Isolation, Charakterisierung und hepatische Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen aus adipösem Gewebe und ihr möglicher Einsatz bei klinischen Fragestellungen - Seeliger, Claudine (Technische Universität Dortmund, 2011)
Hepatocyte transplantation is considered to be an alternative to orthotopic liver transplantation. Cells can be used to bridge patients waiting for a donor organ, decrease mortality in acute liver failure, and to support metabolic liver diseases. The limited availability of primary human hepatocytes for such applications has lead to the generation of alternative hepatocyte-like cells from various adult stem or precursor cells. The aim of this study was to generate hepatocyte-like cells from adipose-derived mesenchymal stem cells (Ad-MSCs) for clinical applications, which are available “off the shelf”. Characteristic CDmarker could be detected in the isolated Ad-MSCs. Furthermore cells showed a decrease of proliferation and telomere length over the passages. Epigenetic changes in hepatocyte-like cells were induced by 5-azacytidine, which in combination with other supplements leads to significantly improved metabolic and enzymatic activities compared to non-treated cells. Cells with sufficient hepatic features were generated with a 4-step protocol: 5-azacytidine (Step1), epidermal growth factor (Step 2), fibroblast growth factor-4, dexamethasone, insulintransferrin- sodium-selenite, nicotinamide (Step 3) and hepatocyte growth factor, dexamethasone, insulin-transferrin-sodium-selenite and nicotinamide (Step 4). Morphological changes were registered through the differentiation. Hepatocyte-like cells are more compact and hexagonal compared to the fibroblast-like Ad-MSCs. Generated differentiated cells had higher phase I (CYP1A1/2, CYP2E1, CYP2B6, CYP3A4) and phase II activities compared to the undifferentiated cells. A strong expression of CYP3A7 and a weak expression of CYP3A4, as well as the important detoxification markers, á-fetoprotein and albumin, could also be detected at the mRNA-level. Importantly, urea metabolism (basal, NH4-stimulated, NH4 and ornithine-stimulated) was comparable to freshly isolated human hepatocytes and, unlike cryopreserved human hepatocytes, this activity was maintained after six months of cryopreservation. These findings suggest that these cells may be suitable for clinic application, especially for treatment of urea cycle disorders.

Transplantationen von Hepatozyten, als eine Alternative zur orthotopen Lebertransplantation, wurden erfolgreich zur Behandlung von angeborenen metabolischen Fehlfunktionen der Leber sowie bei akutem Leberversagen eingesetzt. Die transplantierten Zellen konnen dabei zur Uberbruckung der Wartezeit auf Spenderorgane, zur Verringerung der Sterblichkeitsrate bei akutem Leberversagen sowie fur die Unterstutzung der Leber bei metabolischen Erkrankungen eingesetzt werden. Jedoch ist die Verfugbarkeit humaner Hepatozyten stark eingeschrankt. Daher suchen Forscher nach Alternativen basierend auf der Stammzellentechnologie. Ziel dieser Arbeit war es, Hepatozyten-ahnliche Zellen aus mesenchymalen Stammzellen von adiposem Gewebe (Ad-MSCs) fur klinische Anwendungen zu generieren und dabei vor allem den Aspekt der stetigen Verfugbarkeit zu berucksichtigen. Die eingesetzten Ad-MSCs wiesen fur MSCs spezifische CD-Marker auf und zeigten uber die Passagen eine Abnahme der Proliferation und Telomerlange. Epigenetische Veranderungen in der Zelle wurden vor Beginn der hepatischen Differenzierung mittels 5-Azacytidin induziert. Dies fuhrte in Kombination mit weiteren Medienzusatzen im Vergleich zur Kontrolle zu signifikant besseren metabolischen wie enzymatischen Aktivitaten der Hepatozyten-ahnlichen Zellen. Mit der Verwendung eines 4-stufigen Differenzierungsprotokolls konnten Zellen mit spezifischen hepatischen Eigenschaften generiert werden. Das Protokoll umfasste folgenden Schritte: 5-Azacytidin (Schritt 1), Epidermaler Wachstumsfaktor (Schritt 2), Fibroblasten Wachstumsfaktor 4, Dexamethason, Insulin Transferin Natrium Selenite, Nicotinamid (Schritt 3) und Hepatozyten Wachstumsfaktor, Dexamethason, Insulin Transferin Natrium Selenite, Nicotinamid (Schritt 4). Durch die hepatische Differenzierung kam es zu morphologischen Veranderungen der Zellen, was sich in einer Anderung der Zellform von Fibroblasten-ahnlich nach kompakt hexagonal zeigte. Hepatozyten-ahnliche Zellen zeigten eine hohere enzymatische Aktivitat von Phase I Enzymen (CYP1A1/2, CYP2A6, CYP2D6, CYP2B6, CYP3A4) und Phase II Enzymen im Vergleich zu undifferenzierten Zellen. Eine starke Expression von CYP3A7 und eine beginnende Expression von CYP3A4 wie auch die wichtigen hepatischen Marker ƒ¿-Fetoprotein und Albumin konnten in den ausdifferenzierten Hepatozyten-ahnlichen Zellen auf RNA-Ebene erfasst werden. Auserdem zeigten die differenzierten Zellen eine vergleichbare Harnstoffproduktion wie frisch isolierte humane Hepatozyten. Dies konnte sowohl auf basalem Level wie bei der Stimulation mit NH4Cl und NH4Cl in Kombination mit Ornithin gemessen werden. Zudem wiesen die Hepatozytenahnlichen Zellen im Vergleich zu den kryokonservierten hHeps keine Einbusen dieser metabolischen Fahigkeit nach einer 6 monatigen Kryokonservierung auf. Aufgrund dieser Ergebnisse konnten die mit dem in dieser Arbeit entwickelten Differenzierungsprotokoll generierten Hepatozyten-ahnlichen Zellen fur klinische Anwendungen im Hinblick auf Funktionsstorungen des Harnstoff Zyklus eingesetzt werden.
Keywords: Hepatische Differenzierung; Mesenchymale Stammzellen; 540; 570