Authors: Braunshausen, Andrea
Title: Peptidinhibitoren der Transpeptidase Sortase A aus Staphylococcus aureus und Untersuchungen zur Ovothiol A-Biosynthese in Erwinia tasmaniensis
Language (ISO): de
Abstract: Sortase A Inhibitoren: Sortase A (SrtA) aus Staphylococcus aureus ist eine membranverankerte Transpeptidase, welche Vorläufermoleküle oberflächenassoziierter Virulenzfaktoren anhand des Motivs LPXTG erkennt und an der Zelloberfläche verankert. In der vorliegenden Arbeit wurden dem LPXTG-Motiv ähnelnde zyklische Peptidsequenzen hinsichtlich ihrer Interaktion mit SrtA charakterisiert. Ein besonderes Augenmerk lag dabei auf der Relevanz der Peptidzyklisierung für diese Interaktion. Die untersuchten Peptidsequenzen wurden eindeutig als SrtA-Inhibitoren klassifiziert. Es wurden hierzu in vitro Methoden zur Ermittlung der Kd-Werte (10 -94 nM), thermodynamischen Bindungsparameter (ΔH = 10,2 kcal/mol, -TΔS = 0,3 kcal/mol), Bindungsstöchiometrien (N = 1), IC50-Werte (0,4 – 3,7 µM) und des Inhibitionsmechanismuses (langsam reversibel) entwickelt. Zudem wurde ein Flüssigkultur-Assay zur Quantifizierung der in vivo-Bindung der Peptidinhibitoren an S. aureus-Zellen etabliert. Es wurde gezeigt, dass die in vitro Eigenschaften der Untersuchten SrtA-Inhibitoren unbeeinflusst von der Peptidzyklisierung sind. Die in vivo Bindungsaffinität wird hingegen von einer vorhandenen Peptidzyklisierung erhöht. Ovothiol A-Biosynthese: Die Ovothiol A-Biosynthese in E. tasmaniensis beruht auf drei enzymatischen Schritten, einer Synthese, einer ß-Elimination und einer Methylierung (Vogt et al., 2001). In der vorliegenden Arbeit wurden die Produkte eines Ovothiol A Sulfoxidsynthase Gens (OvoA) und eines Ovothiol A ß-Lyase Gens (OvoB) aus E. tasmaniensis charakterisiert. Dem Motiv His170-X3-His174-X-Glu176 der OvoA konnte die Funktion der Eisenkoordination zugewiesen werden. Hierzu wurden die Enzymmutanten OvoAH170A, OvoAH174A und OvoAE176A hergestellt und gezeigt, dass sie jeweils einen vollständigen Aktivitätsverlust aufweisen. Ergänzend wurde die Relevanz des in OvoA konservierten Arg183 untersucht. Hierzu wurden die Mutanten OvoAR183A und OvoAR183K hergestellt. OvoAR183A zeigte einen vollständigen Aktivitätsverlust und OvoAR183K einen erheblichen Aktivitätsverlust. Vermutlich sind an Position 183 also positive Ladungen erforderlich. Für OvoB wurden die Umsatzraten für diverse Substrate bestimmt. Das von OvoA gelieferte Intermediat wurde mit der höchsten Effizienz von OvoB umgesetzt. Es lässt sich schließen, dass es sich bei dem untersuchten Enzym um die gesucht ß-Lyase der Ovothiol A-Biosynthese handelt und diese jedoch eine geringe Substratspezifität aufweist.
Subject Headings: Erwinia tasmaniensis
Inhibitor
OvoA
OvoB
Ovothiol A
Sortase A
Staphylococcus aureaus
URI: http://hdl.handle.net/2003/29475
http://dx.doi.org/10.17877/DE290R-4834
Issue Date: 2012-06-12
Appears in Collections:Max-Planck-Institut für molekulare Physiologie

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