Globale qualitative und quantitative Proteomanalyse mittels hochauflösender LC‐MS

Abstract

In der vorliegenden Arbeit konnten Methoden für qualitätsbasierte Proteomanalyse mittels hochauflösender LC-MS basierend auf niedrig komplexen Modellproteomen entwickelt und als solche für die quantitative Untersuchung von Mitochondrien der Bäckerhefe und auch von humanen Thrombozyten angewendet werden. Die Arbeitsabläufe in der Proteomanalyse wurden beginnend vom (1) proteolytischen Verdau, über (2) die chemische Markierungsstrategie iTRAQ zur Quantifizierung, (3) die Interferenz von Reporterionen-basierten Markierungsstrategien in der MS-Analyse mit der in dieser Arbeit entwickelten Methodik iQUARi untersucht und optimiert werden. (4) Die Erhebung von Proteinverhältnissen auf Basis von Peptidverhältnissen mittels verschiedener statistischer Ansätze wurde evaluiert und mit dem redescending M-estimator die optimale Auswertung für Reporterionenbasierten Markierungsstrategien gefunden. Weiterhin wurde (5) die Auswertung von proteomischen Datensätzen mit Hilfe der FDR untersucht und optimiert. Die Etablierung einer stabil-Isotopen markierten Kontrollmixtur ermöglichte das Monitoring der LC-MS Performance und erlaubte weiterhin die online Kontrolle von LF Experimenten. Die genannten Kontrollwerkzeuge ermöglichten die Optimierung diverser Arbeitsschritte der quantitativen Proteomanalyse, die weiterhin erfolgreich zur Untersuchung höher komplexer Proteome angewendet wurden. So konnte mit der Untersuchung des humanen Thrombozytenproteoms mit ca. 4000 Proteinen die derzeit umfassendste Studie dieses Primärgewebes realisiert werden. Die Analyse der Proteinvariabilität eines Spenders bzw. unabhängiger Spender zeigte in verschiedenen quantitativen Analysestrategien (iTRAQ, LF) nur geringfügige Abweichungen. Die Anwendung der metabolischen stabil-Isotopen Markierung (SILAC) ermöglichte die Charakterisierung des mitochondrialen Intermembranraumproteoms von S. cerevisiae, das bislang nicht wegen seiner Komplexität, aber aufgrund der selektiven Isolierung eine Herausforderung für die Proteomanalyse darstellte. Der quantitative Ansatz erlaubte die deutliche Definition von nun insgesamt 50 Komponenten des IMS neben intermediär auftretenden Proteinen. Abschließend konnten die IMS Proteine in biochemischen Studien verifiziert werden. Für die Analyse von Degradationsprozessen in Mitochondrien konnten Ansätze zur Kontrolle der Proteinmengen auf Ebene von Proteinen sowie von Peptiden etabliert werden. Vorläufige Ergebnisse der Konsensussequenzanalyse weisen auf funktionale räumliche Einheiten für den Wirkungsraum von Proteasen hin, die eine weitere, detailreiche Charakterisierung erfordern.

In the presented work, methods for quality based and quantitative proteome analysis using high resolution LC-MS were developed based on low complex model proteomes and applied to mitochondria (S.cerevisiae) and human platelets. (1) The proteolytic digest was quality controlled (QC) and optimized regarding efficiency, specificity, and reproducibility. (2) The stable isotope coded peptide standard was developed and allowed for online QC of LC-MS performance in LF experiments. (3) The iTRAQ workflow including statistical data interpretation was QC and optimized. (4) A method to assess interference in reporter ion based quantification strategies, iQUARI, was developed. (5) Moreover, the data evaluation of complex proteomic dataset was investigated and optimize using FDR. The developed strategies were successfully applied to investigate complex proteomes. The human platelet proteome could be characterized with ca. 4,000 proteins on a qualitative and quantitative level, revealing the most comprehensive and first quantitative study on this primary tissue. Focussing on the intra- and inter-protein variability with different quantitative strategies (iTRAQ, LF), the human proteome turned out to show a highly stable composition. The characterization of the mitochondrial intermembrane space proteome of S.cerevisiae was accomplished using SILAC in combination with a dedicated strategy including the pro-apoptotic protein BAX. Using this strategy 50 proteins could be localized unambiguously to the IMS and for 15 of 20 new IMS proteins the localization could be validated biochemically. For the analyses of degradation events in mitochondria two different strategies using LC-MS were developed to count for varying protein amounts over time. Preliminary results indicate functional and spatial unities accounting for regional protease activity and more detailed studies are necessary for characterization. To sum up, this work delivered new tools for quality control based, quantitative LC-MS analysis thereby providing new insights in sample composition of clinical high relevant patient samples, in heavily amenable organelle sub compartments and in high complex mechanisms of protein degradation.