Identifizierung neuer PDE6D-Bindungspartner und Entwicklung eines phänotypischen Screens zur Identifizierung biologisch aktiver Indolochinolizine

Abstract

Die Protein-Prenylierung ist eine posttranslationale Modifikation, die die Affinität von Proteinen gegenüber biologischen Membranen erhöht und Protein-Protein-Interaktionen (PPI) vermitteln kann. Das molekulare Chaperon PDE6D (Retinal rod rhodopsin-sensitive cGMP 3',5'-cyclic phosphodiesterase subunit delta) ist sowohl für die korrekte Membranlokalisation prenylierter kleiner GTPasen als auch für deren Solubilisierung im wässrigen Milieu des Zytosols verantwortlich. Für das farnesylierte Protoonkogen KRAS konnte ein PDE6D-abhängiger Transport an die Plasmamembran gezeigt werden. Die spezifische Inhibition dieser Interaktion mittels niedermolekularer Verbindungen führt zur Relokalisation von KRAS an das Endomembransystem, einhergehend mit einer verringerten Aktivierung des MAPK/ERK-Signalwegs und einer Wachstumsinhibition von KRAS-abhängigen Pankreastumorzellen. Aufgrund des Missverhältnisses zwischen der Größe des humanen Prenyloms (ca. 100 – 500 Proteine) und der Anzahl bekannter PDE6D-Bindungspartner wurde innerhalb dieser Arbeit eine affinitätschromatographische Strategie mit anschließender massenspektrometrischer Analyse entwickelt, mit deren Hilfe neue, bisher unbekannte prenylabhängige Bindungspartner PDE6Ds identifiziert werden konnten. Als neue Interaktoren konnten die RHO-GTPase CDC42, die kleine GTPase RAB23 sowie die Phosphodiesterase CNP nachgewiesen werden. Die Wechselwirkung mit allen drei Proteinen konnte durch Verwendung der PDE6D-Inhibitoren Deltarasin und Deltazinone 1 gestört und die Auswirkungen auf die subzelluläre Lokalisation der Proteine in Zellen untersucht werden. Weiterhin konnte als neuer Interaktor PDE6Ds die permanent farnesylierte Lamin A-Mutante Progerin identifiziert werden. Die seltene genetische Störung Hutchinson-Gilford Progeria Syndrom (HGPS) wird in ca. 90% der Fälle durch eine heterozygote de novo Mutation hervorgerufen, die in der Folge zur Expression des dominant negativen Genprodukts Progerin führt. Ursächlich für den durch die Progerinexpression hervorgerufenen Phänotyp ist die im Unterschied zum Wildtyp-Protein permanente Farnesylierung, die Auswirkungen auf die Morphologie und Integrität des Zellkerns hat. Durch die Untersuchung von Prenylierungsmutanten konnte die prenylabhängige Interaktion zwischen Progerin und PDE6D sowohl in Zelllysat als auch – mittels PLA-Technologie (proximity ligation assay) – in Zellen nachgewiesen werden. Weiterhin konnte die Progerin-PDE6D-Interaktion durch Deltarasin und Deltazinone 1 inhibiert werden. Neben den Auswirkungen einer Störung dieser Interaktion mittels niedermolekularer Verbindungen wird in der vorliegenden Arbeit auch die Bindungsspezifität PDE6Ds gegenüber prenylierten Cargoproteinen unter Berücksichtigung der hier erhaltenen Ergebnisse diskutiert. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Identifikation biologisch aktiver Naturstoffderivate, die humane Zellen während der Zellteilung arretieren. Die Akkumulation von Mutationen in Krebszellen führt zu unplanmäßigen Teilungsvorgängen und genomischer Instabilität. Diverse therapeutische Strategien zur Adressierung des Zellzyklus in Krebszellen wurden bereits untersucht. Viele dieser Strategien konnten jedoch nicht den gewünschten therapeutischen Erfolg einhergehend mit geringen zytotoxischen Effekten auf gesunde Zellen erreichen. Die Wirkungsweise der meisten Zellzyklus-adressierenden Substanzen beruht dabei auf der Aktivierung des Spindelkontrollpunkts (SAC, spindle assembly checkpoint). Die chronische Aktivierung des Kontrollpunkts und die damit einhergehende Arretierung der Zelle in der Metaphase durch chemische Agenzien bestimmt dabei zwei mögliche Schicksale für die Zelle; Entweder die Zelle teilt sich trotz aktiviertem Kontrollpunkt in Tochterzellen in einem Vorgang, der als „mitotic slippage“ bezeichnet wird und eventuelle Aneuploidien zur Folge haben kann, oder die Zelle stirbt einen apoptotischen Zelltod während der Mitose. Innerhalb der Abteilung „Chemische Biologie“ (MPI Dortmund) wurde mithilfe eines vorwärts gerichteten chemisch-genetischen Ansatzes das biologisch aktive Indolochinolizin Centrocountin-1 entwickelt, das über Interaktion mit den Zielproteinen Nucleophosmin (NPM) und Exportin-1 (CRM1) zu einer Aktivierung des Spindelkontrollpunkts und einem vermehrten apoptotischen Zelltod führt. In dieser Arbeit konnte ein zellbasierter phänotypischer Screen entwickelt werden, der zur Identifizierung neuer aktiver Centrocountin—1-Derivate verwendet wurde. Mittels automatischer Mikroskopie und anschließender Quantifizierung der gewonnenen Bilddaten konnte aus einer kleinen Bibliothek an Centrocountin-Derivaten das Pyridoisochinolizin a528 als potenteste Substanz identifiziert werden. Folgeversuche zeigten eine zweifache Erhöhung des mitotischen Index im Vergleich zu Centrocountin-1 und stärkere Auswirkungen auf die Proliferation von HeLa-Zellen als die Ursprungssubstanz. Des Weiteren wurde im Rahmen dieser Arbeit der Wirkmechanismus der Centrocountine weiter erörtert. Aufgrund der diversen Funktionen von NPM hinsichtlich Chaperonaktivität, DNA-Reparatur, Ribosomenbiogenese und Zentrosomen-Integrität ergeben sich verschiedene Möglichkeiten eines Einflusses von Centrocountin-1. In diesem Zusammenhang konnte neben einem Einfluss von Centrocountin-1 auf die Oligomerisierung von NPM auch die aus RNAi-Studien bekannte Häufung von DNA-Schäden in NPM-defizienten Zellen ausgeschlossen werden. Störungen des CRM1-abhängigen Transports von FOXO3 bestätigen vorherige Ergebnisse zu einem Einfluss von Centrocountin-1 auf den Kernexportfaktor CRM1. In dieser Arbeit werden die gewonnenen Ergebnisse in Hinblick auf den potentiellen Wirkmechanismus der Centrocountine diskutiert.