Autor(en): | Schlee, Sandra |
Titel: | Kinetische und funktionelle Studien am molekularen Chaperon ClpB aus Thermus thermophilus |
Sprache (ISO): | de |
Zusammenfassung: | Das molekulare Chaperon ClpB aus T. thermophilus gehört zu der AAA+-Familie derATPasen, die konservierte Nukleotidbindungsdomänen enthalten und ringförmige Oligomerebilden. Die Aufgabe von ClpB in der Zelle ist es, in funktioneller Kooperation mit demDnaK-System Proteinaggregate aufzulösen und zu reaktivieren.Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle der beiden Nukleotidbindungsdomänen (NBD) von ClpBfür die Chaperonaktivität, Oligomerisierung, Nukleotidbindung und ATPase-Aktivität zucharakterisieren. Wie Gelfiltrationsanalysen zeigen unterliegt ClpB einem dynamischenOligomerisierungsgleichgewicht, welches durch das gebundene Nukleotid und dieIonenstärke beeinflusst wird. Fluoreszenztitrationen mit dem fluoreszierendenNukleotidanalogon mant-ADP belegen, dass die Bindungsaffinität der hochaffinen NBD2stark vom oligomeren Zustand von ClpB abhängig ist. Auch die Analyse der ATPase-Aktivität deutet auf Kooperativität zwischen den beiden NBDs hin. Mit Hilfe von Stopped-Flow-Messungen mit mant-ADP und Fluoreszenzanisotropiemessungen mit AlexamarkiertemClpB wurde ein Bindungsmodell entwickelt, welches die welchselseitigeAbhängigkeit von Oligomerisierung und Nukleotidbindung beschreibt.Studien mit Modellsubstraten Luziferase und a-Glucosidase belegen außerdem, dass ClpBdirekt mit aggregierten Proteinen wechselwirkt. Die Isolation eines spezifischen ClpB-DnaKKomplexesin Ko-Elutionsexperimenten weist darauf hin, dass ClpB und DnaK einenKomplex bilden und in einer konzertierten Aktion auf aggregierte Substratproteine einwirken. |
Schlagwörter: | Chaperone Kinetik Fluoreszenz Nukleotidbindung Stopped-Flow |
URI: | http://hdl.handle.net/2003/5562 http://dx.doi.org/10.17877/DE290R-8056 |
Erscheinungsdatum: | 2003-07-31 |
Provinienz: | Universität Dortmund |
Enthalten in den Sammlungen: | Max-Planck-Institut für molekulare Physiologie |
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