Synthesis of glycopeptides for exploration of mucin‐type‐threonine and HexNAc‐tyrosine modifications

Abstract

Die Protein O-Glykosylierung ist eine biologisch sowie strukturell vielseitige Modifikation. Die mucinartige O-Glykosylierung an extrazellulären Mucinproteinen ist z.B. involviert in Zell-Zell- sowie Zell-Matrix- Interaktionen und spielt eine Schlüsselrolle bei Atemwegsinfektionen von COPD-, Mukoviszidose- und Asthmapatienten. Dabei dienen die O-Glykane als Rezeptoren für Virulenzfaktoren von atemwegserkrankungsrelevanten Pathogenen (Bakterien und Viren). Einblicke in die molekularen Details der Bindungsspezifitäten von Virulenzfaktoren wie Adhäsionsproteine (Lektine) oder Sialidasen würde die Entwicklung von glykomimetischen Antiadhäsionsmedikamenten und Enzyminhibitoren zur Infektionsbekämpfung unterstützen. Zudem wurde gezeigt, dass Adenokarzinomzellen (von z.B. Brust-, Darm-, Lungen- und Gebärmutterkrebs) veränderte Mucinglykosylierung sowie -expression aufweisen, was wiederum mit Tumorwachstum und Metastasierung in Verbindung gebracht wird. MUC1-basierte Vakzinkonstrukte gelten als vielversprechend, um eine tumorgerichtete Immunantwort zu induzieren, welche die Tumorlast schließlich beseitigen könnte. Ohne eine Bibliothek bestehend aus MUC1- Gklykopeptiden definierter Struktur jedoch, ist eine Qualitätskontrolle sowie eine präzise Aufklärung der induzierten Antikörper nicht möglich. Diese Arbeit konzentriert sich auf die Synthese einer wohldefinierten Peptidbibliothek (mit verlängerter Core 2- und Core 4-Glykosylierung) zur Anwendung in Microarrayexperimenten um schließlich Lektin/Glykopeptid- und Antikörper/Glykopeptidspezifitäten aufzuklären. Die so gewonnenen Informationen werden dabei helfen, die oben genannten Herausforderungen bzgl. Atemwegserkrankungs- und Krebsverlauf lösen. Darüber hinaus trug diese Arbeit zu Entwicklung einer neuen oxoniumionenbasierten, massenspektrometrischen Methode zur verbesserten Charakterisierung von Glykopeptidstrukturen bei. O-Glykosyierung wird üblicherweise auf Serin (Ser) oder Threonin (Thr) gefunden, jedoch zeigten jüngste Identifikationen, dass ähnliche Modifikationen auch auf Tyrosin (Tyr) stattfinden können. Diese Modifikationen werden durch Einführung einer HexNAc (GalNAc oder GlcNAc)-Gruppe an die jeweilige Aminosäure initiiert. Eine große Herausforderung war es bei den kürzlich entdeckten HexNAc-Tyrosin- Modifikationen zwischen den strukturell ähnlichen Isomeren αGalNAc-, αGlcNAc- und βGlcNAc-Tyr zu unterscheiden. Eine Zuordnung der Glykanstrukturen war nur möglich durch das generelle Wissen um Biosynthesewege oder beruhend auf bekannten Lektin/Glykan-Bindungspräferenzen zur Lektinaffinitätsanreicherung von Glykopeptidfragmenten. Jedoch sind die Lektinbindungspräferenzen ggü. HexNAc-Tyr bislang unerforscht. Zudem sind Lektine nicht immer in der Lage zwischen verschiedenen Glykanisomeren zu unterscheiden. In bisherigen Studien zum Glykoproteom wurde komplexe Tyr- Glykosylierung als mucinartige αGalNAc-Tyr-Modifikation betrachtet, basierend auf dem Wissen um Lektinspezifitäten ggü. Ser/Thr-Glykopeptiden und der Tatsache, dass mucinartige Glykopeptide generell um weitere Glykane verlängert vorliegen. αGlcNAc-Tyr, eine Modifikation, welche durch intrazelluläre Infektionen verursacht wird, wurde an Host-GTPasen gefunden. Eine Glykanzuordnung fand mittels enzymatischen In-Vitro-Studien sowie NMR-basierten