Entwicklung eines mikrofluidischen Systems zur kontinuierlichen elektrophoretischen Auftrennung und Analyse von Enzymreaktionen

Abstract

This thesis describes the results of a research project as part of the Leibniz Research Cluster (LRC). The aim of this thesis was the development of a microfluidic free-flow electrophoresis (μFFE) separation unit for the integration into a microfluidic multistage reactor. The research of the LRC project was driven by the vision of a continuous, cell-free and enzyme-catalysed synthesis of polyketide building blocks for the development of bioactive substances. The role of the μFFE chips developed in this work was to continuously separate mixtures of substances into their single components. In the course of this work two different microfluidic FFE chips were developed: one based on poly(dimethylsiloxan) (PDMS) and another one based on poly(methyl metacrylate) (PMMA). The initially manufactured PDMS chips were soon replaced by PMMA chips, which allowed for more reproducible separations and long-term stable usage. With the functional FFE chips, methods for the separation of the substances being part of the enzymatic reactions were developed and optimised. With ammonium acetate in particular concentrations a background electrolyte was found, which enabled a good separation with μFFE and at the same time was compatible with electrospray ionisation mass spectrometry (ESI-MS), the conceived tool for control analytics. After initially analysing samples from the FFE chip with capillary electrophoresis, the focus was put on online analysis via ESI-MS. The coupling of μFFE with MS using a switching valve made an online monitoring of the FFE separation at multiple μFFE outlets possible. With the development of a novel ESI-multi-emitter, the speed of analysis and the number of analysed μFFE outlets were further increased. Overall, the initially defined goals of this project were reached largely. However, for the seamless integration of the developed μFFE system into the conceived multistage reactor, further optimisation and specific adaption to the other involved systems would be necessary.

Diese Arbeit beschreibt die Ergebnisse eines Forschungsprojekts im Rahmen des Leibniz Research Clusters (LRC). Dabei sollte eine mikrofluidischen Trenneinheit nach dem Prinzip der Free-Flow-Elektrophorese (FFE) für die Integration in einen Mehrstufenreaktor entwickelt werden. Die Forschung des LRC-Projekts war angetrieben durch die Vision der kontinuierlichen, zellfreien und enzymkatalysierten Synthese von Polyketidbausteinen für die Entwicklung neuer Wirkstoffe. Das in dieser Arbeit entwickelte mikrofluidische FFE-System (μFFE) sollte als Komponente eines Mehrstufenreaktors in der Lage sein, Stoffgemische kontinuierlich in ihre Einzelsubstanzen aufzutrennen. Im Laufe der Arbeit wurden zwei verschiedene mikrofluidische FFE-Chips entwickelt: einmal auf Basis von Polydimethylsiloxan (PDMS) und zum anderen auf Basis von Polymethylmethacrylat (PMMA). Die zunächst hergestellten PDMS-Chips wurden bald durch Chips auf PMMA-Basis abgelöst, die durch gute mechanische Eigenschaften, reproduzierbare Trennergebnisse und langzeitstabile Anwendbarkeit überzeugten. Mit den funktionellen FFE-Chips wurden über den Zeitraum der Arbeit sukzessive Methoden zur Trennung der Substanzen, die an den enzymatischen Reaktionen beteiligt waren, entwickelt und optimiert. Mit Ammoniumacetat in bestimmten Konzentrationen konnte ein Hintergrundelektrolyt gefunden werden, der eine gute Trennung mit μFFE ermöglichte und gleichzeitig kompatibel mit der als Kontrollanalytik geplanten Elektrosprayionisierungs-Massenspektrometrie (ESI-MS) war. Nach einigen Versuchen der Offline-Analyse der Proben aus dem FFE-Chip mittels Kapillarelektrophorese erfolgte die Analytik überwiegend online mit ESI-MS. Die Kopplung des FFE-Chips mit MS unter Verwendung eines Schaltventils ermöglichte das Online- Monitoring der FFE-Trennung an bis zu 10 FFE-Ausgängen. Die Analysegeschwindigkeit mit MS und die Anzahl der untersuchten FFE-Ausgänge konnten mit einem neuartigen ESI-Multiemitter nochmals gesteigert werden. Insgesamt konnten die eingangs definierten Ziele dieser Arbeit weitestgehend erreicht werden. Für die nahtlose Integration des entwickelten mikrofluidischen FFE-Systems in den erdachten Mehrstufenreaktor bedürfte es jedoch weiterer Optimierung und spezifische Anpassungen an die anderen beteiligten Systeme.