The response of biophysical model systems to high pressure conditions

Abstract

Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden zahlreiche Studien an verschiedenen Biomolekülen, wie zum Beispiel Proteinen, Lipiden und Mischungen beider Substanzklassen, mit Hilfe von Röntgen- und Neutronenstreutechniken untersucht. Die Methode der Röntgenkleinwinkelstreuung (SAXS) wurde wiederholt genutzt, um p, T-Phasendiagramme verschiedener Probensysteme zu bestimmen. Zeitaufgelöste Röntgenkleinwinkelstreuung (trSAXS) in Kombination mit der Drucksprung-Relaxationsmethode ermöglichte es die Kinetik von Phasenübergängen in biologisch relevanten Systemen zu untersuchen. Weiterhin wurden die Techniken der Röntgenreflektometrie (XRR) und der Röntgendiffraktion unter streifendem Einfallswinkel (GIXD) genutzt, um entsprechende molekulare Monofilme an der Luft-Wasser-Grenzfläche zu untersuchen. Zu allererst wurde die Entwicklung einer neuartigen Hochdruck-Neutronenreflektometrie-Probenzelle, ausgelegt für Drücke bis zu 2.5 kbar (250 MPa) in einem Temperaturbereich von 5 °C bis 75 °C, beschrieben. Der hohe Maximaldruck in Kombination mit dem vergleichsweise kleinen Volumen benötigter Probenlösung macht diese Hochdruckzelle hochgeeignet zur Untersuchung von druckinduzierten Strukturänderungen von an Grenzflächen adsorbierten Proteinen, Lipidmembranen und allgemeiner, von biomolekularen Systemen, die nur in geringen Mengen zur Verfügung stehen. An zwei verschiedenen Protein-Systemen wurden Studien mittels Hochdruck- Röntgenkleinwinkelstreuung durchgeführt: • der Effekt von Hochdruck und dem pH-Wert der Lösung auf die Struktur der hochstabilen Staphylokokken Nukleasen-Variante, Δ+PHS. Zusätzlich wurde die Aminosäure Val-66, die sich im hydrophoben Kern des Proteins befindet, durch jeweils eine der Aminosäuren Ala, Tyr, Lys oder Arg ersetzt, um zu erforschen, wie Veränderungen des Volumens und der Polarität im Inneren des Proteins die native Konformation und die Stabilität des Proteins beeinflussen. Die äußere Partikelform wurden mittels verschiedener ab initio-Methoden berechnet. • der Effekt von Temperatur und Druck auf die Stabilität des dimeren Proteins MsP1, welches sich nicht nur als sehr temperaturstabil bis zu Temperaturen von 65 °C, sondern auch als sehr druckbelastbar erwies – weit über den in der Hochdruck-Kleinwinkelstreuung angewendeten Maximaldruck von 3 kbar hinaus. p, T-Phasendiagramme verschiedenster Probensysteme wurden ermittelt – typischerweise in einem Temperaturbereich zwischen 5 °C und 75 °C sowie für Drücke bis zu 4 kbar. Des Weiteren wurden häufig die jeweiligen Phasenübergangskinetiken sowie die zugrunde liegenden Mechanismen der Phasenübergänge mittels zeitaufgelöster Kleinwinkelstreuung bestimmt: • eine Mischung aus dem lang-kettigen Lipid DMPC und dem kurz-kettigen Lipid DHPC, welche im Bereich geringer Temperaturen und Drücke zylinderförmige Mizellen, sogenannte Bizellen, bildet. Im mittleren Temperatur und Druckbereich zeigt es ausgedehnte, röhrenartige Mizellen und schließlich bei hohen Temperaturen wird eine lamellare Phase gebildet, die aus perforierten, multilamellaren Vesikeln besteht. Zusätzlich konnte im Bereich hoher Drücke über 5 kbar eine bislang unbekannte, geordnete, lamellare