Development of a FRET-Based Fluorescent Biosensor for ERK2 Activity
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Date
2011-06-16
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Die dynamischen Eigenschaften von biologischen Systemen sind das Ergebnis der
zugrundliegenden dynamischen Wechselbeziehungen der individuellen Komponenten. Die
Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK)-Kaskade ist ein evolutionär konserviertes Signalweiterleitungsmodul,
das das Schicksal von Zellen wie Wachstum oder Differenzierung
reguliert. Die Aktivierung von Extracellular Signal-Regulated Kinase 2 (ERK2) folgt einer
komplexen zeitlichen und räumlichen Dynamik, die eine wichtige Rolle für bestimmte
nachgeordnete Signaleffekte spielt. Eine der Hauptherausforderungen für das Verständnis
von MAPK Signalweiterleitung und der Mechanismen, die Signalweiterleitung innerhalb der
Zelle ermöglichen, ist der Mangel an Methoden um Kinase-Aktivität mit hoher zeitlicher und
räumlicher Auflösung in lebenden Zellen zu erfassen. Während traditionelle, biochemische
Methoden auf Messungen von Durchschnittswerten aus einer Vielzahl von Zellen begrenzt
sind, haben bereits veröffentlichte, auf FRET basierende Biosensoren für ERK2-Aktivität
mehrere schwere Nachteile wie die nur indirekte Ermittlung von ERK2-Aktivität über die
Phosphorylierung eines Substrats oder über eine Konformationsänderung, einen niedrigen,
dynamischen Messbereich und ungenügende räumliche Auflösung (Fujioka et al., 2006;
Sato et al., 2007; Harvey et al., 2008a). Deshalb wurde in der vorliegenden Arbeit eine
Methode entwickelt, um ERK2-Aktivität in einzelnen Zellen mit hoher zeitlicher und
räumlicher Auflösung und einem grossen dynamischen Messbereich sichtbar zu machen
und zu quantifizieren.
Der direkteste Ansatz um Kinase-Aktivität in lebenden Zellen zu messen ist die
Sichtbarmachung von kurzlebigen Enzym-Substrat (ES) Wechselwirkungen. Die Bildung
eines ES-Komplexes kann über die Messung von Förster-Resonanzenergietransfer/
Fluoreszenzlebenszeiten (FRET/FLIM) zwischen einer Donor-markierten Kinase und
einem Akzeptor-markierten Substratpeptid nachgewiesen werden (Yudushkin et al., 2007).
Allerdings sind FLIM-Methoden auf ein grossen Anteil an Donormolekülen angewiesen, die
FRET eingehen (d.h. einen hohen Anteil an Enzym im Komplex mit seinem Substrat) und
kurze Peptide aus bekannten ERK2-Substraten haben KM-Werte in einem Bereich von 100
μM - 1 mM. Es ist deshalb schwierig, ausreichend hohe Substratkonzentration innerhalb
von Zellen zu erreichen.
In einem Versuch, die lokale Substratkonzentration zu erhöhen, wurde das Substratpeptid
über einen flexiblen Peptidlinker mit ERK2 verbunden. Der Aufbau von ERK2 Activity
Sensor 4 (EAS4) sollte prinzipiell auf alle Kinasen anwendbar sein. Er basiert auf der reversiblen
Bindung und Phosphorylierung eines kurzen Substratpeptids durch die untersuchte
Kinase. Die Bindung des Substratpeptids im aktiven Zentrum der Kinase verursacht eine
umfassende Konformationsänderung von EAS4, die über eine Änderung des FRET-Signals
erfasst werden kann, das durch Anhängen eines FRET-Paares fluoreszierender Protein
erzielt wird. Deshalb ist dieser neu entwickelte, auf FRET basierende, fluoreszierende
ERK2-Biosensor der Erste, der direkte Kinase-Aktivität in Raum und Zeit anzeigt, indem
kurzlebige ES-Wechselwirkungen sichtbar gemacht werden. EAS4 zeichnet sich ausserdem
durch einen dynamischen Messbereich und eine räumliche Auflösung aus, die zuvor
veröffentlichten ERK2 Biosensoren überlegen ist. Zusätzlich konnte mit Hilfe von EAS4
gezeigt werden, dass Heregulin (HRG)-vermittelte, anhaltende ERK Aktivität in MCF-7
Zellen vornehmlich im Zytosol zu finden ist, während HRG-vermittelte ERK2-Aktivität im
Zellkern sowie EGF-vermittelte ERK2-Aktivität transient ist. Dies zeigt das Potential von
EAS4 für die weitere Untersuchung von biologischen Fragestellungen.
Description
Table of contents
Keywords
Biosensor, ERK2, ES-Imaging, FRET, signal transduction