Biophysikalische Studien zum Einfluss zytomimetischer Medien auf das Konformationsgleichgewicht ausgewählter Biomoleküle

Abstract

Die Kinetik und Energetik chemischer Reaktionen hängt neben dem Druck und der Temperatur auch von den Eigenschaften des Lösungsmittels (z. B. Polarität, Azidität, Protizität) ab. In lebenden Zellen dient das Zytosol als Reaktionsmedium für biochemische Prozesse. Dieses besteht aus in Wasser gelösten Molekülen, wie z. B. anorganische Salzen, organische Osmolyten und Bio-Makromolekülen. Anders als in der konventionellen Chemie befinden sich also die Reaktanden bei intrazellulären Reaktionen nicht in einer verdünnten Lösung, sondern sind von einer hohen Konzentration von Molekülen umgeben, die selbst nicht an der Reaktion teilnehmen. Diese sog. Background-Moleküle (engl. Hintergrund) können die Dynamik und Konformation von Bio-Makromolekülen und somit auch die Kinetik und Energetik biochemischer Prozesse beeinflussen. In der vorliegenden Arbeit wird der Einfluss von Background-Molekülen dreier Substanzklassen auf die Konformationsdynamik von Biomolekülen untersucht: anorganische Salze, organische Osmolyte und Makromoleküle. Mithilfe der Druckperturbationskalorimetrie wird der Effekt verschiedener organischer Osmolyte auf die volumetrischen Eigenschaften des Modellproteins Ribonuklease A untersucht. Die Interpretation des Verlaufs der temperaturabhängigen Expansibilität hinsichtlich der Beiträge der thermischen Expansibilität und der Expansibilität der Hydrathülle des Proteins liefert Erkenntnisse über mögliche Stabilisierungsmechanismen der Osmolyte. Es wird gezeigt, dass die Anwesenheit der Osmolyte vor allem die Expansibilität des gefalteten Proteins beeinflusst. Dieses ist im Wesentlichen auf Änderungen der Mobilität der Oberflächengruppen des Proteins zurückzuführen. Es wird daher ein entropischer Stabilisierungsmechanismus angenommen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Anreicherung bestimmter Osmolyte im Zytosol eine Strategie zur Kompensierung von schädlichen Konformationsänderungen durch äußere Stressfaktoren darstellen könnte. In einer Einzelmolekül-FRET-Studie wird der Effekt unterschiedlicher Lösungszusammensetzungen auf das Konformationsgleichgewicht der microROSE-RNA-Haarnadel untersucht. Durch Variation der Kaliumchloridkonzentration wird gezeigt, dass sowohl ein unvollständiger Ausgleich der negativen Ladungen der Phosphatgruppen des RNA-Rückgrats, als auch ein starker Anstieg der Konzentration von Chloridionen in der Umgebung der Nukleinsäure die native, gefaltete Konformation destabilisieren. Die organischen Osmolyte Glyzin und Trimethylamin-N-Oxid wirken dem denaturierenden Effekt erhöhter Temperaturen entgegen, obwohl sie bei Raumtemperatur die gefaltete Konformation schwächen. Des Weiteren wird anhand des Crowdingreagenz Ficoll der Einfluss des Ausschlussvolumens durch Makromoleküle auf die Konformationen der RNA-Haarnadel untersucht. Entgegen der Erwartung wird ein destabilisierender Effekt beobachtet. Durch vergleichende Messungen mit dem Ficoll-Monomer Saccharose wird gezeigt, dass die Oberflächengruppen des Polymers enthalpisch günstige Wechselwirkungen mit den Nukleobasen eingehen, wodurch die gefaltete Konformation der RNA-Haarnadel destabilisiert wird. Dieser Effekt überwiegt den Ausschlussvolumeneffekt. Eine weitere Besonderheit des zellulären Mediums ist die Bildung intrazellulärer fluider, nicht-lipidhaltiger Kompartimente, welche begrenzte Reaktionsvolumina mit individuellen physikochemischen Eigenschaften darstellen können. Anhand eines Modellsystems aus Polyethylenglycol, Dextran und Wasser werden zum ersten Mal Einzelmolekül-FRETMessungen in einem wässrigen Zweiphasensystem durchgeführt. Es wird nachgewiesen, dass eine DNA-Haarnadel vollständig in die gebildeten dextranreichen Tröpfchen partitioniert. Der starke Ausschlussvolumeneffekt des Makromoleküls Dextran innerhalb der Tröpfchen stabilisiert die gefaltete Konformation der DNA-Haarnadel bei hohen Drücken von bis zu 1:5 kbar. Es wird daher vermutet, dass die Phasenseparation in Kombination mit einem starken Ausschlussvolumeneffekt in lebenden Zellen eine Strategie zur Erhaltung Konformation und daher der Funktion von Biomolekülen unter dem Einfluss hoher hydrostatischer Drücke sein könnte.