Biochemische und strukturbiologische Charakterisierung der Rezeptortyrosinkinasen KIT und PDGFRA

Abstract

Die Rezeptortyrosinkinasen KIT und PDGFRA spielen eine essenzielle Rolle in einer Vielzahl von Signaltransduktionskaskaden, welche grundlegende Zellprozesse wie Proliferation und das Überleben der Zelle regulieren. Diese Signalwege werden von Liganden, die an die extrazelluläre Domäne binden, gesteuert, welche wiederum eine Rezeptor-Dimerisierung und intrazelluläre Aktivierung der katalytisch aktiven Kinasedomäne zur Folge haben. KIT und PDGFRA wurden in ~80 % bzw. in ~15 % der auftretenden Fälle von gastrointestinalen Stromatumoren (GIST) als treibende Onkogene identifiziert, wobei Primärmutationen innerhalb der Rezeptoren eine Abhängigkeit von der entsprechenden Kinase und den nachgeschalteten Signalwegen induzieren. Die auftretenden Mutationen weisen zudem meist einen Liganden-unabhängigen Aktivierungsmechanismus auf, sodass die Kinasedomänen konstitutiv aktiviert vorliegen. GIST sind weitestgehend Chemotherapie- und Strahlentherapie-resistent und stellen deshalb seit Jahrzehnten eine schwer zu behandelnde Krebserkrankung mit schlechter Prognose für die Patienten dar. Seit Anfang der 2000er Jahre wird neben der Chemo- oder Strahlentherapie auch vermehrt die Präzisionsonkologie zur Behandlung von Krebserkrankungen angewendet. Durch die Identifizierung der treibenden Onkogene konnten speziell gegen das jeweilige Onkogen gerichtete Wirkstoffe entwickelt werden. Das Paradebeispiel hierfür stellt Imatinib dar, welches zur Inhibition der Fusionskinase BCR-ABL und somit für die Behandlung chronisch myeloischer Leukämie (CML, engl.: chronic myeloid leukemia) entwickelt wurde. In den darauffolgenden Jahren konnte ebenfalls eine Wirkung von Imatinib bei der Behandlung von GIST nachgewiesen werden. Dieses repurposing von bereits für andere Indikationen zugelassenen Wirkstoffen wurde für die Behandlung von GIST eine immer wichtigere Therapiestrategie, da bis zum Jahre 2020 kein Wirkstoff für die selektive Inhibition von KIT und PDGFRA entwickelt und zugelassen worden war. Eine große Problematik stellen unter anderem auftretende Resistenzmutationen dar, die zur Unwirksamkeit der Inhibitoren beim Patienten führen und somit ein Fortschreiten der Krankheit hervorrufen. Vor dem Hintergrund der klinischen Herausforderungen im Umgang mit GIST, insbesondere aufgrund der Entstehung von Resistenzmutationen gegenüber den zugelassenen Inhibitoren, richtet sich der Fokus dieser Arbeit auf die Evaluierung von niedermolekularen Liganden der relevanten Onkogene KIT und PDGFRA in biochemischen, biophysikalischen und strukturbiologischen Systemen. Hierfür wurden fokussierte Substanzbibliotheken, welche auf unterschiedlichen Grundgerüsten basieren, hinsichtlich ihrer inhibitorischen Potenz gegenüber den Zielproteinen KIT und PDGFRA profiliert und Struktur-Aktivitäts-Beziehungen abgeleitet. Als große Herausforderung stellte sich die Etablierung von Expressions-, Reinigungs- und Kristallisationssystemen für klinisch relevante Mutationen heraus, wobei sich bereits die Expression der Zielproteine als problematisch erwies. Deshalb wurden zusätzlich zu den bereits vorhandenen Konstrukten 19 weitere Genkonstrukte generiert, welche in der Zukunft die erfolgreiche Etablierung der genannten Systeme ermöglichen könnten. Der Großteil der hier generierten Konstrukte befindet sich zum aktuellen Zeitpunkt in einem vorläufigen Stadium und ist Gegenteil aktueller Arbeiten in der Arbeitsgruppe. Weiter wurden die Wildtyp-Proteine und die Türsteher-mutierten Varianten von KIT und PDGFRA erfolgreich heterolog in Bakterien- bzw. Insektenzellen exprimiert und säulenchromatographisch gereinigt. Die Identifizierung eines Cysteins in der backpocket und eines Cysteins in der ATP-Bindetasche der Kinasedomänen führte zur Etablierung einer fokussierten Bibliothek warhead-tragender Inhibitoren. Die gereinigten Proteine konnten somit für die Untersuchung der kovalent-modifizierenden Eigenschaften dieser Liganden in massenspektrometrischen Vermessungen verwendet, sowie für strukturbiologische Untersuchungen mittels Röntgenkristallographie eingesetzt werden. Hierdurch konnten Substanzen identifiziert werden, die nachweislich irreversibel an die Zielproteine KIT-wt und PDGFRA-T674I binden, und somit ein neuartiges Adressierungskonzept der Kinasen etabliert und validiert werden. Durch strukturelle Vergleiche der verschiedenen Inhibitortypen gebunden an ihre Zielproteine konnten Schlussfolgerungen für weitere Struktur-basierte Designstrategien neuer Inhibitoren erarbeitet werden. Initiale strukturbiologische Untersuchungen halfen, unterschiedliche Kinasekonformationen zu identifizieren und zugrundeliegende Aktivierungsmechanismen zu verstehen. Darüber hinaus wurde für den erst 2020 zugelassenen Wirkstoff Avapritinib (Ayvakit®) der detaillierte Bindungsmodus in KIT-wt, KIT-T670I und PDGFRA-T674I aufgeklärt und eine neue Subtasche in den Kinasen identifiziert, welche essenziell für die potente Bindung des Liganden ist. Insgesamt sind 43 Kristallstrukturen entstanden, wovon 32 Strukturen zum aktuellen Zeitpunkt finalisiert wurden. Von diesen finalen Strukturen wurden bereits 21 in der Protein Data Bank (PDB) veröffentlicht bzw. deponiert. Weitere 11 der insgesamt 43 Kristallstrukturen sind Gegenstand aktueller Analysen auf Geheimhaltungsbasis und werden deshalb im Rahmen dieser Arbeit nicht diskutiert. In Kombination mit den erhaltenen Struktur-Aktivitäts-Beziehungen legten die Kristallstrukturen einen Grundstein für das Design optimierter Liganden zur Adressierung von KIT und PDGFRA im Kontext von GIST. Zusammen mit der Aufklärung von auftretenden Resistenzmutationen können entscheidende Informationen für die Weiterentwicklung von Therapieansätzen erhalten werden. Die im Rahmen dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse ermöglichen also ein tieferes Verständnis der molekularen Grundlagen von GIST.

