Investigation and genetic engineering of heterologous hosts for the production of cyanobacterial compounds

Abstract

Cyanobakterien sind eine wertvolle Ressource für die Entdeckung neuer, bioaktiver Sekundärmetabolite. Insbesondere im letzten Jahrzehnt wurde durch die rasante Entwicklung verbesserter Genomsequenzierungstechniken und bioinformatischer Analyse-Tools nicht nur ihre genetische Beschaffenheit, sondern auch ihr enormes Biosynthesepotential weiter erschlossen. Industriell bleiben diese wertvollen Ressourcen jedoch meist ungenutzt, was auf Kultivierungsschwierigkeiten, eingeschränkte Biosynthesekapazitäten sowie gentechnische Unzugänglichkeit der nativen Produzenten zurückzuführen ist. Biotechnologische Lösungskonzepte, wie die Anwendung heterologer Produktionssysteme eröffnen eine Möglichkeit zur industriellen Erschließung dieses Biosynthesepotentials. Die in dieser Arbeit durchgeführte Genomsequenzierung ermöglichte faszinierende Einblicke in die genomische Struktur und das Biosynthesepotential des bisher unsequenzierten Cryptophycinproduzenten Nostoc sp. ATCC 53789. So ergab sich das Bild eines 8,7-Mb großen Genoms mit 13 Replikons, dessen Biosynthesepotential typische cyanobakterielle Charakteristika mit überwiegend peptidischen Sekundärmetaboliten aufwies. Die Mehrheit der Biosynthesegencluster (BGCs) entfiel auf das Chromosom. Insgesamt 17% der BGCs, darunter auch der Cryptophycin-Locus, erwiesen sich als Plasmid-assoziiert. Zur Erschließung des cyanobakteriellen Biosynthesepotentials wurden unterschiedliche heterologe Wirtsorganismen, aber auch alternative, zellfreie Produktionssysteme untersucht, wobei sich letztere aufgrund unterschiedlicher Substratpräferenzen als ineffektiv erwiesen. Hingegen konnten die entwickelten in vivo Systeme, hier S. cerevisiae und E. coli, erfolgreich für die Rekonstitution und Genexpression kleiner Biosynthesegene und multimodularer Assemblierungslinien, wie Scytonemin und Cryptophycin, getestet werden. Diesbezüglich dokumentierte die effektive Rekonstruktion des Cryptophycin-Clusters erstmals die Genexpression einer bakteriellen, multimodularen NRPS-PKS-Assemblierungslinie in S. cerevisiae. Als zentrale Herausforderung gestaltete sich im Allgemeinen die Expression großer Biosntheseproteine in den heterologen Wirten sowie die Konstruktion eines eukaryotischen Plattformorganismus zur Expression großer bakterieller Gen-Cluster. Die Installation von Löslichkeits-Tags zur Vermeidung dysfunktionaler Proteinaggregate sowie die Etablierung eines vielseitig einsetzbaren Bakterien-Hefe-Klonierungssystems bildeten dabei erfolgreiche Lösungskonzepte. Die Metabolitenproduktion in den bisher nicht optimierten Chassisorganismen wurde anschließend analysiert, wobei eine hohe Zusatzbelastung des Zellstoffwechsels, eine geringe Präkursorenverfügbarkeit, die abweichende Codonverwendung und konkurrierende Stoffwechselwege als zentrale Engpässe identifiziert wurden.

Cyanobacteria are a prolific resource for the discovery of valuable bioactive compounds. Also, within the last decade, the fast development of genome sequencing techniques and bioinformatics tools, significantly expanded the knowledge on their genomic and biosynthetic constitution. Yet, these resources remain industrially unexploited, due to cultivation difficulties, biosynthetic constraints and molecular genetic intractability of the native producers. Applying heterologous production systems is a viable biotechnological concept to access this potential on an industrial scale. The herein conducted de-novo sequencing of the cryptophycin producer Nostoc sp. ATCC 53789 provided intriguing insights into its genomic and biosynthetic constitution with an 8.7-Mb genome, comprising 13 replicons and exhibiting a typical cyanobacterial secondary metabolome. It predominantly comprises peptide-associated biosynthetic gene clusters (BGCs), residing on the chromosome. Yet, 17% of the BGCs are plasmid-born, including the cryptophycin locus. In the course of this dissertation, the biosynthetic potential of cyanobacteria was examined, developing heterologous hosts and alternative cell-free production systems, whereby the latter turned out ineffective due to restricted substrate preferences. However, the devised in vivo chassis, i.e. S. cerevisiae and E. coli, were successfully tested for the reconstruction of small BGCs and multimodular assembly lines (i.e. scytonemin and cryptophycin). Notably, the successful establishment of the cryptophycin BGC represent the first documentation on the efficacious reconstruction and expression of a large bacterial, multimodular NRPS-PKS assembly line in yeast. In general, the reconstitution of large proteins and the construction of a eukaryotic chassis expressing large bacterial BGCs were central challenges in the chosen hosts. They were successfully addressed by the installation of solubility tags, avoiding inclusion-body formation and the establishment of a versatile bacteria-yeast cloning system. The encountered difficulties of final metabolite production in the non-engineered hosts were subsequently analyzed, identifying an increased metabolic burden, precursor limitations, codon usage and pathway competition as main drawbacks to devise a productive chassis.