Biochemische und strukturbiologische Untersuchungen der HIV/SIV Nef-vermittelten Rezeptoreninternalisierung

Abstract

Das akzessorische Nef-Protein ist ein wichtiger Pathogenitätsfaktor von HIV und SIV, den Immundefizienzviren der Primaten. Nef erhöht u.a. die Produktion viraler Partikel, es erleichtert die Knospung neuer Viren von der Wirtszellmembran und es schützt die Wirtszelle vor Superinfektionen und der Erkennung durch das Immunsystem. Auf Proteinebene lassen sich die meisten Nef-vermittelten Effekte auf die Wechselwirkung mit Proteinen der zellulären Signaltransduktionskaskaden oder des intrazellulären Proteintransportsystems zurückführen. Als molekularer Adapter ohne enzymatische Aktivität bringt Nef Wirtsproteine in funktionalen Einheiten zusammen und kann so Einfluss auf mehrere unterschiedliche zelluläre Systeme nehmen. Hierfür verfügt Nef über eine Reihe konservierter Sequenzmotive, welche die Wechselwirkung mit verschiedenen zellulären Proteinen vermitteln. Nef verfügt u.a. über ein PxxP-Motiv zur Interaktion mit der SH3-Domäne von Tyrosinkinasen und über ein Dileuzinmotiv für die Bindung an die heterotetrameren Adaptorproteine der AP-Familie. Alle Funktionen von Nef erfordern die Membranlokalisierung des Proteins, welche durch eine N-terminale Myristoylierung vermittelt wird. Die Depletion von Oberflächenrezeptoren der T-Helferzellen, wie CD4 und MHC I, zählt zu den wichtigsten Funktionen von Nef. Zudem scheint ein wesentlicher funktionaler Unterschied zwischen pathogenen und nicht-pathogenen HIV- und SIV-Stämmen in der Fähigkeit von Nef zu liegen, die CD3 ζ-Untereinheit des T-Zell-Rezeptors zu internalisieren. Viren, die über diese Eigenschaft verfügen, lösen in ihren natürlichen Wirten keine Immundefizienz aus. Um die Internalisierung eines Rezeptors einzuleiten, erkennt Nef bestimmte Signalmotive in der zytoplasmatischen Domäne des Rezeptors. Infolge dieser Wechselwirkung rekrutiert Nef die AP-Komplexe, was den Transport in Clathrin-beschichteten Vesikeln und die anschließende lysosomale Degradation des Rezeptors einleitet. In der vorliegenden Arbeit sollten die Mechanismen der Nef-vermittelten Rezeptorinternalisierung durch strukturbiologische und biochemische Studien auf molekularer Ebene untersucht werden. Es wurde eine Kristallstruktur von HIV-1SF2 Nef im Komplex mit einer SH3-Domäne erstellt, in der erstmals die gesamte flexible Schleife von Nef, welche das für die Rekrutierung der AP-Komplexe wichtige Dileuzinmotiv beinhaltet, aufgelöst wurde. Die Schleifen zweier Nef-Proteine binden in dieser Struktur wechselseitig in die hydrophobe Tasche des jeweils anderen Nef-Moleküls. Die hydrophobe Tasche von Nef ist für die Erkennung von Signalmotiven in Membranrezeptoren verantwortlich. Somit zeigt diese Struktur potentiell eine in trans autoinhibierte Konformation des Nef-Proteins. Des Weiteren wurde eine Kristallstruktur von SIVmac239 Nef erstellt, in welcher das Dileuzinmotiv eines Nef-Proteins mit der hydrophobe Tasche eines zweiten Nef-Moleküls interagiert. Diese hier vorgestellte Struktur stellt das erste Modell für die Erkennung von Dileuzinmotiven durch Nef dar. Dileuzinmotive treten in einer Vielzahl von Membranrezeptoren wie CD4 auf und können durch Nef im Zuge der Nef-abhängigen Internalisierung dieser Rezeptoren erkannt werden. Durch analytische Größenausschlusschromatographie und isothermale Titrationskalorimetrie wurde die Bindung von HIV-1SF2 und SIVmac239 Nef an unterschiedlichen Fragmente der CD3 ζ-Untereinheit und an SH3-Domänen untersucht und die Bindungsaffinitäten bestimmt. Es konnte gezeigt werden, dass die Bindung der SH3-Domänen unabhängig vom myristoylierten N-Terminus von HIV-1SF2 Nef ist. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Interaktion mit CD3 ζ nicht durch die gleichzeitige Bindung von SIVmac239 Nef an SH3-Domänen beeinflusst wird. SH3-Domänen interagieren mit ihrer RT-Schleife, wie die Signalmotive von Membranrezeptoren, mit der hydrophoben Tasche von Nef. Da eine gleichzeitige Bindung von CD3 ζ und SH3-Domänen möglich ist, muss die hydrophobe Tasche von Nef zwei voneinander unabhängige Bindungsstellen aufweisen. Durch die in dieser Arbeit bestimmten Kristallstrukturen konnte gezeigt werden, dass die sogenannte hydrophobe Tasche von Nef durch die Seitenketten der aromatischen Aminosäuren Phenylalanin und Tryptophan (HIV), bzw. Tyrosin (SIV), in zwei Taschen geteilt ist, von denen eine mit der RT-Schleife der SH3-Domänen und die andere mit Transportsignalmotiven interagiert. Diese hier identifizierten hydrophoben Taschen könnten als Angriffspunkt für die Entwicklung von Nef-gerichteten antiretroviralen Wirkstoffen dienen. Um die Bindung von Nef an die Proteinkomplexe der AP-Familie zu untersuchen, wurden die Kernstrukturen der heterotetrameren Proteinkomplexe AP-1 und AP-2, sowie eine Reihe Mutanten dieser Komplexe rekombinant exprimiert und isoliert. Diese Proteine sollen in künftigen biochemischen und strukturbiologischen Untersuchungen eingesetzt werden, um das Bindungsverhalten von Nef an die AP-Komplexe zu untersuchen.