Charakterisierung und Stabilisierung von 14-3-3-Protein-Protein- Wechselwirkungen

Abstract

Auf der Suche nach neuen PPI-Stabilisatoren müssen PPIs von Interesse zunächst umfassend charakterisiert werden. Es gilt auÿerdem zu überprüfen, ob eine Stabilisierung der untersuchten PPI pharmakologisch sinnvoll ist. In der vorliegenden Arbeit wurden die Wechselwirkungen von 14-3-3-Proteinen mit MLF1 und C-RAF mit biochemischen und strukturbiologischen Methoden charakterisiert. Um zu überprüfen, ob eine Stabilisierung dieser Wechselwirkungen pharmakologisch sinnvoll ist, wurde überdies mit zellbiologischen Methoden der physiologische Effekt dieser Wechselwirkungen untersucht. Basierend auf der im Vorfeld dieser Arbeit gelösten Röntgenkristallstruktur des Komplexes aus 14-3-3e und MLF1(29-42)pS34 wurde die MLF1/14-3-3-Wechselwirkung mittels ITC untersucht. Der erhaltene KD-Wert für das WT-MLF1-Peptid lag erwartungsgemäÿ im niedrigen mikromolaren Bereich. Die Untersuchung verschiedener MLF1-Mutanten zeigte, dass neben dem pS34 nur das F33 einen signifikanten Beitrag zur Bindung an 14-3-3-Proteine leistet. Weiterhin wurde durch den Einsatz von GFP-MLF1-Fusionsproteinen die subzelluläre Lokalisation des humanen MLF1-Proteins in HEK293T-Zellen auf eine direkte 14-3-3-Abhängigkeit untersucht, wie sie von Winteringham et al. (2006) für murines MLF1 in Cos-7-Zellen beobachtet wurde. Es zeigte sich jedoch, dass die subzelluläre Lokalisation von humanem MLF1 in HEK293T-Zellen nicht direkt 14-3-3- abhängig ist und der von Winteringham et al. (2006) vorgeschlagene Mechanismus zur Regulation von murinem MLF1 durch 14-3-3-Proteine nicht direkt auf das humane Homolog übertragbar ist. Die S259-vermittelte C-RAF/14-3-3-Wechselwirkung wurde im Vorfeld dieser Arbeit bereits intensiv mit strukturbiologischen, biochemischen und zellbiologischen Methoden charakterisiert. Daher wurde in der vorliegenden Arbeit der physiologische Effekt von Mutationen der 14-3-3-Bindestelle um S259, wie sie in Noonan- und LEOPARDSyndromen gefunden wurden, untersucht. Es konnte nachgewiesen werden, dass diese Mutationen aktivierend auf den RAS-RAF-MEK-ERK-Signalweg wirken. Diese Auswirkung konnte bereits für die anderen, in Noonan-und LEOPARD mutierten Gene, PTPN11, SOS1 und KRAS, gezeigt werden (Tartaglia et al., 2001; Carta et al., 2006; Schubbert et al., 2006; Roberts et al., 2007; Tartaglia et al., 2007). Es zeigte sich weiterhin, dass die eingesetzten, C-terminal verkürzten C-RAF-Mutanten keinen Einfluss auf die subzelluläre Lokalisation der endogenen C-RAF-Proteine hatten. Dieses Ergebnis bekr äftigt die These, dass C-RAF-Proteine über ihren C-terminalen Bereich dimerisieren (Weber et al., 2001; Rushworth et al., 2006). Die biochemische Untersuchung der S233-vermittelten C-RAF/14-3-3-Wechselwirkung zeigte, dass 14-3-3-Proteine sowohl über S233 als auch gleichzeitig über S233 und S259 an C-RAF binden können. Die S233-vermittelte Bindung ist dabei deutlich schwächer als die S259-vermittelte Bindung. Eine gleichzeitige Bindung über S233 und S259 wirkt synergistisch und erhöht die Affinität deutlich. Die Messung der Bindungsstöchiometrie (N) von 14-3-3? an das C-RAF(229-264)pS233,pS259-Diphosphopeptid über ITC und FP ergab einen Wert von N ˜ 1 bezogen auf ein 14-3-3-Dimer. Die strukturbiologische Untersuchung legte eine Bindung des C-RAF(229-264)pS233,pS259-Diphosphopeptids an ein 14-3-3?-Dimer in einer cis-Konformation nahe, wobei eine Bindung an zwei Dimere in trans nicht ausgeschlossen werden kann. Zellbiologische Untersuchungen zeigten, dass GFP-C-RAF300?C sowohl über die S259- als auch die S233-vermittelte 14-3-3-Wechselwirkung in unstimulierten Zellen im CP gehalten wird. Eine Störung dieser Wechselwirkung hat eine Translokation des GFP-C-RAF300?C-Proteins zur Folge und führt zu einer Co-Lokalisation mit H-RAS an der PM. Aufgrund der durch die Charakterisierung der C-RAF/14-3-3-Wechselwirkung gewonnenen Erkenntnisse erscheint eine Stabilisierung der gleichzeitig über S233- und S259-vermittelten C-RAF/14-3-3-Wechselwirkung pharmakologisch sinnvoll. Es wurde daher nach einem möglichen Stabilisator gesucht. Der bisher einzige bekannte Stabilisator von 14-3-3-Protein-Wechselwirkungen, FCA (Ottmann et al., 2007a), hatte jedoch keinen stabilisierenden Effekt auf die S233- und S259-vermittelte C-RAF/14-3-3- Wechselwirkung. Da das strukturell verwandte Molekül CNA an einen Komplex aus einem C-RAF(255-265)pS259,M265A-Peptid und dem pflanzlichen 14-3-3c binden kann (Ottmann et al., 2009), wurde es auf seine stabilisierende Wirkung hin untersucht. CNA stabilisiert demnach sowohl die S233- und die S259-vermittelte als auch die über beide 14-3-3-Bindestellen gleichzeitig vermittelte C-RAF/14-3-3-Wechselwirkung. Auf die aktivierende S621-vermittelte C-RAF/14-3-3-Wechselwirkung hat es keinen Einfluss, was durch FP und strukturbiologische Methoden belegt werden konnte. Zusammengefasst konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass die Stabilisierung der MLF1/14-3-3-Wechselwirkung pharmakologisch nicht sinnvoll ist. Die Stabilisierung der S233- und S259-vermittelten C-RAF/14-3-3-Wechselwirkung dagegen kann als pharmakologisch sinnvoll eingestuft eingestuft werden und ein erster Stabilisator, CNA, wurde identifiziert und sowohl biochemisch als auch strukturbiologisch charakterisiert. Die Untersuchungen zeigten, dass CNA die S233- und S259-vermittelten C-RAF/14-3-3-Wechselwirkungen sowohl einzeln als auch gleichzeitig stabilisieren kann, aber auf die aktivierende, S621-vermittelte C-RAF/14-3-3-Wechselwirkung keinen Ein- fluss hat.