristallstrukturen von PhzE aus Burkholderia lata 383 in einer ligandenfreien offenen und in einer ligandengebundenen geschlossenen Konformation bei 2.9 bzw. 2.1 Å Auflösung vorgestellt. PhzE formt ein überkreuztes Dimer, in dem die GATase-1-Domäne der einen Kette NH3 für die MST-Domäne der anderen Kette erzeugt. Diese Quartärstruktur wurde auch durch Kleinwinkel-Röntgenstreuungsexperimente bestätigt. Die Bindung von Chorismat, das in der Kristallstruktur in Benzoat und Pyruvat umgewandelt vorgefunden wurde, führt zu strukturellen Umlagerungen unter Ausbildung eines Ammoniak-Transportkanals von 25 Å Länge innerhalb jedes der beiden funktionalen MST/GATase1-Paare des Dimers. Die funktionelle Einordnung von PhzE als ADIC-Synthase wurde durch massenspektrometrische Analyse des Produkts bestätigt. Dieses konnte auch durch Abfangen in Kristallen von inaktiven Mutanten (D38A/D38N) von PhzD, einer Isochorismatase, die den nachgelagerten Schritt in der Phenazinbiosynthese katalysiert, bei 1.9 Å sichtbar gemacht werden. Enzymkinetische Michaelis-Menten-Parameter für den Umsatz von Chorismat durch PhzE wurden bestimmt und zeigen, dass PhzE ein ähnliches Aktivitätsniveau wie andere Mitglieder der MST-Familie besitzt. Mutageneseexperimente wurden durchgeführt, um einerseits Aminosäuren, die an der Aufrechterhaltung der Stabilität bzw. Funktion von PhzE beteiligt sind, zu identifizieren und um anderseits Unterschiede in der ersten Substratkoordinationssphäre von Chorismat zwischen PhzE und Anthanilatsynthasen (AS) zu untersuchen. Im Gegensatz zu den verwandten Anthranilatsynthasen wurde bei PhzE keine allosterische Inhibition festgestellt. Dies ist darauf zurückzuführen, dass ein Tryptophan die potentielle regulatorische Bindungsstelle blockiert. Zusätzliche Elektronendichte im aktiven Zentrum der GATase1 wurde als Zink identifiziert und es wurde gezeigt, dass Zn2+, Mn2+ und Ni2+ die Aktivität von PhzE verringern. Kristallstrukturen von PhzD und Implikationen für den Substratbindungsmechanismus PhzD ist eine Isochorismatase, die den zweiten Schritt der Phenazinbiosynthese katalysiert, indem sie die Vinylethergruppe von ADIC unter Erzeugung von trans-2,3- Dihydro-3-hydroxyanthranilat (DHHA) und Pyruvat hydrolysiert. Das Enzym besteht aus einer einzigen Kette mit 209 Aminosäuren, die zu einer a/ß-Struktur mit Ähnlichkeit zu Mitgliedern der a/ß-Hydrolasefamilie faltet. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine umfassende kristallografische Untersuchung durchgeführt. Kristallstrukturen von nativem PhzD in seiner ligandenfreien Form und im Komplex mit Cacodylat und Acetat sowie mit seinem Produkt DHHA wurden bestimmt. Die beiden inaktiven Mutanten PhzD-D38A und PhzD-D38N im Komplex mit ADIC wurden ebenfalls kristallisiert. Dies ist das erste Mal, dass sowohl das natürliche Substrat und Produkt von PhzD in Kristallstrukturen beobachtet wurden. Die Ergebnisse bestätigen nicht nur die ADIC-Synthasefunktion von PhzE, sondern liefern auch Einblick in die Substratbindemechanismen von PhzD. Eine Gruppe von Aminosäuren, die in die Koordination des Substrats und in die Reaktionskatalyse verwickelt sind, wurde identifiziert. Interessanterweise ist die Schleifenregion P79 – R87 in der ligandenfreien Struktur sehr flexibel und in der Elektronendichtekarte vollständig unsichtbar. Der Strukturvergleich zwischen ligandenbesetzter und freier Struktur zeigt an, dass diese Schleife als ein Torwächter fungiert, der den Zu- und Abgang des Substrats kontrolliert.
Keywords: Natural products; Phenazines; X-ray crystallography; 540