Strukturbestimmungen statt. Weiter wurden im Rahmen einer umfangreichen Glykoproteom-Studie verschiedene HexNAc-Tyr-Modifikationen an mitochondriellen Proteinen gefunden, wobei einige der identifizierten Glykosylierungsstellen gleichzeitig bekannte Phosphorylierungsstellen darstellen. Daher handelt es sich bei diesen HexNAc-Tyr-Modifikationen wahrscheinlich um βGlcNAc-Tyr (obwohl diese Modifikation bis dato nicht verifiziert werden konnte). Um eine Identifikation von HexNAc-Tyr als mögliche Modifikation durch Glykoproteomanalysen zu ermöglichen, wurden Lektine, welche üblicherweise zur Glykopeptidaffinitätsanreicherung verwendet werden, hinsichtlich ihrer Bindungserkennung von HexNAc-Tyr und im Vergleich zu dessen Ser/Thr-Analoga, untersucht. Zu diesem Zweck wurde eine vielseitige Bibliothek bestehend aus HexNAc-Modellglykopeptiden synthetisiert, welche die Grundlage für Lektinbindungsstudien bildet. Der Beitrag von Glykopeptidstrukturelementen zur Erkennung durch üblicherweise zur Glykopeptidanreicherung verwendete Lektine (Vicia Villosa Agglutinin - VVA, Wheat Germ Agglutinin – WGA und Griffonia Simplicifolia Lectin II – GSL II) wurde durch Einsatz von Glykopeptidmicroarrays getestet. Dabei wurde der Einfluss von Glykan (αGalNAc/αGlcNAc/βGlcNAc), Akzeptoraminosäure (Tyr/Ser/Thr) sowie die Art der Glykanpräsentation (mono- vs divalent) untersucht. WGA und GSL II zeigten eine deutlichen Präferenz für Tyr-Glykopeptide ggü. Ser/Thr. Demgegenüber wurde keine solche Tyr-Präferenz für VVA gefunden. Das WGA-Lektin zeigte eine starke Bindung sowohl an GlcNAc-Tyr- als auch an GalNAc-Tyr-Glykopeptide und kommt somit für eine Strukturzuordnung von HexNAc-Tyr nicht in Betracht. Im Gegensatz dazu wurde für VVA eine hohe Spezifität für ausschließlich αGalNAc-Glykopeptide gefunden. GSL II erkannte sowohl αGlcNAc- als auch βGlcNAc-modifizierte Peptide. Für WGA wurde der Einfluss von divalenter Glykanpräsentation untersucht, wobei sich eine Abhängigkeit von der Peptidlänge zwischen den beiden Glykanen ergab. Generell resultierte eine Distanz von 2-5 Aminosäuren in erhöhter Glykopeptiderkennung. Zusammengenommen ermöglichen diese Ergebnisse eine verlässlichere Verwendung von Lektinen zum Zwecke der HexNAc-Tyr-Glykopeptidanreicherung. Des weiteren wurde die massenspektrometrische Oxoniumionenfragmentierung hinsichtlich ihrer Anwendbarkeit zur HexNAc-Tyr-Glykopeptididentifikation untersucht. Es zeigte sich, dass die Methode voll Anwendbar ist zur Unterscheidung von GalNAc vs GlcNAc, jedoch nicht zur Zuordnung der jeweiligen anomerischen Konfiguration. Das hier generierte Wissen über Lektinaffinitäten in Kombination mit der oxoniumionenbasierten Glykanidentifikation wird großangelegte Glykoproteomstudien ermöglichen, in welchen die Tyr-O-Glykosylierung mit in Betracht gezogen wird. Dies könnte schließlich zur Klärung der Frage beitragen, ob βGlcNAc-Tyr eine tatsächlich existierende Modifikation ist. Der ultimative Beweis für dessen Existenz wäre jedoch die Beobachtung einer Tyr-Spezifität ausgehend von den βGlcNAc-Biosyntheseenzymen O-GlcNAc-Transferase (OGT) und O-GlcNAcase (OGA). Entsprechende, in dieser Arbeit durchgeführte Inkubationen von Glykopeptid-Substratkandidaten mit OGA ergaben eine deutliche OGA-Präferenz ggü. βGlcNAc-Tyr-Substraten im Vergleich zu Ser/Thr-Analoga. Entsprechende Inkubationen mit OGT verliefen bislang ergebnislos und benötigen weitere Untersuchungen.