Phase gefunden werden, bei der die Lipidketten der gegenüberliegenden Lipidmonoschichten ineinander verschränkt vorliegen. • pures Monoolein mit einem Hydratisierungsgrad von 17%wt, welches bei sehr niedrigen Temperaturen und hohen Drücken eine geordnete lamellare Phase ausbildet, bei etwas erhöhten Temperaturen 196 Summary & Zusammenfassung in eine ungeordnete lamellare Phase übergeht und schließlich bei hohen Temperaturen eine bikontinuierliche kubische Ia3d Phase zeigt. • verschieden Monoolein-Proben, die jeweils 2%wt eines der drei Fusionspeptide (HA2, VSV, TBEV) oder der Transmembran-Domäne (TMD VSV) enthielten, was jeweils das Phasenverhalten und die Phasenübergangskinetik des Lipidsystems deutlich beeinflusste. Zusätzlich wurde der Effekt eines Kontrollpeptides (L16) untersucht, das nahezu keinen Einfluss auf das Phasenverhalten von Monoolein zeigte. Die Ergebnisse bieten wertvolle Informationen über den Effekt von Fusionspeptiden auf die Biegsamkeit und Elastizität von Membranen. • eine Mischung des Phospholipides DPPC mit 22%mol des Pilzsteroids Ergosterol als ein Modellsystem für eine heterogene Pilz-Plasmamembran. • und schließlich eine heterogene Lipid-Raftmischung, bestehend aus den Lipiden DOPC und DPPC sowie dem Steroid Cholesterol im molaren Verhältnis 1:2:1, welches eine ausgedehnte Phasenregion von flüssig-geordneten Domänen, sogenannten “Rafts” in einer flüssig-ungeordneten Lipidmatrix im physiologisch wichtigen Temperaturbereich zwischen 20 °C und 45 °C zeigte. Zuletzt wurden noch eine Reihe von reinen Lipidmonofilme sowie die Wechselwirkung von Peptiden mit Lipidmonofilmen an der Luft-Wasser-Grenzfläche mittels XRR und GIXD untersucht: • die Lipid-Raft-Mischung (DOPC, DPPC, cholesterol; molares Verhältnis 1:2:1), die zuvor in der Subphase in Form multilamellarer Vesikel mittels SAXS untersucht worden war, zeigte ebenfalls ihre heterogene Raft-Charakteristik im Lipidmonofilm. • ein noch deutlich komplexeres, anionisches Modellmembran-System bestehend aus 15% DOPC, 10% DOPG, 40% DPPC, 10% DPPG und 25% Cholesterol, das ebenfalls eine starke laterale Heterogenität aufwies (Koexistenz von flüssig-geordneten und ungeordneten Filmbereichen). • Monofilme des stark verkürzten Lipopolysaccharids LPS Re, ein Modellsystem für die äußerste Monoschicht einer Zellmembran von gram-negativen Bakterien, und den Einfluss von sowohl einwertigen (Na+) als auch zweiwertigen (Ca2+) Kationen auf die Struktur und das Verhalten dieser Lipidfilme. • Monofilme aus Archaealipiden (PLFE) als Funktion des Filmdruckes, des Lösungs-pHs, der Temperatur und der Wachstumstemperatur der Lipide, die in allen Fällen eine U-förmige Konfiguration mit beiden Kopfgruppen des Lipids im Kontakt mit der Wassergrenzfläche einnehmen. • eine Mischung des Ionenkanal-Peptides Gramizidin D mit einem Archaealipid-Monofilm, welches keine spezifischen Wechselwirkungen mit dem Lipidmonofilm zeigte. • und zuletzt die Wechselwirkung verschiedener Peptide, welche bekannt sind Amyloid-Fibrillen auszubilden (IAPP und Aß) mit anionischen Lipidmonofilmen, welche diese Form der Peptid- Aggregation unterstützen und beschleunigen. Außerdem wurde die Unterdrückung der Fibrillbildung durch den niedermolekularen Rotweininhaltsstoff Resveratrol untersucht.