Strukturelle Untersuchungen an 1,5-Anhydro-D-fructose-Reduktase aus Sinorhizobium morelense S-30.7.5. und SoxXA aus Paracoccus pantotrophus

Abstract

In dieser Dissertation wird über die Kristallstruktur des Enzyms 1,5-Anhydro-D-fruktose-Reduktase (AFR) berichtet, das in der Lage ist 1,5-Anhydro-D-fruktose (1,5-AF) streng NADPH-abhängig zu 1,5-Anhydro-D-mannitol zu reduzieren. 1,5-AF konnte in unterschiedlichen Organismen nachgewiesen werden. Es ist unter anderem in der Regulation des Glycogenhaushalts in Säugern beteiligt und konnte als Zwischenprodukt bei der Antibiotikaproduktion in Pilzen und Rotalgen nachgewiesen werden. AFR wurde in Gegenwart von Cofaktor kristallisiert. Der Oxidationszustand des Cofaktors konnte über Fluoreszenzmessungen an intakten Kristallen zu NADP+ bestimmt werden. Die Struktur konnte über SAD an Se-Met bis zu einer Auflösung von 2.2 Å bestimmt werden.AFR besteht aus zwei Domänen. Die N-terminale Domäne zeigt eine typische Rossmann Faltung und ist verantwortlich für die Cofaktor Bindung. Aufgrund der Struktur wurde die Spezifität von AFR gegenüber phosphoryliertem Cofaktor NADP(H) diskutiert und Möglichkeiten aufgezeigt, diese Cofaktorpräferenz zugunsten NAD(H) zu verschieben. In der C-terminalen Domäne konnten verschiedene Reste identifiziert werden, die wahrscheinlich in die Substratbindung und Katalyse involviert sind. Ein Histidinrest im aktiven Zentrum agiert wahrscheinlich als Säure-Basen-Katalysator indem er die Carbonylgruppe des Substrats polarisiert und so den Transfer des Hydridions von NADPH zum Substrat ermöglicht.Der zweite Teil der Dissertation beschäftigt sich mit der Kristallstruktur von SoxXA, einem Enzym, das in die Schwefeloxidation von Paracoccus pantotrophus involviert ist. Das Schwefeloxidations-System von P. pantotrophus (SOX) besteht aus mehreren Enzymen, die in der Lage sind Sulfid, molekularen Schwefel, Thiosulfat und Sulfit zu oxidieren und die gewonnenen Elektronen der Atmungskette zu Verfügung zu stellen. Der heterodimere Cytochrom c Komplex SoxXA agiert dabei als Häm-Enzym und verknüpft kovalent das Schwefel Substrat mit der Thiol-Gruppe von Cyst-138 des SoxYZ Komplexes. Die Kristallstruktur des Cytochrom c Komplexes SoxXA konnte bis zu einer Auflösung von 1.9 Å gelöst werden und zeigte eine ungewöhnliche Koordination in Form eines Cysteinthiolat an Häm2. Die Bindungstasche um das aktive Zentrum bei Häm2 bietet ausreichend Platz für ein (GGCGG)2 Dimer, das über die Cysteine kovalent verknüpft ist, und ein Analogon für den dimeren C-Terminus von SoxY2 darstellt. Anhand der Kristallstruktur und biochemischen Daten wurde ein Mechanismus für die kovalente Verknüpfung des Schwefelsubstrats mit der Sulphhydrylgruppe von Cys-138 von SoxY über eine kovalente Zwischenstufe an Cys251 von SoxA vorgeschlagen.

In this PhD thesis the 2.2 Å crystal structure of the enzyme 1,5-anhydro-D-fructose reductase (AFR) is reported, which reduces the carbohydrate derivative 1,5-anhydro-D-fructose (1,5-AF) yielding 1,5-anhydro-D-mannitol in a strictly NADPH-dependent manner. 1,5-AF was identified in various organisms. It is involved in the regulation of the glycogen metabolism in mammalians and was identified to be an intermediate in the production of antibiotics in fungi and red algae. AFR was crystallized in the presence of cofactor. The bound dinucleotide is NADP+ as was determined by fluorescence measurements of the intact crystal to NADP+. The crystal structure was solved with the SAD-method using Se-Met incorporation.AFR consists of two domains. The N-terminal domain shows a Rossmann fold and is responsible for the cofactor binding. Based on the structure, the cofactor specificity of AFR towards phosphorylated cofactor NADP(H) is discussed and possibilities for a conversion of this cofactor specificity to the NAD(H) are suggested. In the C-terminal domain several residues could be identified, which are involved in substrate binding and catalysis. A histidine residue in the active site is believed to act as a acid base catalyst by polarisation of the carbonyl function of the substrate to enable the transfer of the hydride ion from NADPH onto the substrate.A second part of this thesis is concerned with the crystal structure of SoxXA, an enzyme which is involved in sulfur oxidation in Paracoccus pantotrophus. The sulfur-oxidizing enzyme system of P. pantotrophus (SOX) is composed of several proteins, which oxidize hydrogen sulfide, sulfur, thiosulfate or sulfite and transfer the generated electrons to the respiratory chain. The heterodimeric cytochrome c complex SoxXA functions as heme enzyme covalently linking the sulfur substrate to the thiol of the Cys-138 residue of the SoxY protein of the SoxYZ complex. The crystal structure of the cytochrome complex SoxXA was solved to a resolution of 1.9 Å. The axial heme-iron coordination involves an unusual Cys-251 thiolate at heme-2. The space in the active site pocket around heme-2 was sufficient for a (GGCGG)2 dimer covalently linked via a disulfide bridge, which is an analogue for the C-terminus of a SoxY2 dimer. On the basis of the crystal structure and biochemical data, a mechanism for the covalent linkage of the sulfur substrate to the sulphhydryl of Cys-138 of SoxY via a covalent intermediate at Cys251 of SoxA is proposed and discussed.