Authors: Akhrymuk, Alena
Title: Studies on the interaction between the molecular chaperone DnaK and Nucleotide exchange factor GrpE from Thermus thermophilus
Language (ISO): en
Abstract: In lebenden Zellen benötigen Proteine molekulare Chaperone um Aggregation zu vermeiden. Das molekulare Chaperon DnaK aus T.thermophilus gehört zur Hsp70-Familie. Hsp70-Proteine bestehen aus einer hochkonservierten N-terminalen ATPase-Domäne und einer weniger konservierten C-terminalen Peptidbindungsdomäne. DnaK wechselt zwischen einem ADP-gebundenen hochaffinen Zustand, in welchem ungefaltete Substrate fest gebunden werden und einem ATP-gebundenen niedrigaffinen Zustand, in welchem ungefaltete Substrate schwach gebundenen werden. GrpE dient als Nukleotidaustauschfaktor, indem es die Freisetzung von ADP durch Austausch von ATP ermöglicht. Mit Hilfe von GrpE wird DnaK vom ADP- in den ATP-Zustand zurückgewandelt. Das GrpE-Protein bildet in Lösung Dimere, deren Struktur in drei Regionen eingeteilt werden können: die gepaarten N-terminalen ?-Helices, ein Bündel aus vier Helices und die C-terminalen Domänen. Gemäß der Ausbeute an regenerierter Enzymaktivität durch das DnaK-ClpB-System haben wir herausgefunden, dass Harnstoff-denaturierte Lactatdehydrogenase (LDH) aus S.scrofa (Schwein) Muskel und Hitze-deaktivierte LDH aus B.stearothermophilus die passenden Modellsubstrate für das DnaK-ClpB-Chaperon-System von T.thermophilus sein könnten. Unter Verwendung der Fluoreszenz-Korrelationspektroskopie-Technik wurde beobachtet, dass GrpE-Wildtyp sowohl den DnaK-ADP als auch den DnaK-Peptid-Komplex bindet. Dieses Ergebnis führte uns zu der Annahme, dass GrpE nicht nur eine Rolle im Nukleotidaustausch spielt, sondern auch an der Stimulation der Substratfreisetzung beteiligt ist. In der vorliegenden Arbeit berichten wir zum ersten Mal, dass GrpE-Wildtyp mit DnaK in der ATP-gebundenen Form interagiert. Es wurde auch zum ersten Mal beobachtet, dass eine kovalente Bindung zwischen der ATPase- und Peptidbindungsdomäne von DnaK für die Wechselwirkung zwischen DnaK und GrpE wahrscheinlich nicht notwendig ist. In der vorliegenden Arbeit wurde weiterhin der Einfluss der N-terminalen ?-Helices von GrpE (GrpE(?C)) auf die Wechselwirkung mit DnaK bestimmt. Untersuchungen der Wechselwirkung zwischen GrpE(?C) und DnaK unter Verwendung von Ni-NTA-Säulen und C8-gekoppelter ATP-Agarose haben ergeben, dass der ?-helikale Teil von GrpE spezifisch an DnaK bindet. Diese Spezifität wird durch die Art des an die ATPase-Domäne gebundenen Nukleotids bestimmt. In Anwesenheit von ADP bindet GrpE(?C) an DnaK während diese Wechselwirkung zwischen den Proteinen in der Anwesenheit von ATP nicht beobachtet wurde. Dieses Ergebnis impliziert, dass ATP eine Änderung der Konformation von DnaK bewirkt, indem die Bindung zum ?-helikalen Teil von GrpE gelöst wird. Daher ist es möglich, dass ATP nicht nur die Substrataffinität von DnaK bestimmt, sondern auch die Bindung des N-terminalen Teils an GrpE reguliert. Eine andere Erklärung für die Auflösung der GrpE(?C)-DnaK-Wechselwirkung in Anwesenheit von ATP basiert auf zwei durch die Verwendung der Fluoreszenz-Korrelationspektroskopie-Technik erhaltenen Beabachtungen: 1.) einzelne ATPase-Domänen und Peptidbindungsdomänen von DnaK können trotz fehlender kovalenter Bindung in Anwesenheit von GrpE miteinander wechselwirken; 2.) der GrpE-Wildtyp interagiert in Anwesenheit von ATP mit DnaK. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass die GrpE-?-Faltblattdomäne den ATP-gebundenen Zustand von DnaK erkennt, worauf eine Signalweitergabe an die Peptidbindungsdomäne von DnaK über das lange ?-Helix-Ende von GrpE erfolgt, welches eine Bewegung der Peptidbindungsdomäne weg vom GrpE-?-Helix-Teil stimuliert. Unter Verwendung von Lactatdehydrogenase aus Schweinemuskel als Modellsubstrat für die Bindung an DnaK haben wir Beweise dafür gefunden, dass der ?-helikale Teil von GrpE mit dem Substrat um die DnaK-Peptidbindungsdomäne konkurriert. Dieses bietet einen guten Ausgangspunkt zur Erklärung des Mechanismus, durch welchen GrpE(?C) möglicherweise die Substratfreisetzung von DnaK stimuliert. Basierend auf den erhaltenen Ergebnissen wurde ein Mechanismus für die Regulierung des DnaKTth-Chaperon-Zyklus auf Ebene der DnaKTth-GrpETth-Wechselwirkung postuliert.
