Chemische Synthese von Proteinen

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wird die chemische Totalsynthese der Ras-Bindungsdomäne von c-Raf1 (RBD) mit verschiedenen Modifikationen und Funktionalisierungen, unter Ausnutzung der nativen chemischen Ligation zweier Peptidsegmente, beschrieben. Dabei wurden zwei fluoreszierende, nicht-codierte Aminosäuren in die RBD eingebaut und Modifikationen für die zielgerichtete Immobilisierung der Proteine eingeführt. Der Einbau der nicht-codierten Aminosäuren N3-Nitrobenzofurazan-L-2,3-diamino-propionsäure (NBD-Dap) oder L-(6,7-Dimethoxy-4-coumaryl)-alanin an Position 91 der RBD erlaubt die Detektion der Wechselwirkung der RBD mit dem Proto-Onkoprotein Ras. Das Fluoreszenzverhalten wurde eingehend untersucht, wobei auch Fluoreszenzlebenszeitmessungen durchgeführt wurden. In Stopped flow Versuchen wurden KD-Werte (zwischen 170 nM und 610 nM) für die Wechselwirkung von Ras und verschiedenen RBD-Proteinen bestimmt. Ein C-terminaler His-Tag wurde benutzt, um die RBD/L91NBD-Dap/His auf einer Ni-NTA-beschichteten Oberfläche zu immobilisieren. Ausgehend davon wurde ein Biosensor entwickelt, der den Nachweis von aktiviertem Ras erlaubt. Die Nachweisgrenze liegt bei einer Konzentration von 300 nM aktiviertem Ras. Des Weiteren wurde eine C-terminal verkürzte Form des Ras-Proteins durch chemische Totalsynthese hergestellt. Dazu wurden drei Peptidsegmente synthetisiert und durch native chemische Ligation miteinander verknüpft. Das Protein wurde in hoher Reinheit erhalten und unter Ausnutzung von GppNHp (ein nicht-hydrolysierbares GTP-Analogon) als Faltungsgerüst, gelang die Faltung in die biologisch aktive Tertiärstruktur. Mit dem Ras-RBD-System ist es zum erstenmal gelungen ein biologisches System aus zwei Proteinen vollständig chemisch zu synthetisieren und volle biologische Funktionsfähigkeit zu erhalten. Weiterhin konnten die RBD und Ras an den C-Termini mit den Farbstoffen Cy5 und Alexa 488 markiert werden. Dazu wurden kurze Peptide synthetisiert, an die die Fluorophore gekoppelt wurden und die zusätzlich einen His-Tag enthielten. Ras und RBD mit C-terminalen Thioestern wurden aus Intein-Fusionsproteinen gewonnen und in dieser Form zur Ligation mit den synthetisierten Peptiden eingesetzt. Die resultierenden fluoreszenzmarkierten Proteine waren für Energietransfermessungen mit Alexa 488 (als Donor) und Cy5 (als Akzeptor) geeignet und erlaubten die Beobachtung der Komplexbildung aus aktiviertem Ras und RBD. Damit wurde ein genereller Weg zur C-terminalen Fluoreszenzmarkierung von Proteinen aufgezeigt. Außerdem wurde die humane Thymidinmonophosphatkinase (TMPK) auf semisynthetischem Weg hergestellt. Dazu wurde der größte Teil des Proteins (TMPK 31-212) in E. coli exprimiert, wobei eine Protease-Schnittstelle vor der AS 31 eingeführt wurde, die es erlaubte ein N-terminales Cys zu generieren, das für die Ligationreaktion mit dem chemisch synthetisierten N-terminalen Peptid (AS 1-30) benötigt wird. Der Einbau des N3-Nitrobenzofurazan-L-2,3-diamino-propionsäure an Position 25, an Stelle eines Lys, bewirkte einen Rückgang der Phosphorylierungsaktivität des Enzyms um den Faktor 4.