Authors: Tinnefeld, Verena
Title: Methodenentwicklung zur Analyse von Proteinen und Proteinkomplexen mittels Cross-Linking und Massenspektrometrie
Language (ISO): de
Abstract: In dieser Arbeit wurde die Analyse von Protein Cross-Links systematisch untersucht. Dabei wurde neben der Messung mittels LC-MS/MS auch die Auswertung mit speziellen Suchalgorithmen näher betrachtet. Die drei häufigsten Suchprogramme pLink, xQuest und StavroX wurden dabei miteinander verglichen. Mit diesen Ergebnissen wurden auch Kriterien für die Annahme oder Ablehnung von identifizierten Cross-Links festgelegt. Neben klassischem, chemischem Cross-Linking wurde auch versucht, photochemisches Cross-Linking zu optimieren. Zunächst wurde die Aktivierung der photoreaktiven Komponente mit einem gepulsten Laser getestet. Aufgrund des mangelnden Erfolgs wurde daraufhin die notwendige Aktivierungszeit des Reagenzes mit einer UV-Lampe bestimmt, um den Misserfolg des ersten Versuchs zu erklären. Darüber hinaus wurde die Anreicherung von Cross-Link Peptiden optimiert, um deren Identifizierung zu erleichtern. Anhand des bestehenden ChaFRADIC-Protokolls mit Kationenaustauschchromatographie wurden drei neue Anreicherungs-Protokolle für Cross- Link Peptide entwickelt. Da der ursprüngliche ChaFRADIC-Ansatz nicht auf Cross-Link Peptide übertragen werden konnte, wurden neue Modifikationen, Proteasen und Chromatographie-Techniken getestet und erfolgreich eingesetzt. Alle drei entwickelten Anreicherungsmethoden ermöglichten die Identifikation zusätzlicher Cross-Links in BSA mit unterschiedlicher Effizienz. Daneben wurden in Kooperation mit weiteren Forschungsgruppen weitere Proteine mittels Massenspektrometrie analysiert, um neue strukturelle Informationen zu erhalten. Erstmalig wurde der BBSome-Komplex aus sechs Proteinen mit Cross-Linking untersucht, um die Interaktion zwischen den einzelnen Protein-Untereinheiten zu bestimmen. Zusätzlich wurde die Interaktion zweier bakterieller Peptide (Cdc42 mit IbpA) über einen neuartigen ATPCross- Linker massenspektrometrisch bestimmt. Abschließend wurde in dieser Arbeit ein Peptid-Standard für Cross-Link Peptide entwickelt. Über ein neuartiges Reaktionsschema konnte eine große Anzahl von Cross-Link Peptide mit beliebiger Sequenz hergestellt werden. Eine Mischung aus 20 Standard-Peptiden wurde anschließend verwendet, um verschiedenen Fragmentierungsmethoden für Cross-Link Peptide miteinander zu vergleichen und die optimale Messmethode zu bestimmen.
Subject Headings: Proteomics
Cross-Linking
Protein
Massenspektrometrie
Subject Headings (RSWK): Massenspektrometrie
Proteom
Proteomics
URI: http://hdl.handle.net/2003/36724
http://dx.doi.org/10.17877/DE290R-18725
Issue Date: 2017
Appears in Collections:ISAS

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
Dissertation_Tinnefeld.pdfDNB4.23 MBAdobe PDFView/Open


This item is protected by original copyright



All resources in the repository are protected by copyright.