Structural investigation of the relaxed cardiac sarcomere by electron cryo-tomography

Abstract

The sarcomere is the basic unit of striated muscles and consists of interdigitating thick and thin filaments. The two types of filaments slide on each other resulting in the shortening of sarcomere itself thereby generating work. The thin filament comprises filamentous actin (F-actin), troponin (Tn), and tropomyosin (Tm). The thick filament is the force bearing part of the sarcomere and it comprises myosin, titin, and myosin-binding protein C (MyBP-C). The vast majority of the mutations responsible for familial hypertrophic cardiomyopathy and other heart and muscle diseases are borne by components of the thick filaments. However, despite its central importance, it remains unclear how thick filaments are structurally organized and how its components interact with each other and with thin filaments to enable highly regulated muscle contraction in the cardiac tissue.

In this thesis, I aimed to elucidate the molecular organization of the thick and thin filaments from left ventricular myofibrils in their relaxed state. I resorted to cryo-focused ion beam milling (cryo-FIB- milling) and cryo-electron tomography (cryo-ET) to investigate the molecular architecture of the native mammalian cardiac sarcomeres.

The reconstruction of the thick filament provides insight into the three-dimensional arrangement of myosin heads and tails, MyBP-C, and titin. This clarification of structural details sheds light on their interplay during muscle contraction. The positioning of myosin heads exhibits variability based on their location along the filament, indicating diverse capabilities in terms of susceptibility to strain and activation. Meanwhile, the arrangement and interactions of myosin tails follow a distinct pattern, potentially governed by the organization of three alpha and three beta titin chains resembling a spring. This hints at specialized functions of thick filament segments in length-dependent activation (LDA) and contraction.

Interestingly, the three titin alpha chains extend throughout the entire length of the thick filament, in contrast to titin beta. The structural analysis further reveals that the C-terminal region of MyBP-C not only binds to myosin tails but also unexpectedly interacts directly with myosin heads. This suggests a hitherto unreported direct involvement in maintaining the myosin OFF state.

Furthermore, we visualize how MyBP-C forms links between thin and thick filaments. This study provides a molecular blueprint of the cardiac sarcomere and paves the way to forthcoming research aiming to explore muscle disorders that involve sarcomeric structural components.

Das Sarkomer ist die Grundeinheit der quergestreiften Muskulatur und besteht aus ineinandergreifenden dicken und dünnen Filamenten. Die Filamente verschieben sich ineinander, was zur Verkürzung des Sarkomers führt und dadurch Kraft erzeugt. Das dünne Filament besteht aus filamentösem Aktin (F-Actin), Troponin (Tn) und Tropomyosin (Tm). Das dicke Filament ist der krafttragende Teil des Sarkomers und besteht aus Myosin, Titin und dem Myosin-bindenden Protein C (MyBP-C). Die überwiegende Mehrheit der Mutationen, die für die familiäre hypertrophe Kardiomyopathie und andere Herz- und Muskelerkrankungen verantwortlich sind, finden sich in Komponenten des dicken Filaments. Trotz ihrer zentralen Bedeutung ist jedoch nach wie vor unklar, wie die dicken Filamente strukturell organisiert sind und wie ihre Komponenten miteinander und mit den dünnen Filamenten interagieren, um eine regulierte Muskelkontraktion im Herzgewebe zu ermöglichen.

In dieser Arbeit habe ich das Ziel verfolgt, die molekulare Organisation der dicken und dünnen Filamente von ventrikulären Myofibrillen im entspannten Zustand aufzuklären. Dazu nutzte ich einen fokussierten Ionenstrahl bei Kryo-Bedingungen, um die Proben vorzubereiten (cryo-FIB-milling) und Kryo-Elektronentomographie (cryo-ET), um die molekulare Architektur der nativen Herzsarkomere von Säugetieren zu betimmen.

Die Rekonstruktion des dicken Filaments zeigt die dreidimensionale Organisation der Myosinköpfe und -schwänze, des MyBP-C und Titins und klärt die strukturelle Grundlage für ihre Interaktion während der Muskelkontraktion auf. Die Anordnung der Myosinköpfe ist je nach ihrer Position entlang des Filaments variabel, was darauf hindeutet, dass sie unterschiedliche Fähigkeiten in Bezug auf Belastungsanfälligkeit und Aktivierung haben. Auch die Myosinschwänze weisen eine unterschiedliche Anordnung und ein unterschiedliches Muster von Interaktionen auf. Diese werden wahrscheinlich von drei alpha- und drei beta-Titinketten orchestriert, die wie eine Feder angeordnet sind. Dies deutet darauf hin, dass unterschiedliche Segmente des dicken Filaments bei der längenabhängigen Aktivierung und Kontraktion eine besondere Rolle spielen.

Überraschenderweise verlaufen die drei alpha-Titinketten über die gesamte Länge des dicken Filaments, die beta-Titinkette jedoch nicht. Die Struktur zeigt auch, dass die C-terminale Region von MyBP-C Myosin-Schwänze bindet und unerwarteterweise auch direkt mit den Myosin-Köpfen interagiert, was auf eine bisher unbeschriebene direkte Rolle bei der Aufrechterhaltung des Myosin- OFF-Zustands hindeutet. Darüber hinaus konnte ich zeigen, wie MyBP-C Verbindungen zwischen dünnen und dicken Filamenten bildet.

Meine Arbeit liefert einen molekularen Bauplan des Herzsarkomers und ebnet den Weg für künftige Forschungsarbeiten zur Erforschung von Muskelerkrankungen, an denen strukturelle Komponenten des Sarkomers beteiligt sind