The receptor tyrosine kinases KIT and PDGFRA play essential roles in a variety of signal transduction cascades that regulate fundamental cellular processes such as proliferation and cell survival. These signaling pathways are controlled by ligands that bind to the extracellular domain, resulting in receptor dimerization and intracellular activation of the catalytically active kinase domain. KIT and PDGFRA have been identified as driving oncogenes in ~80% and ~15% of gastrointestinal stromal tumor (GIST) cases, respectively, with primary mutations within the receptors inducing dependence on the corresponding kinase and downstream signaling pathways. In addition, the mutations that occur tend to mediate a ligand-independent activation mechanism, resulting in constitutive activation of the kinase domains. GISTs are largely resistant to chemotherapy and radiotherapy and have been a difficult-to-treat cancer with a poor prognosis for patients for decades. Since the early 2000s, precision oncology has increasingly been used to treat cancer alongside chemotherapy and radiotherapy. By identifying the driving oncogenes, it has been possible to develop drugs that specifically target the oncogene of interest. The prime example of this is imatinib, which was developed to inhibit the BCR-ABL fusion kinase for the treatment of chronic myeloid leukemia (CML). In the following years, imatinib was also shown to be effective in the treatment of GIST. This repurposing of agents already approved for other indications became an increasingly important therapeutic strategy for the treatment of GIST, as no agent for the selective inhibition of KIT and PDGFRA had been developed and approved by 2020. A major concern is the emergence of resistance mutations that render inhibitors ineffective in patients, leading to disease progression. Against the background of the clinical challenges in the treatment of GIST, in particular due to the emergence of resistance mutations against the approved inhibitors, the focus of this work is the evaluation of small molecule ligands of the relevant oncogenes KIT and PDGFRA in biochemical, biophysical and structural biological systems. For this purpose, focused compound libraries based on different scaffolds were profiled with respect to their inhibitory potency against the target proteins KIT and PDGFRA and structure-activity relationships were derived. The establishment of expression, purification and crystallization systems for clinically relevant mutations proved to be a major challenge, as the expression of the target proteins already proved to be problematic. Therefore, in addition to the existing constructs, 19 additional gene constructs were generated that may allow the successful establishment of these systems in the future. The majority of these constructs are currently at a preliminary stage and are the subject of the current work in the group. In addition, the wild-type proteins and the gatekeeper-mutated variants of KIT and PDGFRA were successfully heterologously expressed in bacterial and insect cells, respectively, and purified by column chromatography. The identification of a cysteine in the backpocket and a cysteine in the ATP-binding pocket of the kinase domains led to the establishment of a focused library of warhead-bearing inhibitors. The purified proteins were then used to investigate the covalent modifying properties of these ligands by mass spectrometry and structural biology studies using X-ray crystallography. As a result, compounds were identified that were shown to bind irreversibly to the target proteins KIT-wt and PDGFRA-T674I, thereby establishing and validating a novel kinase targeting concept. Structural comparisons of the different inhibitor types bound to their target proteins allowed conclusions to be drawn for further structure-based design strategies for new inhibitors. Initial structural biology studies helped to identify different kinase conformations and to understand the underlying activation mechanisms. In addition, the detailed binding mode of the drug avapritinib (Ayvakit®), which was only approved in 2020, bound to KIT-wt, KIT-T670I and PDGFRA-T674I was elucidated and a new sub-pocket in the kinases essential for potent ligand binding was identified. A total of 43 crystal structures were generated, of which 32 have been finalized to date. Of these final structures, 21 have already been published or deposited in the Protein Data Bank (PDB). A further 11 of the 43 crystal structures are the subject of ongoing analyses on a confidential basis and are therefore not discussed in this thesis. Together with the structure-activity relationships obtained, the crystal structures provided the basis for the design of optimized ligands for targeting KIT and PDGFRA in the context of GIST. Together with the elucidation of resistance mutations, this will again provide crucial information for the further development of therapeutic approaches. Thus, the results presented in this study provide a deeper understanding of the molecular basis of GIST.