Enhancing EPR capabilities: From 19F-ENDOR refinement to extreme condition measurements and sensitivity improvements
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2025
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Abstract
Electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy is a technique with many different application fields. It is gaining popularity in medicine, material science, and biochemistry. As EPR was further established in other research fields, several new methodologies arose. Over the years, methods have been developed to detect interactions between two paramagnetic centers and a paramagnetic center and a magnetic nucleus. These diverse methodologies allow for structural and function analysis through distance measurements and coupling analysis.
The need for higher precision measurements of minimal distances grew, and methods were developed and employed to satisfy this need. This thesis modifies 19F ENDOR measurements for very short distances from 94 GHz to 34 GHz, enhancing the technique's accessibility for a broader scientific audience. It also investigates DNA G-quadruplexes (GQ), which are critical to essential biological processes such as telomerase maintenance and gene expression. This research showcases the successful application of the 19F-ENDOR methodology at 34 GHz, overcoming the limitations posed by the complexity and scarcity of higher-frequency spectrometers. Notably, the approach retains sensitivity and orientational resolution, enhancing our understanding of GQs and expanding the methodological toolbox for studying other macromolecules.
Furthermore, analyzing biological processes sometimes means looking outside the established boundaries. In some cases, life exists in extreme environments that are not easily reproduced in lab scenarios, like high-pressure deep-sea environments, and are not always reliant on abundant amounts of substances; in some cases, a low amount of molecules can already change biological function. Both of these edge cases are not easily accessible for EPR spectroscopy. A robust high-pressure EPR setup for pressures up to 4 kbar was constructed and tested during this thesis. This not only allows for basic EPR experiments but also opens the door to the full variety of dipolar spectroscopy methods available in EPR by following an out-of-spectrometer approach. This allows the application to be independent of the later spectrometer setup, simplifying the application drastically. Additionally, a high-sensitivity resonator with an extra large sample entrance for microwave and radio frequency double resonance experiments was built and established to allow for measurements of very low-concentration samples that were not feasible in a timely manner with commercially available resonators.
Die paramagnetische Elektronenresonanzspektroskopie (EPR) ist eine Technik mit vielen verschiedenen Anwendungsbereichen. Sie wird in der Medizin, den Materialwissenschaften und der Biochemie immer häufiger verwendet. Durch die steigende Verbreitung der EPR Spektroskopie in anderen Forschungsbereichen entstanden mehrere neue Methoden. Der Bedarf an präziseren Messungen minimaler Abstände wuchs, und es wurden Methoden entwickelt und eingesetzt, um diesen Bedarf zu decken. In dieser Arbeit wurde die Anwendung von 19F ENDOR-Messungen für diese sehr kurzen Entfernungen bei 94 GHz auf 34 GHz übertragen, um die Nutzung der Technik für ein breiteres wissenschaftliches Publikum zu ermöglichen, und mit der Erforschung von DNA-G-Quadruplexen kombiniert, die aufgrund ihrer Beteiligung an entscheidenden biologischen Prozessen wie der Telomerase-Erhaltung und der Genexpression von großem Interesse sind. Diese Forschungsarbeit zeigt die erfolgreiche Anwendung der 19F-ENDOR-Methode bei 34 GHz und überwindet die Einschränkungen, die sich aus der Komplexität und dem Mangel an Spektrometern mit höheren Frequenzen ergeben. Vor allem behält der Ansatz die Empfindlichkeit und die Orientierungsauflösung bei, was unser Verständnis von GQs verbessert und den methodischen Werkzeugkasten für die Untersuchung anderer Makromoleküle erweitert. Außerdem bedeutet die Analyse biologischer Prozesse manchmal, dass man über die etablierten Grenzen hinausschauen muss. In einigen Fällen findet Leben in extremen Umgebungen statt, die in Laborszenarien nicht einfach reproduziert werden können, wie z. B. die Hochdruck-Tiefseeumgebungen, und sie sind nicht immer auf große Mengen von Substanzen angewiesen; in einigen Fällen kann bereits eine geringe Menge von Molekülen die biologische Funktion verändern. Beide Grenzfälle sind für die EPR-Spektroskopie nicht einfach zu untersuchen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein robuster Hochdruck-EPR-Aufbau für Drücke bis zu 4 kbar konstruiert und getestet. Dies ermöglicht nicht nur grundlegende EPR-Experimente, sondern öffnet auch die Tür zur gesamten Vielfalt der dipolaren Spektroskopiemethoden, die in der EPR zur Verfügung stehen, indem ein Out-of-Spectrometer-Ansatz verfolgt wird. Dadurch wird die Anwendung unabhängig vom späteren Spektrometeraufbau, was diese drastisch vereinfacht. Darüber hinaus wurde ein hochempfindlicher Resonator mit einem extra großen Probeneingang für Mikrowellen- und Radiofrequenz-Doppelresonanzexperimente gebaut und etabliert, um Messungen an sehr niedrig konzentrierten Proben zu ermöglichen, die mit Standard-Bruker-Resonatoren nicht in angemessener Zeit durchführbar waren.
