Authors: Venkatachalam, Arunachalam
Title: ICP-MS based analytical screening of phosphorylated and labelled proteins
Language (ISO): en
Abstract: Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (ICP-MS) is used already for many biological applications. Apart from qualitative analysis, this technique offers quantitative information of elements in proteins which is important in determining the state and changes of the biological system. Utilizing this advantage, two different approaches were investigated in this work to detect and quantify phosphorylated and labelled proteins using Laser Ablation (LA) ICP-MS. The first approach is based on direct detection of natural hetero-elements being present in nearly all proteins, especially 31P+, and the second one involved the detection of proteins via controlled labelling by means of lanthanides using chelating complexes and staining methods. LA-ICP-MS was used in this work for detection of phospho-proteins after separation with sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and transfer onto a membrane. Measuring phosphorus in proteins by this method, linearity of the calibration in the range from 20 to 380 pmol was achieved with good reproducibility and sufficient sensitivity to realize a detection limit of 1.5 pmol. Quantification of phospho-proteins was performed with standards by 1) dotting onto membranes and 2) SDS-PAGE separation and blotting. The latter quantification procedure was applied to study the changes of the phosphoproteome induced by epidermal growth factor and hydrogen peroxide of an urothelial cell line 5637. In the second part of the work, a procedure was developed to simultaneously detect and quantify multiple proteins in a mixture via labelling techniques using LA-ICP-MS in Western blots. Different labelling procedures were investigated using bi-functional chelating agents namely, 2-(4-Isothiocyanatobenzyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA) and diethylenetriaminepentaacetic acid dianhydride (DTPA). The assay, using DOTA and iodination for labelling of proteins and antibodies, was optimised for ICP-MS detection and were combined to investigate different enzymes of Cytochromes P450 concomitantly. By this method a generic approach for detecting different proteins simultaneously could be established.
Die induktiv gekoppelte Plasma-Massenspektrometrie (ICP-MS) wird bereits für viele biologische Anwendungen eingesetzt. Diese Methode liefert qualitative und quantitative elementspezifische Informationen, die zur Bestimmung des Zustands und der Veränderung eines biologischen Systems wichtig sind. Diese Fähigkeit wurde in dieser Arbeit genutzt, um zwei unterschiedliche Methoden zu untersuchen, die dazu dienen sollen, phosphorylierte und markierte Proteine durch Laserabtrags- (LA) ICP-MS zu bestimmen. Die erste Anwendung basiert auf der direkten Detektion natürlich vorkommender Hetero-Elemente in Proteinen, wie z.B. 31P+ in phosphorylierten Proteinen. Die zweite Anwendung beinhaltet den Nachweis von Proteinen durch kontrolliertes Markieren mithilfe der Lanthanide unter Einsatz von Chelat-Komplexen und Färbe-Methoden. Die Laserabtrags-ICP-MS wurde zum Nachweis von Phosphor-Proteinen nach Trennung mittels Natrium Dodecyl Sulfat Polyacrylamid Gel Elektrophorese (SDS-PAGE) eingesetzt. Mit dieser Methode konnte eine Linearität im Bereich von 20 bis 380 pmol Phosphor in Proteinen mit guter Reproduzierbarkeit erreicht werden und außerdem eine ausreichende Empfindlichkeit um eine Nachweisgrenze von 1,5 pmol zu verwirklichen. Eine Quantifizierung von phosphorylierten Proteinen wurde durch zwei unterschiedliche Methoden versucht: Auftrag von Phosphorstandards auf die zu messende Membran und durch Verwendung eines Standardproteins während der Trennung. Dieses Quantifizierungsverfahren wurde angewandt, um die Veränderungen des Phosphor-Proteoms zu untersuchen, das durch den Epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) bzw. durch Hydrogenperoxid (H2O2) in der Harnblasen-Zelllinie 5637 erzeugt wurde. In dem zweiten Teil der Arbeit wurde ein Verfahren entwickelt, um mehrere Proteine in einer Mischung gleichzeitig nachzuweisen und zu quantifizieren, und zwar durch Markierungstechniken unter Einsatz der LA-ICP-MS an Western Blots. Unterschiedliche Markierungsverfahren wurden untersucht, basierend auf der Verwendung von bi-funktionalen Chelatbildnern, nämlich 2-(4-Isothiocyanatobenzyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododekan-1,4,7,10-tetraessigsäure (DOTA) und Diethylen-triamin-pentaessigsäure Dianhydrid (DTPA). Die Proteine und Antikörper wurden mit DOTA und Lanthaniden markiert, jodiert und für den ICP-MS Nachweis optimiert, um unterschiedliche Enzyme von Cytochrom P450 gleichzeitig zu untersuchen. Durch diese Methode konnte ein allgemeines Verfahren zum gleichzeitigen Nachweis verschiedener Proteine ausgearbeitet werden.
Subject Headings: LA-ICP_MS
Phosphorylation
Cytochromes
P450
URI: http://hdl.handle.net/2003/26433
http://dx.doi.org/10.17877/DE290R-882
Issue Date: 2009-09-29T12:40:12Z
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