Analyse der Regulation von P-TEFb durch Hexim1, 7SK snRNA und Larp7

Abstract

Der Transkriptionsprozess wird in eukaryotischen Zellen streng kontrolliert. Kurz nach der Initiation pausiert die RNA Polymerase II bei etwa 80% aller Gene. Diese Pause ist für die Prozessierung der prä-mRNA notwendig und stellt einen wichtigen Kontrollpunkt für die Genexpression dar. Ein zentraler Faktor, der die Polymerase in die produktive Elongationsphase überführt, ist P-TEFb. P-TEFb besteht aus der Cyclin-abhängigen Kinase Cdk9 und Cyclin T1. Der Komplex phosphoryliert die C-terminale Domäne (CTD) der größten RNA Polymerase II-Untereinheit Rpb1. Die humane CTD besteht aus 52 nahezu exakten Wiederholungen der Sequenz YSPTSPS. Die Phosphorylierung durch P-TEFb erfolgt an der Serin 2-Position. Zudem phosphoryliert P-TEFb die negativen Elongationsfaktoren DSIF und NELF. Durch diese Modifikationen wird das Promoter-proximale Pausieren aufgehoben und die RNA Polymerase II kann in die produktive Elongationsphase übergehen. P-TEFb muss jedoch auch negativ reguliert werden, um eine übermäßige Genexpression zu vermeiden. Hexim1 inhibiert die Kinaseaktivität von P-TEFb im Zusammenspiel mit der kleinen nukleären RNA 7SK über einen bisher unbekannten Mechanismus. 7SK ist wiederum an den RNA stabilisierenden Faktor Larp7 gebunden. Diese 5 Untereinheiten konstituieren das 7SK snRNP mit einem Molekulargewicht von etwa 400 kDa. Zur Aktivierung der Kinase wird P-TEFb von dem Bromodomänen-enthaltenden Protein Brd4 gebunden und zum Transkriptionsstart rekrutiert. Fehlregulationen von P-TEFb sind an der Herzmuskelzellhypertrophie und der Entstehung verschiedener Krebsarten maßgeblich beteiligt. Zudem ist P-TEFb ein Angriffspunkt des Transaktivatorkomplexes Tat/TAR des humanen Immundefizienz-virus 1, wodurch eine Stimulation der Transkription von viraler DNA erreicht wird. In der vorliegenden Arbeit wurde die negative Regulation von P-TEFb durch Hexim1 und 7SK snRNA und die Interaktion von 7SK und Larp7 untersucht. Es konnte eine stabilisierte Mutante der Cyclin-bindenden Domäne von Hexim1 kristallisiert werden. Das Protein bildet eine parallele coiled coil-Struktur mit zwei kleineren vorgelagerten Helices aus, die intensive Kontakte mit den gegenüberliegenden Helices des coiled coils eingehen. Die Interaktionen bestimmen den weiteren Verlauf des N-terminalen Bereichs von Hexim1, welcher für die Inhibition von P-TEFb verantwortlich ist. Zwei minimal inhibierte Komplexe bestehend aus P-TEFb und Hexim1 (194-316/194-359) wurden per Röntgenkleinwinkelstreuung untersucht. Die ab initio Struktur-bestimmung des Größeren der beiden Komplexe ermöglichte die Entwicklung eines Zusammenfassung 114 Modells, welches zur Klärung des Inhibitionsmechanismus durch Hexim1 beitragen könnte. Die 7SK snRNA wird durch Bindung von Larp7 vor Degradation geschützt und stabilisiert. Analytische Gelfiltrationsexperimente ergaben, dass die Zugabe von Heparin zu dem Larp7-7SK-Komplex unspezifische Protein-RNA-Kontakte verhindert und eine stöchiometrisch korrekte Assemblierung ermöglicht. Durch isothermale Titratons-kalorimetrie konnte gezeigt werden, dass die Interaktion zwischen beiden Komponenten mit einer Dissoziationskonstante von 170 nM sehr stark ist. Im Vergleich wurde unspezfische RNA von Larp7 etwa 20-fach schlechter gebunden. Thermale Denaturierungskurven zeigten, dass Larp7 nicht nur die 7SK snRNA stabilisiert sondern dass die Anwesenheit von RNA auch die thermale Stabilität von Larp7 erhöht. Vermutlich agiert die RNA hier als eine Art Chaperon, welches die Faltung von Larp7 begünstigt. Die Struktur von Larp7 wurde mithilfe von Kleinwinkelstreuung ab initio berechnet. Ein Vergleich der Volumenkarte mit einer Strukturvorhersage von Larp7 wies eine große Ähnlichkeit auf. Aufgrund dieser strukturellen Daten konnte man annehmen, dass nicht nur 3 RNA-bindende Domänen in Larp7 vorhanden sind, sondern sich 5 dieser Domänen in dem Protein befinden. Basierend auf diesen Daten wurden neue Proteinkonstrukte entworfen und produziert und auf ihre Interaktion mit der 7SK snRNA hin untersucht. Die Daten legen nahe, dass die spezifische Bindung der 7SK snRNA über Aminosäuren im C-terminalen Bereich des Proteins erfolgt. Eine Kristallstruktur der Larp7-RNA-Komplexe konnte bisher jedoch nicht ermittelt werden. Weiterhin konnte das vollständige 7SK snRNP, bestehend aus Cdk9, C-terminal verkürztem Cyclin T1, Hexim1, 7SK snRNA und Larp7, mit einem Molekulargewicht von über 320 kDa rekombinant assembliert werden. Mit dem Komplex wurden primäre strukturelle Daten durch elektronenmikroskopische Aufnahmen gesammelt. Eine Verbesserung der Rekonstitution wurde durch Optimierung der Reinigungsstrategie und eine Thermofluor-Analyse erreicht. Die Rekonstitution des viral aktivierten Komplexes aus Cyclin T1, HIV-1 Tat und TAR wurde mithilfe von Gelfiltrationsexperimenten durchgeführt. Ein stöchiometrischer, reiner Komplex, der für kristallographische Untersuchungen geeignet war, konnte so assembliert werden. Eine Analyse durch SDS- und Urea-PAGE ergab, dass sowohl ein Fusionskonstrukt aus Cyclin T1 und Tat, als auch die jeweils einzelnen Komponenten einen stabilen Komplex mit der TAR RNA bilden. Die in dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse bieten eine Grundlage für die strukturelle Analyse des 7SK snRNPs, als auch des viral aktivierten P-TEFbs.