Authors: Durek, Thomas
Title: Semi-synthesis and biological evaluation of prenylated Rab proteins
Language (ISO): en
Abstract: Native chemical ligation (NCL) and the related technique, expressed protein ligation(EPL), have been extremely useful for the synthesis of various proteins in the past. Inparticular the concept of EPL elegantly demonstrates the usefulness of combiningthe fields of chemistry and biology in order to address complex physiological andbiochemical questions.The present study aimed at adapting the EPL methodology to the semi-synthesis ofprenylated Rab proteins, which exert many important functions during vesiculartransport in eukaryotic cells. To this end, short prenylated peptides, which werechemically synthesized by our collaborators from Prof. Waldmann´s lab at theMPI-Dortmund, were coupled site-specifically to the C-terminus of truncated Rabproteins. During this work some interesting and thus far unknown aspects of thisreaction were observed. First, the EPL reaction with prenylated peptides was foundto be strictly dependent on the presence of certain detergents. Although the role ofthese detergents in the ligation reaction remains elusive, one could hypothesize thatthey function as micellar catalysts. The micellar reaction media could prove useful inthe future for the synthesis and solubilization of very hydrophobic polypeptidesegments such as integral membrane protein domains. Secondly, Rab thioestersterminating in glutamine or asparagine seem to be prone for side reactions, whichprobably involves the formation of cyclic imides. These side products were found tobe capable of reacting with prenylated peptides under the typical reaction conditions.These studies also clearly point out the restrictions of applying chemical methods tothe solution of biological problems, namely the necessity to work in an aqueousenvironment in order to preserve the solubility and the functional state of biologicalmacromolecules. Although the remarkable solvent incompatibility of the Rab proteinsand the examined prenylated peptides could be overcome, the employed conditionsgave rise to protein denaturation. Eventually, the prenylated Rab proteins could be 'revived' by an in vitro refolding approach. The obtained semi-synthetic proteins werecomplexed to specific interacting proteins, such as RabGDI, REP-1 and GGTase-II,indicating, that the Rab proteins indeed adopted the correctly folded state. This wasfurther confirmed by GGTase-II activity assays.Using this approach, for the first time both single prenylated Rab proteins,representing the genuine intermediates of the GGTase-II catalyzed prenylation reaction, were obtained. The interaction of these single prenylated Rabs withGGTase-II was further explored by taking advantage of fluorophores incorporatedinto the synthetic prenylated peptides. Different fluorophore attachment sites weretested in order to study the consequences of the fluorophore incorporation on thefunction of the GTPase. The obtained results could show, that the single prenylatedproteins are tightly bound to GGTase-II with dissociation constants (Kd) in the lowernanomolar range. Furthermore, the determined dissociation rate constants (koff) ofthis interaction revealed, that dissociation of the single prenylated intermediate is notrequired for Rab double prenylation.The introduced fluorophore could also be utilized for the time-resolved monitoring ofthe prenylation reaction. Under conditions permitting only a single enzymaticturnover, the rates of the second prenyltransfer reaction were determined, which arein excellent agreement with values recently reported in the literature. The obtaineddata indicate, that the tighter bound single prenylated reaction intermediate is alsofaster converted to the double prenylated product. This suggests, that GGTase-II hasevolved an active site that clearly prefers one of the two possible reactionintermediates for the second round of prenylation (namely that intermediate, which isprenylated on the C-terminal cysteine residue). Together with the results of previousstudies these observations imply, that at least in the case of Rab7 the majority ofproteins proceed to double prenylation by acquiring the first isoprenoid on theC-terminal cysteine residue followed by geranylgeranylation of the upstream cysteineresidue.Another major aim of the present study was to provide multi-milligramm amounts ofsemi-synthetic and prenylated Rab proteins in complex with various interactingproteins for crystallographic studies. Out of six complexes tested in crystallizationtrials, two were crystallized and the structures were determined to very highresolutions (1.5 Å and 1.4 Å). The obtained structures of the single and doublyprenylated Ypt1:RabGDI complexes permit important insights into the mechanisms ofRabGDI mediated Rab membrane extraction and delivery and a plausibleexplanation for the GDP dissocation inhibitory effect.In conclusion, the developed EPL approach seems to be perfectly suited for thegeneration of homogenously prenylated Rab proteins in large quantities (i.e. severalmilligram). The outlined protocols are easy to perfom and should permit theproduction of functionalized Rab proteins on a routine basis. The proteins generated in such a manner were demonstrated to be valuable tools forbiochemical and biophysical studies.
