Development of site specific labeling strategies for protein modification and synthesis of Rab probes

Abstract

Die Entwicklung von Methoden für die chemische Ligation von synthetischen kleinen Molekülen oder Peptiden, Proteinen ist eine aktuelle Grenze in der chemischen Biologie. Exprimierte Protein-Ligation (EPL) war äußerst nützlich für die Synthese von verschiedenen Proteinen in der Vergangenheit. Insbesondere das Konzept der EPL elegant zeigt den Nutzen der Kombination der Felder der synthetischen organischen Chemie und Molekularbiologie, um komplexe physiologische und biochemische Fragen anzugehen. Die vorliegende Studie an zwei Facetten einzuführen: 1) herzustellen mehrere universale Strategien, um die EPLTechnologie für eine ortsspezifische Proteinmodifikation und Immobilisierung erstrecken; 2) Anpassung der EPL Methodik auf die Halbsynthese Rab Proteine Sonden, die mehrere wichtige Funktionen ausüben während vesikulären Transport in eukaryotischen Zellen. Erstens haben wir eine einfache, effiziente und leichte Strategie für die ortsspezifische Immobilisierung von Proteinen an Oberflächen durch Ligation an Oxyamingruppe Proteinmikroarrays erzeugen. In unserer Strategie die Proteine werden zunächst leicht mit Oxyamingruppe Gruppen am C-Terminus modifiziert und anschließend immobilisiert auf Keton-beschichtete Objektträger. Diese Immobilisierung Strategie effizient verläuft bei neutralen Bedingungen (pH 7,0), und ist besonders mild zur Immobilisierung von Proteinen im Vergleich zu anderen Methoden. Darüber hinaus ermöglicht diese Strategie die direkte Immobilisierung von exprimierten Proteinen aus rohem Zelllysaten ohne vorherige Reinigung. Die produzierten Protein Biochips können für die Untersuchung von Protein-Protein- Wechselwirkungen, wie durch Rab-REP und PKA-Antikörper-Wechselwirkung Studien gezeigt verwendet werden. Unsere Strategie erweitert das Repertoire der Immobilisierung von Proteinen Methoden und bietet eine alternative Möglichkeit, um die verschiedenen Anforderungen für die Immobilisierung von Proteinen erfüllen. Zweitens haben wir das Prinzip der Verwendung von zwei chemoselektive Reaktionen auf ortsspezifisch kennzeichnen ein einzelnes Protein in einer Eintopfreaktion. Wir entwickelten einen allgemeinen, einfache und effiziente Strategie für die N-und C-terminalen zweifarbige Kennzeichnung für das Protein unter Verwendung Rab7 native chemische Ligation und Oxim veranschaulicht. Das Verfahren ist kostengünstig und einfach durchzuführen. Die Reaktionsbedingungen sind biokompatibel und mild genug für die Protein-Modifikationen. Die Strategie hier vorgestellte könnte ein allgemeines Verfahren zur Erzeugung doppelt markierte Proteine, die ebenfalls könnte eine Vielzahl von Anwendungen zum Studium Proteinfunktionen am einzigen Molekül und zellulärer Ebene. Wir haben gezeigt, das das gebildete Protein-Sonde verwendet werden, um Protein-Umfaltung und Protein-ProteinWechselwirkungen durch FRET-Untersuchungen zu untersuchen. Diese Studie führt zu der Erkenntnis, dass sowohl BIP als auch GppNHp kann GTPase helfen, falten, und deshalb darauf, einen Weg zu