In the living cell, proteins need molecular chaperones to prevent off pathway folding. The molecular chaperone DnaK from T.thermophilus belongs to the Hsp70 family. Hsp70 proteins are composed of a highly conserved N-terminal part that comprises the ATPase domain and a less conserved C-terminal peptide binding domain. DnaK cycles between an ADP-bound, high affinity state that tightly binds unfolded substrate and ATP-bound, low affinity state that weakly binds unfolded substrate. GrpE serves as a nucleotide exchange factor, facilitating the release of ADP in exchange for ATP. With the assistance of GrpE, DnaK is re-converted from the ADP-state into the ATP-state. The GrpE protein forms dimers in solution and its structure could be divided into three regions: paired N-terminal ?-helices, four helix bundles, and the C-terminal domains. According to the yield of recovery of enzymatic activity mediated by the DnaK-ClpB system we found that urea-denatured Lactate dehydrogenase (LDH) from S.scrofa (pig) muscle and heat-inactivated LDH from B.stearothermophilus could be suitable model substrates for the DnaK-ClpB chaperone system from T.thermophilus. Using the fluorescence correlation spectroscopy technique it was observed that GrpE wild type binds to a DnaK-ADP and DnaK-peptide complex. These results lead us to suggest that GrpE plays a role not only in nucleotide exchange but that it is also involved in stimulation of a substrate release. In this thesis we reported for the first time that GrpE wild type interacts with DnaK in the ATP-bound form. It was also observed for the first time that a covalent link between the ATPase and peptide binding domain of DnaK is likely not important for the interaction between DnaK and GrpE. In this work the contribution of the ?-helical part of GrpE (GrpE(?C)) to interactions with DnaK was defined. Investigations of the interaction between GrpE(?C) and DnaK using Ni-NTA columns and C8-coupled ATP-agarose revealed that the ?-helical part of GrpE binds specifically to DnaK. The specificity is related to the nature of nucleotide bound to the ATPase domain of DnaK. In the presence of ADP GrpE(?C) binds to DnaK while in the presence of ATP the interaction between these proteins was not observed. This finding implies that ATP induces a conformational change in DnaK in such a way to abolish binding of the ?-helical part of GrpE. Therefore it is possible that ATP determines not only the substrate affinity of DnaK but it also regulates binding of the N-terminal ?-helical tail of GrpE. Another explanation of the disruption of GrpE(?C)-DnaK interactions in the presence of ATP is based on two observations obtained using the fluorescence correlation spectroscopy technique: (1) the single ATPase domain and peptide binding domain of DnaK lacking a covalent link are able to interact in the presence of GrpE; (2) GrpE wild type interacts with DnaK in the presence of ATP. These findings imply that the GrpE ?-sheet domain recognises the ATP-bound state of DnaK followed by signal transduction into the peptide binding domain of DnaK via the GrpE long ?-helical tail which stimulates movement of the peptide binding domain away from the GrpE ?-helical part. Using urea-denatured Lactate dehydrogenase from S.scrofa muscle as a model substrate bound to DnaK, we found evidence that the ?-helical part of GrpE competes with the substrate for the DnaK peptide binding domain. It represents a very good framework for defining the mechanism by which GrpE(?C) could possibly stimulate substrate release from DnaK. Based upon all these observations, a mechanism for regulation of the DnaKTth chaperone cycle on the level of the DnaKTth-GrpETth interactions was postulated.
Subject Headings: folding
Chaperone
protein
interaction
URI: http://hdl.handle.net/2003/2501
http://dx.doi.org/10.17877/DE290R-12420
Issue Date: 2004-07-09
Publisher: Universität Dortmund
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