Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen der Wechselwirkung von Peptiden und Proteinen mit Modellbiomembransystemen
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Date
2004-11-11
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Publisher
Universität Dortmund
Abstract
Die Fluoreszenzmikroskopie hat sich in den letzten Jahren zu einer hervorragenden Methode zur
Beobachtung der lateralen Struktur von Lipiden in Membranen entwickelt. Mit Hilfe von GUV’s
in der Größenordnung von ~ 30 µm lassen sich Phasenseparationen und Domänenbildung in Be-reich
von Mikrometern direkt visualisieren. Der Einfluss verschiedener Zusätze auf die
Membran kann somit untersucht werden.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurde der Einfluss von Gramicidin, Cholesterol und verschiedenen
lipidierten Peptiden auf das Phasenverhalten der Modellbiomembran DMPC/DSPC untersucht.
Der zweite Teil beschäftigt sich mit der Na + , K + -ATPase, insbesondere mit der Druckinaktivie-rung
des Enzyms. Das System DMPC/DSPC/Gramicidin
Durch den Einbau des Gramicidins in die Modellbiomembran DMPC/DSPC wird die Struktur
der temperaturabhängigen Lipidphasen signifikant geändert. Im gel/fluid-Phasenkoexistenzgebiet
werden in GUV’s Domänen in der Größenordnung von Mikrometern
beobachtet, die nach dem Einbau von GD vollständig verschwinden. Es kommt zu einer drasti-schen
Abnahme der Konzentrationsfluktuationen nicht nur im Mikrometerbereich sondern auch
im Nanometerbereich, wie durch SANS-Experimente gezeigt werden konnte. Die Lipidmatrix
hat hier auch einen entscheidenden Einfluss auf die Konformation des eingebauten Peptids.
Durch einen effektiven molekularen Sortiermechanismus kann ein großes „Hydrophobic Mis-match“
in der Lipidmischung DMPC/DSPC vermieden werden. Dies führt zu beträchtlichen
Veränderungen in der Lipidstruktur und in der Konformation des Polypeptids. Das System DMPC/DSPC/Cholesterol
Durch den Einbau von Cholesterol ist es möglich, den Ordnungsparameter der Lipide, die Ket-tenlänge
und die Packungsdichte in den Lipidphasen zu ändern. Der Einbau von 20 mol% Cho-lesterol
in die Modellbiomembran DMPC/DSPC bewirkt die Ausbildung einer fluiden geordne-ten
LO-Phase. Dies führt zur Reduzierung der großen Konzentrationsfluktuationen und damit zur
Verringerung der gel/fluid-Phasenkoexistenz. Cholesterol baut sich bevorzugt in die DMPC-reichen
Regionen der Membran ein. Ab einer Cholesterol-Konzentration > 33 mol% ist ein Pha-senübergang
im Lipidsystem kaum noch detektierbar. Das System DMPC/DSPC/lipidiertes Peptid bzw. Protein
Der Einbau unterschiedlich lipidierter Peptide in die Modellmembran DMPC/DSPC wurde mit
Hilfe der Fluoreszenzspektroskopie und der Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Die hier ver-wendeten
Peptide mit den unterschiedlichen Ankersystemen bauen sich alle bevorzugt in die
fluide DMPC-reiche Phase der Mischung ein, die Art der Lipidmodifizierung spielt in diesem
Fall keine Rolle. Das System DMPC/DSPC/Cholesterol/BL2
Wie schon erwähnt, führt der Einbau von Cholesterol in die DMPC/DSPC-Membran zur Ausbil-dung
einer fluiden geordneten LO-Phase. Diese Lipidphase hat eine große Bedeutung in der aktu-ellen
Diskussion um die „lipid rafts“, denen eine wichtige Rolle bei der lokalen Aufkonzentrie-rung
von Membranproteinen zugeschrieben wird. Der Einbau des Peptids BL2, palmitoyliert und
farnesyliert, in das Lipidsystem DMPC/DSPC/20 mol% Cholesterol bewirkt eine Phasensepara-tion,
bei der es aufgrund der hohen Affinität des Peptids zur Ausbildung einer DMPC-reichen
fluiden Phase kommt. Bei tiefen Temperaturen, d.h. im Bereich der Gelphasen, ist eine effektive
Sortierung nicht mehr möglich und es kommt zur Aggregation der Peptide und damit zur Dimer-bildung
der BODIPY-gelabelten Moleküle. Als Ergebnis kann festgehalten werden, dass Peptide
mit dem hier vorliegenden Motiv der Lipidmodifizierung keine Assoziation mit fluiden geordne-ten
oder gelartigen Domänen in phasenseparierten Lipidmembranen bevorzugen und es somit
wahrscheinlich auch nicht zum Einbau in die „lipid rafts“ natürlicher Systeme kommen dürfte. Die Na + , K + -ATPase
Das Enzym Na + , K + -ATPase ist der Schlüssel für die Gradienten von Na + und K + entlang biolo-gischer
Membranen von eukaryotischen Zellen. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten
Präparationen und Experimente sind die ersten wichtigen Schritte auf dem Weg zur Aufklärung
des Mechanismus der Druckinaktivierung des Enzyms. Eine präparierte Plasmamembran-Fraktion
mit dem angereicherten Enzym diente zum Aufbau eines Systems zur Messung der
ATPase-Aktivität des Enzyms als Funktion des Drucks. Eine reversible Inaktivierung des En-zyms
bis zu einem Druck von 2 kbar konnte ermittelt werden.
Description
Table of contents
Keywords
Cholesterol, Druck, Fluoreszenzmikroskopie, Fluoreszenzspektroskopie, GkV, Gramicidin, K-ATPase, Laurdan, Lipidierte Peptide, Modellbiomembranen, Na