GppNHp-gebundenen GTPase, wie sie durch erfolgreiche Semisynthese eines RhoA-GG Protein angegeben. Drittens haben wir das Prinzip einer FRET-Strategie für die Überwachung GEF-vermittelten Nukleotid-Austausch mit Website-spezifisch markierten GEF und GTPase-Proteine. Verwendung NCL und Oxim bereiteten wir N-terminalen Cumarin-markierten GEFs und Cterminalen fluoresceinmarkierten GTPasen. Wir konstruierten die Cumarin-GEF:GTPase- Fluorescein-Komplex, der eine signifikante intermolekulare FRET-Effekt zeigte. GTPase Interaktion: das FRET-Signal wurde durch Bindung von GDP oder GTP und erlaubt den direkten Nachweis des GEF gestört. Transient kinetische Studien zur FRET Signaländerung bezogen wurden verwendet, um die Aktivität und GEF Nukleotidbindung überwachen. Die Untersuchungen führten zu einer konsistenten Rückschluss auf die GEF Mechanismus mit allosterischen Wettbewerb zwischen GDP / GTP und GEF die Interaktion mit einer GTPase. Die vorgestellte Strategie könnte hier eine allgemeine Methode, die für andere GEFs und GTPasen ist, und kann eröffnen einen neuen Weg für die Identifizierung von GEF-Inhibitoren und für das Studium GEF-Mechanismen. Viertens stellten wir eine allgemeine Strategie mit Tandem EPL und klicken Chemie ortsspezifisch installiert hydrophoben Gerger Modifikationen in Proteine. Das zweistufige Ligation ist quantitativ, wodurch die Reinigung des Proteins wesentlich ligierten facile. Der Ansatz ergab korrekt gefaltete und funktionelle geranylgeranyliert Rab GTPasen, wie durch ihre Fähigkeit, mit REP sowie interagieren, um die zweite Gruppe in Gerger Prenylierung akzeptieren abgeleitet werden könnten. Die Ligation kann eröffnen einen neuen Weg zur Herstellung von Lipoproteinen, die in verschiedenen biologischen Studien verwendet werden. Schließlich haben wir ein einfaches Verfahren von Oxim Ligierung, um eine Reihe von PEGyliertem Rab-Protein-Sonden für Prenylierung und Lokalisationsstudien produzieren. Der Ersatz von Rab C-terminalen Region mit einer unnatürlichen PEG-Gruppierung nicht stören Rab Prenylierung in vitro und in vivo. Diese Ergebnisse den Mechanismus aufgeklärt Rab Prenylierung, dh es besteht keine Spezifität in Rab C-Terminus hypervariablen Regionen vor und nach dem Motiv für CIM Rab Prenylierung erforderlich. Mit diesen Reihe von Sonden Rab wir weiter untersucht, ob das Problem, dass die C-terminalen hypervariablen Bereich nach Rab Targeting beiträgt. Wir fanden, dass die Membran Targeting-Mechanismen für die Rab-Proteine Familie komplizierter als in früheren schlagen sind. Für Rab1 und Rab5, werden die C-terminalen hypervariablen Regionen nicht an die Membran-Targeting beitragen. Allerdings ist die Ersetzung der C-terminalen Sequenz mit chemischen Linker in mehreren Rab Proteine tatsächlich stören ihrer Membran-Targeting, was bedeutet, dass in diesen Rab- Proteine der C-terminalen hypervariablen Region ist wichtig für biologische Funktion. Diese Arbeit stellt ein Beispiel für chemische Werkzeuge verwendet werden, um einheimische biomolekularen Funktionen anzufechten, was zu einem besseren Verständnis der Rab Prenylierung und Targeting-Mechanismen.