Die paramagnetische Elektronenresonanzspektroskopie (EPR) ist eine Technik mit vielen verschiedenen Anwendungsbereichen. Sie wird in der Medizin, den Materialwissenschaften und der Biochemie immer häufiger verwendet. Durch die steigende Verbreitung der EPR Spektroskopie in anderen Forschungsbereichen entstanden mehrere neue Methoden. Der Bedarf an präziseren Messungen minimaler Abstände wuchs, und es wurden Methoden entwickelt und eingesetzt, um diesen Bedarf zu decken. In dieser Arbeit wurde die Anwendung von 19F ENDOR-Messungen für diese sehr kurzen Entfernungen bei 94 GHz auf 34 GHz übertragen, um die Nutzung der Technik für ein breiteres wissenschaftliches Publikum zu ermöglichen, und mit der Erforschung von DNA-G-Quadruplexen kombiniert, die aufgrund ihrer Beteiligung an entscheidenden biologischen Prozessen wie der Telomerase-Erhaltung und der Genexpression von großem Interesse sind. Diese Forschungsarbeit zeigt die erfolgreiche Anwendung der 19F-ENDOR-Methode bei 34 GHz und überwindet die Einschränkungen, die sich aus der Komplexität und dem Mangel an Spektrometern mit höheren Frequenzen ergeben. Vor allem behält der Ansatz die Empfindlichkeit und die Orientierungsauflösung bei, was unser Verständnis von GQs verbessert und den methodischen Werkzeugkasten für die Untersuchung anderer Makromoleküle erweitert. Außerdem bedeutet die Analyse biologischer Prozesse manchmal, dass man über die etablierten Grenzen hinausschauen muss. In einigen Fällen findet Leben in extremen Umgebungen statt, die in Laborszenarien nicht einfach reproduziert werden können, wie z. B. die Hochdruck-Tiefseeumgebungen, und sie sind nicht immer auf große Mengen von Substanzen angewiesen; in einigen Fällen kann bereits eine geringe Menge von Molekülen die biologische Funktion verändern. Beide Grenzfälle sind für die EPR-Spektroskopie nicht einfach zu untersuchen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein robuster Hochdruck-EPR-Aufbau für Drücke bis zu 4 kbar konstruiert und getestet. Dies ermöglicht nicht nur grundlegende EPR-Experimente, sondern öffnet auch die Tür zur gesamten Vielfalt der dipolaren Spektroskopiemethoden, die in der EPR zur Verfügung stehen, indem ein Out-of-Spectrometer-Ansatz verfolgt wird. Dadurch wird die Anwendung unabhängig vom späteren Spektrometeraufbau, was diese drastisch vereinfacht. Darüber hinaus wurde ein hochempfindlicher Resonator mit einem extra großen Probeneingang für Mikrowellen- und Radiofrequenz-Doppelresonanzexperimente gebaut und etabliert, um Messungen an sehr niedrig konzentrierten Proben zu ermöglichen, die mit Standard-Bruker-Resonatoren nicht in angemessener Zeit durchführbar waren.
Description
Table of contents
Keywords
EPR Spektroskopie, G-Quadruplex, Hochdruck EPR, Physikalische Chemie
Subjects based on RSWK
Elektronenspinresonanzspektroskopie