Bedeutung der Vitrifikation für die Kryokonservierung und Kryofixierung

Abstract

Vitrifikation nennt man den Vorgang, bei dem Wasser beim sehr schnellen Abkühlen in eine amorphe Phase mit einer sehr hohen Viskosität übergeht unter Umgehung der kristallinen Phase. Dieses vitrifizierte Wasser verhält sich wie ein Feststoff. In der Biologie gibt es zwei Methoden bei denen dieser Vorgang angewandt wird. Einerseits die Kryofixierung als Präparation für die Elektronenmikroskopie und andererseits die Kryokonservierung lebender Zellen und Gewebes. Beide Methoden erfordern das Arretieren physiologischer und molekularer Vorgänge. Dies wird durch tiefkalte Temperaturen erreicht. Wasser, als Grundbestandteil biologischer Materie, gefriert bei diesen Temperaturen normalerweise zu kristallinem Eis. Bei der Kryofixierung würden die Eiskristalle die zu untersuchende Struktur artifiziell verändern und bei der Kryokonservierung geht man davon aus, dass intrazelluläres Eis letal ist. Während für die Kryofixierung hauptsächlich der Abkühlvorgang optimiert worden ist, wurde für die Kryokonservierung die Zusammensetzung des Mediums durch Kryoprotektiva verändert, um eine Reversibilität des Arrests zu erreichen. In dieser Arbeit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass Methoden der Kryofixierung, nach signifikanten Anpassungen der Protokolle, auch für die Kryokonservierung verwendet werden können. Eine der getesteten Methoden, das self-pressurized rapid freezing, führte dabei zu ebenso hohen Überlebensraten wie das beste getestete, etablierte Kryokonservierungsprotokoll und es hat gegenüber diesem den Vorteil, dass es trotz größerer Probe deutlich platzsparender arbeitet und sowohl die Probe als auch die Außenwelt durch die geschlossene Bauweise vor Kontaminationen geschützt ist. Außerdem konnte mit Hilfe kryoelektronenmikroskopischer Untersuchungen gezeigt werden, dass Vitrifikation weder notwendig noch ausreichend für das Überleben von Zellen ist. Aufgrund der hierbei erzielten hohen räumlichen Auflösung, konnte eindeutig nachgewiesen werden, dass Eiskristallbildung sowohl intra- als auch extrazellulär toleriert werden kann, wenn entsprechende Kryoprotektiva verwendet werden. Dies widerlegt die bisherige Annahme, dass intrazelluläre Eiskristalle immer letal sind. Des Weiteren wird hierdurch nahegelegt, dass ein zusätzlich aktiver Mechanismus zur Kryoprotektion bestehen muss, als bloße Verhinderung der Eiskristallbildung. Die Ergebnisse zeigen jedoch auch, dass Eiskristallwachstum für optimale Überlebensraten begrenzt werden muss. Überraschend war, dass Vitrifikation in sogenannten Vitrifikations-protokollen für die Kryokonservierung nicht notwendigerweise stattfindet, wodurch jedoch Vitrifikation als Konzept für die Kryokonservierung nicht ausgeschlossen ist. Zudem konnte anhand geschrumpfter, adhärenter Zellen gezeigt werden, dass Kryokonservierung ohne intrazelluläre Kryoprotektiva generell möglich ist. Daraus lässt sich schließen, dass es theoretisch möglich sein müsste, auch voll hydrierte Zellen reversibel zu kryofixieren, wenn entsprechend hohe Abkühl- und Aufwärmraten erzielt werden könnten, um diese komplett zu vitrifizieren.