Native chemical ligation (NCL) und die verwandte Technik Expressed ProteinLigation (EPL) haben sich in der Vergangenheit als äußerst nützlich für die Synthesevon verschiedenen Proteinen erwiesen. Insbesondere das Konzept der EPLdemonstriert auf elegante Weise die Nützlichkeit einer Kombination von Chemie undBiologie, um komplexe biochemische und physiologische Fragestellungen zubeantworten.Das Ziel der vorliegende Arbeit war es, die EPL Methode für die Semisynthese vonprenylierten Rab Proteinen zu entwickeln. Rab GTPasen haben eineSchlüsselfunktion bei der Kontrolle des intrazellulären vesikulären Transportes ineukaryotischen Zellen. Die posttranslationale Modifikation von zwei Cysteinen mit jeeinem hydrophoben Lipid (Prenylierung) im C-terminalen Bereich der Rab Proteinewird von der Geranylgeranyltransferase II (GGTase-II) katalysiert und ist essentiell,um den Rab Proteinen die Ausübung ihrer Funktionen zu ermöglichen.Im Rahmen dieser Arbeit wurden kurze, geranylgeranylierte (C20 isoprenoideVerbindung) Peptide mit Hilfe der EPL spezifisch C-terminal an verkürzte Rab Proteinα-Thioester gekuppelt. Bei diesen Studien wurden einige interessante (und bis datonicht beschriebene) Aspekte dieser Reaktion beobachtet. Es konnte festgestelltwerden, dass die erfolgreiche Synthese der lipidierten Peptid-Protein-Konjugate dieVerwendung bestimmter Additive, insbesondere von Detergenzien, vorraussetzte.Obwohl die Wirkungsweise der Detergenzien bei der Reaktion nicht eindeutigbestimmt werden konnte, lässt sich dennoch vermuten, dass sie als mizellareKatalysatoren fungieren. Diese Erkenntnisse könnten sich in Zukunft bei derSynthese von anderen (integralen) Membranproteinen als nützlich erweisen.Desweiteren konnte beobachtet werden, dass Rab Protein α-Thioester zuNebenreaktionen neigen, wenn es sich bei der C-terminal aktivierten Aminosäure umAsparagin oder Glutamin handelt. Diese Nebenreaktionen führen zur Zyklisierung derC-terminalen Aminosäure. Die entstandenen Imide konnten interessanterweise unterden typischen EPL Bedingungen mit prenylierten Peptiden umgesetzt werden.Die durchgeführten Untersuchungen zeigen auch die Einschränkungen einerAnwendung chemischer Methoden auf die Beantwortung biologischerFragestellungen auf, insbesondere die Notwendigkeit in wässrigen Lösungsmittel zuarbeiten, um die Löslichkeit und den funktionalen Zustand biologischer Makromoleküle zu erhalten. Obwohl die bemerkenswerte Lösungsmittelinkompatibilitätder Rab Protein α-Thioester und der untersuchten prenyliertenPeptide gelöst werden konnte, so führten die angewandten Bedingungen dennochzur Denaturierung der Proteine. Die Rückfaltung der lipidierten Rab Proteine konntein dieser Studie zum ersten Mal erfolgreich durchgeführt werden. Die erhaltenensemisynthetischen Rab Proteine sind biologisch aktiv und konnten mit bekanntenInteraktionspartnern komplexiert werden (z.B. mit RabGDI, REP-1, GGTase-II).Das ausgearbeitete Verfahren erlaubte zum ersten Mal die Generierung von einfachprenylierten Rab Proteinen, die als Intermediate bei der GGTase-II katalysiertenPrenylierungsreaktion kurzzeitig auftreten. Mit Hilfe der Fluoreszenzspektroskopieund Fluoreszenzmarkern, die in die synthetischen Peptide eingebaut wurden, konntedie Wechselwirkung dieser Intermediate mit der GGTase-II detailiert studiert werden.Die erhaltenen Dissoziationskonstanten (die diese Interaktion beschreiben) konntenzeigen, dass die Intermediate sehr fest an die GGTase-II gebunden sind. Mit Hilfeder ebenfalls bestimmten Geschwindigkeitskonstanten der Dissoziation konntedarüberhinaus ein Modell entwickelt werden, nach dem eine Dissoziation der einfachprenylierten Intermediate im Verlauf der Rab Doppelprenylierungsreaktion nichtzwangsläufig stattfinden muss.Die eingeführten Fluoreszenzmarker ermöglichten ferner die Zeit aufgelösteBeobachtung des enzymatischen Umsatzes der einfach prenylierten Intermediatezum doppelprenylierten Produkt. Die Daten lassen darauf schliessen, dass dieGGTase-II eine klare Präferenz für eines der zwei möglichen Reaktionsintermediateaufweist. Zumindest im Falle von Rab7 scheint demnach die Mehrheit der Proteinezuerst C-terminal prenyliert zu werden, gefolgt von der Modifizierung des internlokalisierten Cysteins.Ein weiteres Ziel der vorliegenden Arbeit war die Generierung von prenylierten RabProteinen im Multimilligramm Maßstab für kristallografische Studien. Auch in diesemFall wurden die semisynthetischen Rab Proteine an Interaktionspartner komplexiert.Sechs Komplexe konnten im präparativen Maßstab gewonnen werden, von denenzwei erfolgreich kristallisiert werden konnten. Die Strukturen der einfach und doppeltprenylierten Rab:RabGDI Komplexe wurden mit hoher Auflösung bestimmt undermöglichten erstmals einen strukturellen Einblick in die Funktion von RabGDI.Zusammenfassend kann gesagt werden, dass das entwickelte EPL Verfahren idealerscheint, um homogen prenylierte Rab Proteine in preparativer Menge zu erhalten. Die ausgearbeiteten Protokolle sind leicht durchführbar und sollten die routinemäßigeProduktion von unterschiedlich funktionalisierten Rab Proteinen ermöglichen. DieNützlichkeit solcher Proteine konnte in dieser Arbeit mit Hilfe von biochemischen undbiophysikalischen Studien demonstriert werden.
Subject Headings: expressed protein ligation
Rab
prenylation
protein semisynthesis
GDI
URI: http://hdl.handle.net/2003/5571
http://dx.doi.org/10.17877/DE290R-8022
Issue Date: 2004-10-19
Publisher: Universität Dortmund
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