Optogenetische Transkriptionskontrolle - Seifert, Swantje (Technische Universität Dortmund, 2024)
Licht als externer Stimulus zur Regulation der Proteinaktivität hat gegenüber klassischen Inhibitoren und Aktivatoren verschiedene Vorteile, wie z.B. eine sehr hohe räumliche und zeitliche Auflösung. Der Einsatz von photosensitiven Proteinen zur Untersuchung des dynamischen Verhaltens von intrazellulären Reaktionen und Reaktionskaskaden ist daher von großem Interesse. Photoaktive Proteine lassen sich in der Regel in zwei Module unterteilen. Die Sensordomäne, die mit einem lichtempfindlichen Liganden wechselwirkt und die Effektordomäne, die die Funktion des Proteins und die Signalweiterleitung bestimmt. Die Light-Oxygen-Voltage (LOV)-Domäne wurde in der Vergangenheit häufig als Sensor eingesetzt und mit verschiedenen Proteinen fusioniert, um deren Aktivität durch Licht zu regulieren. Es ist von entscheidender Bedeutung, eine geeignete Strategie zu finden, um die Sensor- und Effektordomänen so zu kombinieren, dass die Aktivität und die lichtabhängige Reaktivität erhalten bleiben. Für die T7-RNA-Polymerase wurden daher verschiedene Strategien getestet, um mit Hilfe der AsLOV2-Domäne eine optogenetische Kontrolle der Transkription zu erreichen. Es konnte gezeigt werden, dass die native terminale Fusion nicht universell anwendbar ist. Im Gegensatz zu dieser Strategie ist die Generierung lichtsensitiver T7-RNA-Polymerase-Varianten durch Insertion der Sensordomäne AsLOV2 möglich.
Design und Charakterisierung lichtsensitiver T7-RNA-Polymerase-Varianten
Keywords: Optogenetische Transkriptionskontrolle; T7-RNA-Polymerase; AsLOV2; 570; 540; Proteine