Authors: Schlee, Sandra
Title: Kinetische und funktionelle Studien am molekularen Chaperon ClpB aus Thermus thermophilus
Language (ISO): de
Abstract: Das molekulare Chaperon ClpB aus T. thermophilus gehört zu der AAA+-Familie derATPasen, die konservierte Nukleotidbindungsdomänen enthalten und ringförmige Oligomerebilden. Die Aufgabe von ClpB in der Zelle ist es, in funktioneller Kooperation mit demDnaK-System Proteinaggregate aufzulösen und zu reaktivieren.Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle der beiden Nukleotidbindungsdomänen (NBD) von ClpBfür die Chaperonaktivität, Oligomerisierung, Nukleotidbindung und ATPase-Aktivität zucharakterisieren. Wie Gelfiltrationsanalysen zeigen unterliegt ClpB einem dynamischenOligomerisierungsgleichgewicht, welches durch das gebundene Nukleotid und dieIonenstärke beeinflusst wird. Fluoreszenztitrationen mit dem fluoreszierendenNukleotidanalogon mant-ADP belegen, dass die Bindungsaffinität der hochaffinen NBD2stark vom oligomeren Zustand von ClpB abhängig ist. Auch die Analyse der ATPase-Aktivität deutet auf Kooperativität zwischen den beiden NBDs hin. Mit Hilfe von Stopped-Flow-Messungen mit mant-ADP und Fluoreszenzanisotropiemessungen mit AlexamarkiertemClpB wurde ein Bindungsmodell entwickelt, welches die welchselseitigeAbhängigkeit von Oligomerisierung und Nukleotidbindung beschreibt.Studien mit Modellsubstraten Luziferase und a-Glucosidase belegen außerdem, dass ClpBdirekt mit aggregierten Proteinen wechselwirkt. Die Isolation eines spezifischen ClpB-DnaKKomplexesin Ko-Elutionsexperimenten weist darauf hin, dass ClpB und DnaK einenKomplex bilden und in einer konzertierten Aktion auf aggregierte Substratproteine einwirken.
Subject Headings: Chaperone
Kinetik
Fluoreszenz
Nukleotidbindung
Stopped-Flow
URI: http://hdl.handle.net/2003/5562
http://dx.doi.org/10.17877/DE290R-8056
Issue Date: 2003-07-31
Publisher: Universität Dortmund
Appears in Collections:Max-Planck-Institut für molekulare Physiologie

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