The development of methods for the chemical ligation of synthetic small molecules or peptides to proteins is a current frontier in chemical biology. Expressed protein ligation (EPL)has been extremely useful for the synthesis of various proteins in the past. In particular the concept of EPL elegantly demonstrates the usefulness of combining the fields of synthetic organic chemistry and molecular biology in order to address complex physiological and biochemical questions. The present study aimed at two facets: 1) establish several universal strategies to extend the EPL technology for site-specific protein modification and immobilization; 2) adapt the EPL methodology to the semi-synthesis of Rab proteins probes, which exert many important functions during vesicular transport in eukaryotic cells. Firstly, we developed a facile, efficient and mild strategy for the site-specific immobilization of proteins on surfaces by means of oxyamine ligation to generate protein microarrays. In our strategy the proteins are first readily modified with oxyamine groups at the C-terminus and then immobilized on ketone-coated slides. This immobilization strategy proceeds efficiently at neutral conditions (pH 7.0), and is exceptionally mild for protein immobilization in comparison to other methods. Furthermore, this strategy enables the direct immobilization of expressed proteins from crude cellular lysates without prior purification. The produced protein biochips can be used for the study of protein-protein interactions, as indicated by Rab-REP and PKA-antibody interaction studies. Our strategy expands the repertoire of protein immobilization methods and provides an alternative means to meet the various requirements for protein immobilization. Secondly, we presented the principle of using two chemoselective reactions to sitespecifically label a single protein in a one-pot reaction. We developed a general, facile and efficient strategy for N- and C-terminal dual-color labeling exemplified for the Rab7 protein using native chemical ligation and oxime ligation. The method is low in cost and easy to carry out. The reaction conditions are biocompatible and mild enough for protein modifications. The strategy presented here could be a general method for generating dual-labeled proteins, which could also have a wide range of applications for studying protein functions at the single molecule and cellular level. We have shown the the produced protein probe can be used to study protein refolding and protein-protein interactions by FRET studies. This study leads to the finding that both GDP and GppNHp can help GTPase to refold, and therefore point out a way to produce GppNHp-bound GTPase as indicated by successful semisynthesis of a RhoAGG protein. Thirdly, we presented the principle of a FRET strategy for monitoring EF-mediated nucleotide exchange using site-specifically labeled GEF and GTPase proteins. Using NCL and oxime ligation, we prepared N-terminal coumarin-labeled GEFs and C-terminal fluorescein-labeled GTPases. We constructed the coumarin-GEF:GTPase-fluorescein complex, which showed a significant intermolecular FRET effect. The FRET signal was disrupted by binding of GDP or GTP and allowed direct detection of the GEF:GTPase interaction. Transient kinetic studies based on the FRET signal change were used to monitor the GEF activity and nucleotide binding. The studies led to a consistent conclusion on the GEF mechanism involving allosteric competition between GDP/GTP and GEF’s interaction with a GTPase. The strategy presented here could be a general method that is applicable to other GEFs and GTPases, and may open up a new avenue for the identification of GEF inhibitors and for studying GEF mechanisms. Fourthly, we presented a general strategy using tandem EPL and click chemistry to sitespecifically install hydrophobic GerGer modifications into proteins. The two-step ligation is quantitative, which makes the purification of ligated protein much facile. The approach yielded correctly folded and functional geranylgeranylated Rab GTPases, as could be inferred by their ability to interact with REP as well as to accept the second GerGer group in prenylation. The ligation strategy may open up a new avenue for production of lipoproteins that are used in various biological studies. Finally, we have used a facile method of oxime ligation to produce a series of PEGylated Rab protein probes for prenylation and localization studies. The replacement of Rab Cterminal region with an unnatural PEG moiety did not perturb Rab prenylation in vitro and in vivo. These results further elucidated the mechanism of Rab prenylation, i.e. there is no specificity required in Rab C-terminus hypervariable regions before and after the CIM motif for Rab prenylation. Using this series of Rab probes, we further investigated the issue that whether the C-terminal hypervariable region contributes to Rab targeting. We found that the membrane targeting mechanisms for Rab-family proteins are more complex then previous propose. For Rab1 and Rab5, the C-terminal hypervariable regions do not contribute to the membrane targeting. However, the replacement of C-terminal sequence with chemical linkers in several Rab proteins indeed disrupt their membrane targeting, implying that in these Rab proteins the C-terminal hypervariable region is important for biological function. This work provides an example of chemical tools can be used to challenge native biomolecular functions, leading to better understanding the Rab prenylation and targeting mechanisms.