Protein O-glycosylation is a structurally and biologically versatile modification. The mucin-type O- glycosylation on extracellular mucin proteins is for instance involved in cell-cell and cell-matrix interactions, and play key roles in airway inflammations of COPD, asthma and cystic fibrosis patients by serving as binding receptors for virulence factors of airway disease-related pathogens (bacteria and viruses). Insights into molecular details in the binding specificities of virulence factors like adhesion proteins (lectins) or sialidases would support the development of glycomimetic antiadhesive drugs or enzyme inhibitors to suppress infections. Moreover, adenocarcinoma cells (from for instance breast, colon, lung and ovary cancer) have been found to exhibit altered mucin glycosylation and expression levels, which has been related to tumor progression and metastasis. MUC1-based vaccine constructs have been identified as promising for induction of a tumor-directed immune response, which in consequence might eradicate the tumor burden. However, without a structurally defined MUC1 glycopeptide library, a quality control and a precise epitope mapping of the induced antibodies is not possible. This work focuses on the synthesis of a well-defined peptide library (including extended core 2 and core 4 glycosylation) for application in microarray experiments to map lectin/glycopeptide and antibody/glycopeptide binding specificities. The gained information will aid to tackle the above- described challenges in airway disease and cancer progression. Further, this work contributed in the development of a new oxonium ion-based mass-spectrometric methodology for improved structural characterization of glycopeptides. O-glycosylation is commonly found on serine (Ser) or threonine (Thr), but recent identifications suggest that similar modifications also occur on tyrosine (Tyr). These modifications are initiated by addition of a HexNAc (GalNAc or GlcNAc) monosaccharide residue to the respective amino acid. A major challenge for identification of the recently discovered HexNAc-Tyr modifications was to distinguish the structural similar isomers αGalNAc-, αGlcNAc- and βGlcNAc-Tyr. Assignments of the glycan structures were only possible by general knowledge of biosynthetic pathways or being based on lectin glycan-binding preferences when applied in lectin-affinity enrichment of protein-digested peptide fragments. However, lectin binding-preferences of HexNAc-Tyr have not been explored and lectins are not always capable to discriminate between different glycan isomers. In previous glycoproteomic studies complex Tyr glycosylation was assumed as mucin type αGalNAc-Tyr modification, based on knowledge of lectin specificity to Ser/Thr glycopeptides and the fact that mucin-type glycopeptides are generally extended with additional glycans. The αGlcNAc-Tyr was found on host GTPases, a modification caused by intracellular infections and was assigned by enzymatic in vitro studies and NMR structural characterization. Further, in an extensive glycoproteomic study several HexNAc-Tyr modifications were found on mitochondrial proteins and some of the identified sites are also known phosphorylation sites. Therefore, the identified HexNAc-Tyr modifications were likely to be βGlcNAc-Tyr (although to date this modification is still not verified). In order to enable identification of HexNAc-Tyr as a possible modification by glycoproteomic analysis, lectins commonly used for glycopeptide affinity enrichment were evaluated towards binding recognition of HexNAc-Tyr glycopeptides compared to Ser/Thr analogs. To this extent, a versatile library of HexNAc model glycopeptides was synthesized, providing the basis for the lectin binding studies. The contribution of structural elements towards recognition by lectins commonly used for glycopeptide enrichment (Vicia villosa agglutinin - VVA, Wheat germ agglutinin - WGA and Griffonia simplicifolia lectin II - GSL II) was tested by using glycopeptide microarrays. The binding recognition influence of glycan (αGalNAc/αGlcNAc/βGlcNAc), acceptor amino acid (Tyr/Ser/Thr) and mono vs divalent glycan presentation was evaluated. The WGA and GSL II lectins showed a clear preference for Tyr glycopeptides over Ser/Thr. In contrast no clear Tyr preference was found for VVA. The WGA lectin showed strong binding to both GlcNAc- and GalNAc-Tyr glycopeptides and could not be considered for structural assignment of HexNAc-Tyr glycopeptides. In contrast VVA was highly specific for αGalNAc-containing glycopeptides and GSL II recognized both αGlcNAc- and βGlcNAc modified peptides. In analysis of WGA the impact of divalent glycan presentation was evaluated and found to be dependent on the peptide spacing between the glycans. A distance of 2-5 amino acids resulted in a generally enhanced recognition. Taken together, these results will enable a more reliable application of lectins for HexNAc-Tyr glycopeptide enrichment. Further, mass spectrometric oxonium ion fragmentation was elucidated for applicability towards HexNAc-Tyr glycopeptide identification. The methodology was found to be fully applicable for discrimination of GalNAc vs GlcNAc epimers, but not for assignment of the anomeric configuration. The knowledge about lectin affinities in combination with the oxonium-based glycan identification will enable large-scale glycoproteomic studies taking account of Tyr O-glycosylation, which eventually might help to clarify, whether βGlcNAc-Tyr is actually an existing modification. However, the ultimate proof of existence of the modification would be the observation of Tyr-specificity by the βGlcNAc biosynthetic enzymes O-GlcNAc transferase (OGT) and O-GlcNAcase (OGA). Accordingly, selected peptides and glycopeptides were used as substrate candidates for OGT and OGA. Thereby, OGA showed a clear preference for βGlcNAc-Tyr substrates over Ser/Thr analogs. The OGT substrate studies were inconclusive and needs further evaluation.