Identification, isolation and functional characterization of prenyltransferases in Cannabis sativa L.

Abstract

Prenylierte Substanzen tragen zur Vielfalt der Sekundärmetabolite bei. Prenylierte Metabolite besitzen entzündungshemmende und antibakterielle Eigenschaften. Die Enzyme, die die Prenylierung durch Bildung einer neuen C-C oder C-O Bindung katalysieren sind Prenyltransferasen. Eines dieser Enzyme ist an der Biosynthese des psychoaktiven Wirkstoffs THC aus Cannabis beteiligt. Olivetolsäure wird mit Geranyldiphosphat bei dieser Reaktion zu Cannabigerolsäure prenyliert, dem Ausgangsstoff von THCA. Das Ziel dieser Arbeit war die Identifikation von Enzymen die potentiell diese Reaktion katalysieren können. Eine in silico Analyse war der erste Schritt, um neue Mitglieder der Familie der aromatischen, membrangebundenen Prenyltransferasen zu finden. Die Suche beinhaltete die Charakterisierung unterschiedlicher Gruppen von Prenyltransferasen bezüglich Unterschiede in ihrer genetischen Sequenz mithilfe von webbasierten Software-Programmen. Die Suche nach neuen Prenyltransferasen in DNA-Bibliotheken wurde durch einen spezifisch dafür entwickelten mathematischen Algorithmus verwirklicht, welcher die verschiedenen Gruppen von Prenyltransferasen anhand des Aufbaus ihrer genetischen Sequenz unterschied. Die Berechnung ergab fünf mögliche neue aromatische Prenyltransferasen. Die evolutionäre Verwandtschaft anhand der genetischen Sequenzen ermöglichte eine Einteilung in verschiedene Gruppen. Anhand der in silico berechneten Ergebnisse wurden die cDNA Sequenzen für in vivo Experimente bestimmt. Wirtsorganismen für in vivo Experimente der möglichen Enzyme waren die Pflanze Nicotiana benthamiana und die Hefe Saccharomyces cerevisiae Y05416. Für die transiente Expression in Tabakpflanzen wurde das innovative Verfahren magnICON® verwendet. Für die heterologe Expression in Hefe wurden zwei Strategien verfolgt: (i) die Klonierung der cDNA Sequenzen mit dem nativen (pflanzeneigenen) Signalpeptid, (ii) die Klonierung der cDNA Sequenzen mit dem Signalpeptid des F1F0 ATP Synthase Enzymkomplexes aus Hefezellen. Eines der möglichen Pflanzenenzyme wurde aktiv in Saccharomyces cerevisiae Y05416 exprimiert. Dieses Ergebnis zeigt, dass das verwendete Expressionssystem für die Expression von aromatischen Prenyltransferasen aus Pflanzen geeignet ist und Hefezellen als Plattformorganismus zur Expression von Pflanzengenen unter bestimmten Bedingungen genutzt werden kann. Die gesamte Arbeit leistet einen Beitrag zur erfolgreichen Expression von Pflanzengenen in Saccharomyces cerevisiae und erweitert die Kenntnisse über die Familie der membran-gebundene Prenyltransferasen. Die Arbeit zeigt ebenfalls die Vielfalt an Klonierungsmethoden und Wirtsorganismen auf.